VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - BÁO CÁO KHOA HỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN BẰNG HÓA CHẤT MNNG TĂNG HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢPAXIT CLAVULANIC TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CLAVULIGERUS Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên: TS Tạ Thị Thu Thủy Trần Hồng Hạnh Lớp: 1302-K20 Hà Nội-2017 LỜI CẢM ƠN Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô TS.Tạ Thị Thu Thủy người định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ chúng em trình thực đề tài Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Nguyễn Thị Phương Thảo tồn thể thầy giáo Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử - Khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tìnhgiúp đỡ, tạo điều kiện tốt để chúng em hoàn thành đề tài Qua đây, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, tồn thể bạn Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử động viên giúp đỡ chúng em nhiều trình thực đề tài Trong trình nghiên cứu đề tài, thân có nhiều cố gắng, khơng thể tránh khỏi thiếu sót, hạn chế nên chúng em mong nhận góp ý quý thầy – cô bạn lĩnh vực nghiên cứu Chúng em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng5 năm 2017 Sinh viên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CKS Chất kháng sinh S clavuligerus Streptomyces clavuligerus CLA Axit clavulanic D Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn tính theo milimet Gram (-) Gram dương Gram (+) Gram âm h Giờ LB Luria Bertani TLC Thin Layer Chromatography Amox amoxicillin Amp ampicilin E.coli JM109 Escherichia coli JM109 B.su Bacillus MNNG N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin VSV Vi sinh vật XK Xạ khuẩn MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1-TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh 1.1.2 Khái niệm kháng sinh 1.1.3Phân loại kháng sinh 1.1.4.Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.5 Kháng sinh nhóm β – Lactam 1.2 Đại cương xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 12 1.2.1 Các đặc điểm chung ,cấu trúc xạ khuẩn tự nhiên 12 1.2.2 Xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 13 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh kháng sinh xạ khuẩn 14 1.2.4 Các nghiên cứu nước quốc tế chủng Streptomyces clavuligerus 15 1.3 Axit clavulanic 15 1.4 Các phương pháp đột biến vi sinh vật 18 1.4.1 Mục đích 18 1.4.2 Đột biến tạo tác nhân vật lý 18 1.4.3Đột biến nhân tạo tác nhân hóa học 19 1.5 Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài 19 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1 Các chủng vi sinh vật 22 a Chủng xạ khuẩn 22 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 22 2.1.3 Môi trường nghiên cứu 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 25 2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 27 2.2.3 Phương pháp gây đột biến xạ khuẩn hóa chất MNNG 28 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính axit 30 2.2.5 Xác định tỷ lệ sống sót 30 2.2.6 Sàng lọc sau đột biến 31 2.2.7 Phương pháp tách chiết axit clavulanic thô 31 Nguyên tắc: 31 2.2.8 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) 32 PHẦN 3: KẾT QUẢ 33 3.1 Khả ức chế β-lactamase chủng S clavuligerus tự nhiên 33 3.2 Kết nghiên cứu đột biến hóa chất MNNG 35 3.2.1 Kết nồng độ hóa chất MNNG tạo đột biến 35 3.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian gây đột biến MNNG 36 3.2.3 Phương pháp xác định pH gây đột biến 37 3.3 Kết sàng lọc sau đột biến 38 3.4 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp acid chủng đột biến 39 3.4.1.Ảnh hưởng hàm lượng cacbonhydrat đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh 39 3.4.2.Ảnh hưởng hàm lượng nito đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh 42 3.4.3 Ảnh hưởng hàm lượng K2HPO4 43 3.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 44 3.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 44 3.5.2 Ảnh hưởng pH 45 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 46 3.6 Quy trình tách thu nhận axit quy mơ thí nghiệm 47 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Khả ứng dụng kết nghiên cứu đề tài 48 4.3 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 A TÀI LIỆU TIẾNG ANH 49 B: TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 51 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại cấu trúc số penicillin 10 Bảng 1.2 Hằng số axit kháng sinh nghiên cứu 11 Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng đề tài 23 Bảng 2.2 Thành phần 1000ml ( lít) mơi trường chuẩn gồm: 24 Bảng 2.3 Môi trường LB đặc có thành phần sau: 24 Bảng 2.4 Thành phần 1000 ml (1lít) mơi trường NDYE gồm: 25 Bảng 3.1 Thử nồng độ kháng sinh 33 Bảng 3.2 Khả ức chế β-lactamase CLA 34 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ MNNG đến khả sinh axit chủng xạ khuẩnS clavuligerus 36 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian gây đột 37 Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH đếnsinhaxit chủng xạ khuẩnS.clavuligerus 37 Bảng 3.6 thử hoạt tính axit chủng sau đột biến 38 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nguồn cacbonhydrat đếnkhả sinh trưởng sinh tổng hợp kháng sinh chủng S.clavuligerusđột biến 40 Bảng 3.8 : Ảnh hưởng hàm lượng Glycerol đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 41 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nguồn nito đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus 42 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nguồn nito đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh 43 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum bào tử chúng Hình 1.2 Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo kháng sinh penicillin Hình 1.4 Cơng thức hóa học: 10 Hình 1.5 Cơng thức hóa học ampicilin 11 Hình 1.6 Xạ khuẩn S.clavuligerus đĩa thạch 14 S.clavuligerus soi kính hiền vi 100X 14 Hình 1.7 Công thức phân tử axit clavulanic 16 Hình 1.8 Các chất trung gian trình tổng hợp axit clavulanic 18 Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo MNNG,[36] 28 Hình 3.1 Thử hoạt tính kháng sinh Amox 34 Hình 3.2 Kết thử hoạt tính Amox bổ sung thêm axit clavulanic 35 Hình 3.5 Chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến cấy trang 38 Hình3.6 Đĩa thử hoạt tính AC chủng S.clavuligerus đột biến chủng tự nhiên 39 Hình 3.7 Ảnh hưởng nguồn glycerol đến khả sinh trưởng S.clvuligerus 41 Hình 3.8 Ảnh hưởng nguồn pepton đến khả sinh trưởng S.clvuligerus 43 Hình 3.10 Ảnh hưởng nguồn K2HPO4 đến khả sinh trưởng S.clvuligerus 44 Hình 3.11.Biểu đồ ảnh hưởng thời gian ni cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus đột biến 45 Hình 3.12 Biểu đồ ảnh hưởng pH nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus đột biến 46 Hình 3.13 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus đột biến 46 MỞ ĐẦU Hiện kháng kháng sinh vấn đề mang tính tồn cầu đặt biệt trội nước phát triển với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn nhiều chi phí cho việc thay kháng sinh cũ kháng sinh mới.Các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, đường hơ hấp bệnh nhiễm khuẩn nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc tỉ lệ tử vong cao nước phát triển.Theo khảo sát BV Bạch Mai tỉnh phía Nam, tỉ lệ E coli (vi khuẩn đường ruột) kháng kháng sinh lên tới 74,6%; tỉ lệ kháng vi khuẩn gây nhiễm trùng K pneumoniae lên tới gần 60%; vi khuẩnA.baumannii có tỉ lệ kháng với hầu hết loại kháng sinh mức 90% [1] Với nhóm kháng sinh penicillin cephalosporin nhóm kháng sinh mạnh bị số vi khuẩn kháng lại ,đặc biệt vi khuẩn gram âm mang gene kháng thuốc β-lactamase Các β-lactamase enzyme sinh vi khuẩn gram âm gram dương, chúng xúc tác mở vòng cầu nối β-lactam làm cho kháng sinh β-lactam hiệu lực Hiện sử dụng chất ức chế β-lactamase kết hợp với kháng sinh β-lactam coi biện pháp hiệu chống lại chế kháng thuốc vi khuẩn Các chế phẩm phối hợp kháng sinh β-lactam chất ức chế β-lactamase sử dụng rộng rãi bao gồm amoxicillin/axit clavulanic, ticarcilin/axit clavulanic, ampicilin/sulbbactam Axit clavulanic chất có chứa vòng β-lactam cấu trúc có khả ức chế β-lactamase Mặc dù không tác dụng kháng sinh kết hợp với kháng sinh nhóm penicillin có khả tiêu diệt vi khuẩn tiết enzyme β-lactamase làm tăng phổ kháng khuẩn kháng sinh Axit clavulanic sinh tổng hợp từ chủng Streptomyces clavuligerusđang quan tâm nghiên cứu nhiều nước giới có Việt Nam Tuy chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus tự nhiên sinh tổng hợp axit clavulanic chưa cao, cần có biện pháp cải thiện suất nhằm thu hàm lượng axit cao Vì em thực đề tài : “ Nghiên cứu tạo chủng đột biến hóa chất MNNG nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp thu nhận axit clavulanic từ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus.” Page PHẦN 1-TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh Nghiên cứu kháng sinh Thế giới Kháng sinh gọi Trụ sinh chất chiết xuất từ vi sinh vật, nấm, tổng hợp bán tổng hợp, có khả tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm phát triển vi khuẩn cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn cấp độ phân tử, thường vị trí quan trọng vi khuẩn hay phản ứng trình phát triển vi khuẩn Trước đầu kỷ 20, cách trị nhiễm trùng chủ yếu dựa phương pháp y học dân gian.Các hỗn hợp với đặc tính kháng khuẩn sử dụng điều trị nhiễm khuẩn phát cách 2000 năm.Nhiều văn hóa cổ, bao gồm Hy Lạp cổ đại Ai Cập cổ đại sử dụng nấm mốc chọn lọc đặc biệt nguyên liệu thực vật chiết xuất để trị nhiễm khuẩn Các quan sát gần thực phòng thí nghiệm kháng sinh vi sinh vật đưa đến phát khánh sinh tự nhiên tạo từ vi sinh vật Louis Pasteurnhận xét, "nếu can thiệp vào đối lập vi khuẩn quan sát, có nhiều hi vọng lớn phương pháp điều trị" Năm 1895, Vincenzo Tiberio, nhà vật lý học đại học Naples phát loại nấm mốc (Penicillium) nước có hoạt động kháng khuẩn tốt Sau hợp chất hóa trị ban đầu tỏ có hiệu quả, hợp chất khác theo đuổi dòng điều trị, khơng thực năm 1928, Alexander Fleming quan sát kháng sinh chống lại vi khuẩn từ loài nấm chi Penicillium Fleming công nhận ảnh hưởng gián tiếp từ hợp chất kháng sinh có tên penicillin, tính chất kháng sinh khai thác cho phương pháp hóa trị Ban đầu ông ta miêu tả số đặc tính sinh học nó,và cố gắng sử dụng điều chế thơ để trị số trường hợp nhiễm khuẩn Page Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum bào tử chúng Penicillium(tiếng la tinh Penicillium nghĩa bút lông) có tên phận sinh sản lồi nấm mốc có hình dạng giống bút lông Năm 1938, Fleming nhận thư hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford Ernst Boris Chain Howard Walter Florey, với lời đề nghị hợp tác với ông để tiếp tục thực cơng trình nghiên cứu Penicillin họ thử nghiệm thành công Penicillin chuột vào năm 1940 Năm 1944,nhóm chọn loại nấm sinhPenicillin ưu việt chủng Penicillium chrysogenum, chế tạo loại Penicillin có hoạt tính cao triệu lần Penicillin Flemming tìm thấy lần đầu năm 1928 Năm 1945,Fleming giải thưởng Nobel y học Ernst Boris Chain Howard Walter Florey Cùng với việc phát Penicilin,thập kỉ 40,50 kỉ XX ghi nhận bước tiến vượt bậc việc khám phá hàng loạt chất kháng sinh (CKS) có giá trị y học như:Sulfonamid (Gerhard Domard, 1932), Streptomycin(Selman Waksman Albert Schat,1944), Cloramphenicol(Erhlich,1947), Chlotetraxyclin (Dugar,1948),… Tốc độ tìm kiếm CKS ngày đẩy mạnh.Nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học y học, dược phẩm nông nghiệp nhiều nước giới liên tục phát hàng loạt CKS có giá trị ứng dụng thực tiễn.Năm 1945 phát hiệnđược 30 CKS, năm 1949 số 150 CKS, năm 1953 xấp xỉ 450 CKS, năm 1980 có 5.500 chất đến số lượng CKS phát lên tới Page 3.3 Kết sàng lọc sau đột biến Sau đột biến chủng S.clavuligerusvới nồng độ hóa chất MNNG 2,5 mg/ml với thời gian đột biến 30 phút pH=8 cấy trang chủng đột biến đĩa thành khuẩn lạc riêng rẽ hình Hình 3.3 Khuẩn lạc chủng S.clavuligerusmọc riêng rẽ Hình 3.5 Chủng xạ khuẩnS.clavuligerusđột biến cấy trang Sau đột biến chủng S.clavuligerusvới nồng độ MNNG 2,5mg/ml thời gian 30 phút pH=8 ta cấy chuyển khuẩn lạc, đặt tên thử hoạt tính kết thể bảng 3.6 Bảng 3.6 thử hoạt tính axit chủng sau đột biến STT Ký hiệu biến chủng B.subtilis Amox 0,01mg/ml+CLA ( D ) mm E.coli JM109 Amox 0,01mg/ml+CLA ( D ) mm M1-1 17,3 15,5 M1-2 17 15 M1-3 18 16,5 M1-4 13 11 M1-5 17 15,3 M1-6 19,7 17,5 M1-7 18 16 M1-8 18,5 16,5 M1-9 17 15 Page 38 10 M1-10 15 13 11 M1-11 15 13 12 M1-12 17 15 13 M1-13 18 16 14 M1-14 19 17 Nhận xét: Sau đột biến hoạt tính axit clavulanic chủng S.clavuligerustăng lên, bảng nhận thấy chủng S.clavuligerus M1-6 có khả sinh AC lớn nhất, sau đến chủng S.clavuligerus M1-8 S.clavuligerus M1-6 Chủng S.clavuligerus tự nhiên Hình3.6 Đĩa thử hoạt tính AC chủng S.clavuligerus đột biến chủng tự nhiên 3.4 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp acid chủng đột biến 3.4.1.Ảnh hưởng hàm lượng cacbonhydrat đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh Ảnh hưởng nguồn cacbonhydrat Sau nuôi cấy chủng xạ khuẩntrên môi trường giàu khống có nguồn cacbonhydrat khác là: tinh bột tan, saccarozơ, glucozơ maltozơ , glyxerol, Page 39 fructozo với khối lượng, theo dõi sau ngày nuôi lắc 28 oC ta thu kết bảng Bảng 3.7 Ảnh hưởng nguồn cacbonhydrat đếnkhả sinh trưởng sinh tổng hợp kháng sinh chủng S.clavuligerusđột biến Nguồn Khả Trọng cacbon lượng 10g/l phát ướt triển (g/l) Maltozơ ++ Glucozơ Tinh B.subtilis E.coli Amox0,01mg/ml+CLA JM109Amox0,01mg/ml+CLA ( D ) mm ( D ) mm 20,3 17,5 15,3 + 19 17 15 bột ++ 20,5 17,7 15,5 Saccarozơ +++ 23,5 18 16,7 Glyxerol +++ 23 20 18 fructozo ++ 20,1 17,5 15,5 tan Ghi chú: + phát triển bình thường, ++ phát triển tốt Kết nghiên cứu cho thấy S.clavuligerusđột biến có khả đồng hóa nguồncacbonhydrat có khả đồng hóa cao với glyxerol khả sinh trưởng tốt hoạt lực acid mạnh Chủng có khả đồng hóa số nguồn cacbonhydrat khác với tỷ lệ thấp khả sinh acid thấp Như vậy, nhóm nghiên cứu chọn glyxerol nguồn cacbonhydrat để pha chế mơi trường ni cấy cho chủng Ảnh hưởng hàm lượng glycerol Nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn hàm lượng glycerol khác để khảo sát ảnh hưởng hàm lượng glycerol môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit, cụ thể là: 0,1%, 0,5 %, 1%, 1,5 %, % Kết xác định phương pháp đo vòng vơ khuẩn sau 72 ni cấy với VSV kiểm định làB.subtiliskết trình bày bảng sau: Page 40 Bảng 3.8 : Ảnh hưởng hàm lượng Glycerol đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus glycerol B.subtilis E.coli Amox0,01mg/ml+CLA JM109Amox0,01mg/ml+CLA ( D ) mm ( D ) mm 0,1% 16 14,7 0,5% 17 15,3 1% 18,7 16,7 1,5% 20,3 18,3 18 16 2% Qua kết biểu đồ cho thấy chủng xạ khuẩn S.clavuligerusđột biến nuôi mơi trường giàu khống có hàm lượng glycerol 1,5% tạo hàm lượng axit nhiều mơi trường giàu khống có hàm lượng glycerol khác làm lượng axit tạo Như vậy, hàm lượng cacbonhydrat cao hay thấp ảnh hưởng lớn đến khả sinh axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerusđột biến: hàm lượng cacbonhydrat thấp khơng đủ dinh dưỡng cho phát triển hàm lượng cacbonhydrat q cao lại ức chế tổng hợp axit chủng khả ức chế β-lactamase 25 20 15 10 0.00% 0.50% 1.00% 1.50% 2.00% 2.50% hàm lượng glycerol Hình 3.7Ảnh hưởng nguồn glycerol đến khả sinh trưởngS.clvuligerus Page 41 3.4.2.Ảnh hưởng hàm lượng nito đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh Ảnh hưởng nguồn nito Sau nuôi cấy chủng xạ khuẩntrên môi trường giàu khống có nguồn nito khác là: cao thịt , trypton, pepton với khối lượng, theo dõi sau ngày nuôi lắc 28 oC ta thu kết bảng Bảng 3.9Ảnh hưởng nguồn nito đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus Các Khả Trọng nguồn lượng nito phát ướt 10g/l triển (g/l) Cao thịt ++ Trypton pepton B.subtilis E.coli Amox0,01mg/ml+CLA JM109Amox0,01mg/ml+CLA ( D ) mm ( D ) mm 21 17,5 15,3 ++ 21,5 18 16 +++ 24 20,5 18,5 Ghi chú: + phát triển bình thường, ++ phát triển tốt Qua bảng kết cho thấy với nguồn nito pepton chủng xạ khuẩn phát triển mạnh sinh axit với lượng lớn , có khả ức chế VSV kiểm định cao Với nguồn nito khác, chủng xạ khuẩn sinh axit với lượng nhỏ Nhóm nghiên cứu định sử dụng pepton nguồn nito nuôi cấy chủng phục vụ cho nghiên cứu Ảnh hưởng hàm lượng pepton Với điều kiện tối ưu khảo sát trên, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn hàm lượng pepton khác để khảo sát ảnh hưởng hàm lượng pepton môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit, cụ thể là: 1%; 1,5%; 2%; 2,5%, 3,% Khả sinh axit xác định sau 96h Page 42 Bảng3.10 Ảnh hưởng nguồn nito đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh pepton B.subtilis E.coli Amox0,01mg/ml+CLA JM109Amox0,01mg/ml+CLA ( D ) mm ( D ) mm 0,5% 17 15,3 1% 20,7 18,7 1,5% 19 17,7 2% 18 16 2,5% 17 15 Hình 3.8 Ảnh hưởng cácnguồnpepton đến khả sinh trưởngS.clvuligerus khả ức chế β-lactamase 25 20 15 10 0.00% 0.50% 1.00% 1.50% 2.00% 2.50% 3.00% hàm lượng pepton 3.4.3 Ảnh hưởng hàm lượng K2HPO4 Với hàm lượng glyxerol 1,0% pepton 2%, chủng xạ khuẩn ni cấy mơi trường giàu khống có hàm lượngK2HPO4khác %,2,5%; 3,0%; 3,5%; 4,0% Sau ngày nuôi cấy chủng, ta tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng sinh với VSV kiểm định B.subtilis, thu kết bảng 3.9 Page 43 Bảng 3.9 Ảnh hưởng hàm lượngK2HPO4tổng đến khả sinh kháng sinh chủng S.clavuligerusđột biến Hàm lượng K2HPO4 B.subtilis E.coli Amox0,01mg/ml+CLA JM109Amox0,01mg/ml+CLA ( D ) mm ( D ) mm 0,1% 18,7 16,5 0,15% 19,5 16,7 0,2% 19,7 17,3 0,25% 20,9 18,9 0,3% 19.7 18 Theo kết bảng ta thấy: hàm lượng K2HPO4thích hợp cho khả sinh kháng sinh chủng % đường kính vòng vơ khuẩn trung bình đạt lớn nhất, hàm lượng khác kính vòng vơ khuẩn thu nhỏ Như vậy, nồng độ khoáng cao hay thấp ảnh hưởng tới khả sinh kháng sinh chủng khả ức chế β-clactamase Chart Title 21.5 21 20.5 20 19.5 19 18.5 0.00% 0.05% 0.10% 0.15% 0.20% 0.25% 0.30% 0.35% hàm lượng Hình 3.10 Ảnh hưởng cácnguồnK2HPO4 đến khả sinh trưởngS.clvuligerus 3.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 3.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Với hàm lượng glycerol 1,5% nitơ 2,5%, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn thời gian để khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh Page 44 tổng hợp axit là48h, 72h, 96h, 120h,142h Đối với mốc thời gian nghiên cứu, ta tiến hành kiểm tra hoạt tính acid với vi sinh vật kiểm định B.subtilisvà kháng sinh Amo, thu kết hình Hình 3.11.Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus đột biến Qua kết biểu đồ cho thấy chủng xạ khuẩn S.clavuligerusđột biến phát triển tốt khoảng thời gian 72h – 96h, khoảng thời gian lượng sản phẩm tạo nhiều xạ khuẩn tăng trưởng với số lượng lớn lượng sản phẩm trao đổi chất tạo nhiều Trước khoảng thời gian lượng axit tạo chưa nhiều xạ khuẩn thích ứng chậm với mơi trường ni cấy Sau khoảng thời gian 96h nuôi cấy xạ khuẩn phát triển chậm lại mơi trường dinh dưỡng cạn kiệt lượng axit tạo giảm dần 3.5.2 Ảnh hưởng pH Với hàm lượng glyxerol 1,5% nitơ 2,5%, ni cấy khoảng thời gian 72÷96 Nhóm nghiên cứu lựa chọn pH để khảo sát ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp kháng sinh 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5.Sau đó, ta tiến hành kiểm tra hoạt tính acid với vi sinh vật kiểm định B.subtilis, thu kết nhưhình Page 45 .Hình 3.12Biểu đồ ảnh hưởng pH nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus đột biến 3.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ Với hàm lượng glycerol 1,5% nitơ 2,5%, nuôi cấy khoảng thời gian 72÷96 giờ, pH 7, nhóm nghiên cứu tiếp tục lựa chọn mốc nhiệt độ khác để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên 24oC; 26 oC; 28oC;30oC 32 oC.Sau tiến hành kiểm tra hoạt tính acid với vi sinh vật kiểm định làB.subtilisvà kháng sinh Amo, thu kết hình Hình 3.13Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit chủng S.clavuligerus đột biến Page 46 Qua kết biểu đồ cho thấy chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên mơi trường giầu khống tạo nhiều sản hẩm nhiệt độ 28 độ C, lượng acid tạo nuôi chủng môi trường giàu khống ngiệt độ khác hơn, đặc biệt nhiệt độ 24 độ C lượng ạid tạo Điều cho thấy nhiệt đọ ni cấy có ảnh hưởng lớn đến khả sinh acid chủng xạ khuẩn S.clavuligerus 3.6 Quy trình tách thu nhận axit quy mơ thí nghiệm Bước 1: Thu dịch ni mơi trường giàu khống Bước 2: Ly tâm nhiệt độ phòng 10 phút với tốc độ 6000 v/p, 4oC để loại bỏ sinh khối tế bào Bước 3: Thu dịch nuôi bổ sung dung môi n-butanol tỷ lệ 2:3 chuẩn pH=2 Bước 4: Lắc hỗn hợp 2giờ 28oC Bước 5: Ly tâm hỗn hợp nhiệt độ 4oC,10 phút với tốc độ 6000 v/p để tạo phân lớp phần dịch có chứa axit dung mơi Bước 6: Loại lớp dịch đục bên dưới, thu lớp dịch phía bao gồm dung mơi CLA hòa tan Bước 7: Quay khô chân không để thu CLA Page 47 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu nhóm thực mục tiêu đề thu kết sau: 1, Chọn chủng S clavuligerus đột biến hóa chất MNNG nồng độ 2,5 mg/ml với thời gian ủ 30 phút cho đường kính vòng vô khuẩn lớn 2, Chọn lọc chủng S clavuligerusM1-6 có khả sinh tổng hợp AC cao 19,5mm 3, Tối ưu thành phần môi trường dinh dưỡng để chủng S.clavuligerus M1-6 sinh trưởng sinh tổng hợp axit cao nhất: nguồn cacbonhydrat glycerol với hàm lượng 1,5% , nguồn nito pepton với hàm lượng 1%,hàm lượng K2HPO4 0,25% Chúng phát triển mạnh khoảng thời gian 72-120 ni cấy mơi trường có pH=7, nhiệt độ 28oC chủng S clavuligerusM1-6 sinh tổng hợp cao cho vòng kháng khuẩn từ 19,5mm lên 21,5mm 4.2 Khả ứng dụng kết nghiên cứu đề tài Kết nghiên cứu ứng dụng cho ngành y-dược, tạo axit clavulanic kết hợp với kháng sinh để chống lại chế kháng thuốc đặc hiệu vi khuẩn tạo kháng sinh có hoạt tính cao Giảm chi phí cho việcthay kháng sinh 4.3 Kiến nghị - Cải tạo, nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp axit chủng Streptomyces clavuligerusM1-6 - Thu nhận axit clavulanic chủng Streptomyces clavuligerusM1-6 quy mô lớn - Nghiên cứu phương pháp tinh chế sản phẩm axit clavulanic để phục vụ cho y học nghiên cứu Page 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG NG ANH 1.Townsend, CA (Oct biosynthesis." Current 2002) Opinion "New "New in reactions Chemical in clavulanic Biology (5): acid 583 9doi:10.1016/S1367-5931(02)00392 5931(02)00392-7 PMID 12413541 2.Jump up^ Reading, C C.; ; Cole, M (1 May 1977) "Clavulanic Acid: a Beta BetaLactamase-Inhibiting Inhibiting Beta-Lactam Beta Lactam from Streptomyces clavuligerus" Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11 (5): 852–857 doi:10.1128/AAC.11.5.852 10.1128/AAC.11.5.852 3.Arulanantham H, Kershaw NJ, Hewitson KS, Hughes CE, Thirkettle JE, Schofield CJ (January 2006) "ORF17 from the clavulanic acid biosynthesis gene cluster catalyzes the ATP-dependent ATP formation of N-glycyl-clavaminic clavaminic acid" acid" J Biol Chem 281 (1): 279–87.doi:10.1074/jbc.M507711200 279 PMID 16251194 4.Tahlan K, Park HU, Wong A, Beatty PH, Jensen SE (March 2004) "Two sets of paralogous genes encode the enzymes involved in the early stages of clavulanic acid and clavam metabolite biosynthesis in Streptomyces clavuligerus" Antimicrob.AgentsChemother Antimicrob.Agents 48 (3):930– doi:10.1128/AAC.48.3.930 10.1128/AAC.48.3.930-939.2004 PMC 353097  PMID 14982786 1498278 5.Reading, C.; Cole, M (1 May 1977) "Clavulanic Acid: a Beta Beta-LactamaseInhibiting Beta-Lactam Lactam from Streptomyces clavuligerus" clavuligerus" Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11(5):852 852–857 doi:10.1128/AAC.11.5.852 PMC 352086 352086  PMID 879738 6.Jump up^ Busby, RW; Townsend, CA (Jul 1996) "A single monomeric iron center in clavaminate synthase catalyzes three nonsuccessive oxidative transformations." Bioorganic&MedicinalChemistry Bioorganic&Medicinal (7):105964 doi doi:10.1016/096 8-0896(96)00088-0 PMID 8831977 7.Jump up^ Bachmann, BO; Townsend, CA (Sep 19, 2000) 2000) "Kinetic mechanism of the beta-lactam lactam synthetase of Streptomyces clavuligerus." Biochemistry 39 (37): 11187–93.doi:10.1021/bi000709i 10.1021/bi000709i PMID 10985764 8.Jump up^ Khaleeli, Nusrat; Li, Rongfeng; Townsend, Craig A "Origin of the βLactam Carbons in Clavulanic Acid from an Unusual Thiamine Pyrophosphate PyrophosphatePage 49 Mediated Reaction" Journal of the American Chemical Society 121 (39): 9223– 9224 doi:10.1021/ja9923134 9.Jump up^ Joint Formulary Committee British National Formulary, 47th edition London: British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain; 2004 10.Jump up^ "Drug Record - Amoxicillin-Clavulanate" LiverTox - Clinical and Research Information on Drug-Induced Liver Injury.Retrieved April 24, 2013 11.Jump up^ Tortajada Girbés M, Ferrer Franco A, Gracia Antequera M, Clement Paredes A, García Moz E, Tallón Guerola M (2008) "Hypersensitivity to clavulanic acid in children".Allergol Immunopathol (Madr) 36 (5): 308– 10 doi:10.1016/S0301-0546(08)75228-5.PMID 19080805 12.Baggaley K, Brown A, Schofield C (1997) "Chemistry and biosynthesis of clavulanic acid and other clavams" Nat Prod Rep 14 (4): 309– 33 doi:10.1039/np9971400309 PMID 9281835 13.Jump up^ Doran J, Leskiw B, Aippersbach S, Jensen S (1990) "Isolation and characterization of a beta-lactamase-inhibitory protein from Streptomyces clavuligerus and cloning and analysis of the corresponding gene" J Bacteriol 172 (9): 4909–18 PMC 213145  PMID 2203736 14.Jump up^ Aharonowitz Y, Demain A (1 August 1978) "Carbon Catabolite Regulation of Cephalosporin Production in Streptomyces clavuligerus" Antimicrob Agents Chemother 14 (2): 159– 64.doi:10.1128/aac.14.2.159 PMC 352426  PMID 697343 15.Jump up^ Garcia-Dominguez M, Martin J, Liras P (1989) "Characterization of sugar uptake in wild-type Streptomyces clavuligerus, which is impaired in glucose uptake, and in a glucose-utilizing mutant" J Bacteriol 171 (12): 6808– 14 PMC 210580  PMID 2687256 16.Jump up^ Kirk S (2000) "The physiology of clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus (PhD thesis)" University of Surrey, UK 17 Reading C, Cole M (1977) "Clavulanic Acid: a Beta-Lactamase-Inhibiting Beta-Lactam from Streptomyces clavuligerus" Antimicrob Agents Page 50 Chemother 11 (5):852–7 7.doi:10.1128/aac.11.5.852 PMC 352086  PMID 879738 18.^ Jump up to:a b Higgens CE, Kastner RE (1971) "Streptomyces clavuligerus sp nov., a beta-lactam lactam antibiotic producer" International Journal of Systematic Bacteriology 21 (4): 326–31.doi:10.1099/00207713-21-4-326 326 19.Jump up^ Nabais AMA, Dafonseca MMR (1995) "The Effect of Solid Medium Composition on Growth and Sporulation of Streptomyces-Clavuligerus Streptomyces Clavuligerus - Spore Viability During Storage at +4-Degrees-C".Biotechnology +4 C".Biotechnology Techniques (5): 361– doi:10.1007/BF00638871 10.1007/BF00638871 20.Jump up^ Tahlan lan K, Anders C, Jensen S (2004) "The Paralogous Pairs of Genes Involved in Clavulanic Acid and Clavam Metabolite Biosynthesis Are Differently Regulated in Streptomyces clavuligerus" clavuligerus" J Bacteriol 186 (18): 6286– 97 doi:10.1128/JB.186.18.6286 10.1128/JB.186.18.6286-6297.2004 PMC 515150  PMID 15342599 15342599 21.Waksman, Waksman, S A (1961) The Actinomycetes Classification, identification DNA descriptions of genra ADN species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA B: TÀI LIỆU TIẾNG NG VIỆT VI 22.Cao Vănn Thu, Bài giảng gi kháng sinh Vitamin, Bộ môn Công nghi nghiệp Dược, Đại học Dược Hà Nội, i, 2000 23.Biền Văn n Minh (2000), Nghiên cứu c khả sinh chấtt kháng sinh ccủa số chủng xạ khuẩn phân lậpp từ t đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh hhọc, Hà Nội 24.Bùi Thị Hà, Nghiên ứu xạ khuẩn sinh CKS chống nấm gây bệnh nh th thực vật Việt Nam, Luận án tiến sĩĩ Sinh học, h Hà Nội, 2006 25.Nguyễnn Khang, Kháng sinh học h ứng dụng, Nhà xuất y họcc Hà N Nội,Trang 720, 2005 26.Nguyễn Lân Dũng, ng, Đoàn Đ Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một M số phương pháp nghiên cứuu vi sinh vvật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, i, 328 – 345 27.Nguyễn Lân Dũng, ng, Nguyễn Nguy Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục, c, Hà N Nội, tr 39 – 41 Page 51 28.Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 29.PGS.TS Kiều Hữu Ảnh, giáo trình vi sinh vật học (tập 2) – (tr 12 – 19) 30.Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Page 52 ... NGHIÊN CỨU Chủng xạ khuẩnStreptomyces clavuligerus Đột biến hóa chất MNNG Nghiên cứu nồng độ Nghiên cứu thời gian Nghiên cứu pH gây MNNG đột biến đột biến Sàng lọc chủng sau đột biến Nghiên cứu môi... đột biến Nghiên cứu khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit clavulanic chủng S clavuligerus ột biến Tách chiết thu nhận axit clavulanic từ chủng S clavuligerus đột biến Page 20 TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU... : “ Nghiên cứu tạo chủng đột biến hóa chất MNNG nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp thu nhận axit clavulanic từ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus. ” Page PHẦN 1-TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh