BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI *** -BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI *** LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GENE DOXA VÀ THIẾT KẾ VECTOR PIBR25.DOXAV BIỂU LUẬN VĂN THẠC SĨ HIỆN TRONG VẬT CHỦ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES LIVIDANS TK24 NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GENNE DOXA, VÀ THIẾT KẾ HỌC VIÊN: BIỂU NGUYỄN NGA VẬT CHỦ XẠ VECTOR PIBR25.DOXAV HIỆNTHỊ TRONG KHUẨN STREPTPMYCES LIVIDANS TK 24 HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ HÀ NỘI, 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI *** LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GENE DOXA VÀ THIẾT KẾ VECTOR PIBR25.DOXAV BIỂU HIỆN TRONG VẬT CHỦ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES LIVIDANS TK 24 CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 60420201 HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ NGA HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TẠ THỊ THU THỦY HÀ NỘI, 2016 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA SAU ĐẠI HỌC LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố khóa luận khác Hà nội, ngày 25 tháng năm 2016 Tác giả Nguyễn Thị Nga NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA SAU ĐẠI HỌC LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khố luận tốt nghiệp khơng cố gắng thân, em nhận bảo, hướng dẫn tận tình của thầy giúp đỡ động viên gia đình bạn bè Trước tiên em xin trân trọng biết ơn cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy Trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình dìu dắt, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập, nghiên cứu Đặc biệt em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành sâu sắc em tới người thân, toàn thể bạn phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử động viên, giúp đỡ hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình học tập rèn luyện để hồn thành tốt khố luận Để có hiểu biết kiến thức chuyên ngành, em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tạo cho em môi trường giảng dạy tốt để em hồn thành tốt khố luận Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln ủng hộ, khích lệ động viên tinh thần em suốt thời gian thực tập tốt nghiệp để hoàn thành tốt khố luận Trong q trình nghiên cứu đề tài, thân em có nhiều cố gắng, khơng thể tránh khỏi thiếu sót, hạn chế nên em mong nhận góp ý q thầy – để khóa luận em đầy đủ hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2016 Học Viên Nguyễn Thị Nga NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA SAU ĐẠI HỌC MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Lịch sử kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.2 Đại cương xạ khuẩn 10 1.2.1 Đặc điểm chung xạ khuẩn 10 1.2.2 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 10 1.3 Vật chủ biểu xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 11 1.4 Tổng quan kháng sinh Doxorubicin 12 1.4.1 Giới thiệu chung kháng sinh Doxorubicin 12 1.4.2 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin 13 1.4.3Cấu trúc Doxorubicin 14 1.4.4Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin 15 1.4.5 Cơ chế hoạt động hoạt tính sinh học Doxorubicin 16 1.4.6 Ứng dụng thành tựu đạt nghiên cứu kháng sinh DXR 18 1.5 Giới thiệu chung gen doxA , dnrV 21 1.5.1 Giới thiệu chung gen doxA 21 1.5.2 Giới thiệu chung gen dnrV 23 1.6 Vector biểu pIBR25 hệ xạ khuẩn 23 1.7 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 24 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 Vật liệu, hóa chất, mơi trường thiết bị 25 2.1.1 Vật liệu 25 NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA SAU ĐẠI HỌC 2.1.2 Môi trường 27 2.1.3 Hóa chất 28 2.1.4 Thiết bị 31 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 31 2.2.1 Phương pháp thiết kế mồi 31 2.2.2 Phương pháp PCR 33 2.2.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số xạ khuẩn 35 2.2.4 Phương pháp điện di gel agarose 36 2.2.5 Phương pháp tinh ADN từ gel agarose 36 2.2.6 Phương pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn 37 2.2.7 Phương pháp nối ADN 38 2.2.8 Phương pháp cắt ADN enzyme giới hạn 38 2.2.9 Phương pháp chuyển gen sốc nhiệt 39 2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào Streptomyces lividans TK24 40 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Tách dòng gen doxA dnrV 42 3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ xạ khuẩn S.peucetius ATCC27952 42 3.1.2 Nhân gen doxA , dnrV phản ứng PCR 42 3.2.3 Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T.doxAV 45 3.3 Giải trình tự dự đốn chức gen qua genbank 48 3.3.1 Giải trình tự gen dự đoán chức doxA: 48 3.3.2 Giải trình tự gen dự đoán chức dnrV 49 3.4 Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV 52 3.5 Tạo chủng tái tổ hợp S.lividans có mang vector pIBRdoxAV 56 PHẦN : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59 4.1 Kết luận 60 4.2 Đề xuất 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA SAU ĐẠI HỌC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích ADN Deoxyribonucleic acid ARN Ribonucleic Acid Amp Ampicillin bp Base paire C Carbon Da Dalton DNR Donorubicin DMSO Dimethyl sulfoxide dNTPs Deoxyribonucleotides DTT Dithinotheitol DXR Doxorubicin HTKS Hoạt tính kháng sinh IPTG Isopropyl-thio-β-galactoside Kb Kilobase NDYE Nitrate-Deniffined plus Extract LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] Yeast VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA SAU ĐẠI HỌC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng tách chiết 29 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng 31 Bảng 3.1 Kết so sánh trình tự đoạn gen doxA với trình tự công bố ngân hàng gen phần mềm Blast 49 Bảng 3.2 Kết so sánh trình tự đoạn gen dnrV với trình tự cơng bố ngân hàng gen phần mềm Blast 51 Bảng 3.4 Thời gian ủ lysozyme để tạo tế bào trần 57 Bảng 3.5 Điều kiện thích hợp với nồng độ PEG 58 Bảng 36 Khảo sát điều kiện thích hợp với nồng độ kháng sinh 59 NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA SAU ĐẠI HỌC DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1.Cơ chế tác dụng kháng sinh Hình 1.2: Cấu trúc khơng gian hóa học Doxorubicin 15 Hình 1.3: Cấu trúc khơng gian Daunorubicin Doxorubicin 15 Hình 1.4 Các gen tham gia vào trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR 16 Hình 2.1: Sơ đồ thiết kế vector pIBR25.DoxAV 24 Hình 2.1: Cấu trúc pGEM – T vector dùng tách dòng gen 26 Hình 2.2: Cấu trúc pIBR25 dùng biểu gen 27 Hình 3.1 Điện di kết tách chiết ADN tổng số chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius 42 Hình 3.2 Điện di kết PCR nhân gen doxAV 44 Hình 3.3 Tinh sản phẩm PCR gen doxAV 44 Hình 3.4 Quy trình tạo vector tái tổ hợp doxAV-pGEM T 45 Hình 3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp pGEM T.doxAV vào vi khuẩn E Coli JM109 46 Hình 3.6 Tách plasmid từ khuẩn lạc E coli JM109 trắng 47 Hình 3.7 Cắt kiểm tra plasmid dòng E.coli JM1109 mang pGEM- T.doxAV 47 Hình 3.1: Trình tự đoạn gen doxA 49 Hình 3.1: Trình tự đoạn gen dnrV 51 Hình 3.8: Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV 53 Hình 3.9 Cắt vector pGEM-T.doxA vector pIBR25 enzyme XbaI EcoRI điện di tren gel agarose 1% 54 Hình 3.10 Tinh sản phẩm cắt plasmid vector pGEM T.doxAV vector pIBR25 enzyme XbaI EcoRI 55 Hình 3.11 Kiểm tra khuẩn lạc chuyển vector pIBR25 cắt hai enzyme EcoRI/XbaI 56 NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] MỞ ĐẦU Bệnh ung thư coi bệnh nan y nguy hiểm phát với số ca mắc bệnh ngày gia tăng giới Theo thống kê tổ chức y tế giới (WHO) năm 2014 cho thấy tới năm 2035 số lượng bệnh nhân mắc bệnh ung thư đạt 24 triệu người tăng 70% so với năm 2012 14,1 triệu người Nhưng số nước phát triển Hoa kỳ, theo thống kê tổ chức ung thư Hoa Kỳ cho thấy tỷ lệ ca tử vong bệnh ung thư hai thập kỷ qua có xu hướng giảm từ đỉnh điểm 215/100.000 người năm 1991 xuống 175/100.000 người năm 2010 Điều chứng tỏ vai trò vơ quan trọng chất kháng sinh tham gia vào trình điều trị ung thư.Tuy nhiên, kho tàng thuốc kháng sinh ngày trở nên hạn hẹp khan Tốc độ phát triển loại kháng sinh kháng loài vi sinh vật gây bệnh bắt kịp sức tăng trưởng biến đổi mầm bệnh kháng thuốc Hiện tượng kháng kháng sinh trở thành vấn đề mang tính tồn cầu đặc biệt trội nước phát triển Với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn chi phí có liên quan việc chữa trị trở thành gánh nặng lớn với bệnh nhân Chính vậy, song song với việc sử dụng thuốc kháng sinh cách hợp lí người bệnh việc nghiên cứu, phát triển ứng dụng sản xuất loại kháng sinh nghĩa vụ trách nhiệm nhà khoa học toàn giới Doxorubicin kháng sinh thuộc nhóm anthacycline, sử dụng điều trị bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, khối u hệ lympho ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư máu Hiện nay, kháng sinh biết đến đặc điểm vượt trội có phổ tác dụng mạnh tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào trình sinh tổng hợp tế bào ung thư Doxorubicin loại kháng sinh có giá thành đắt Việt Nam chưa sản xuất Trong đường sinh tổng hợp tự nhiên chủng xạ khuẩn Strepyomyces peucetius hàm lượng DNR tạo với hàm NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] Sbjct Query 1995 241 Sbjct Query 1935 301 Sbjct Query 1875 361 Sbjct Query 1815 421 Sbjct Query 1755 481 Sbjct Query 1695 541 Sbjct Query 1635 601 Sbjct Query 1575 661 Sbjct Query 1515 721 Sbjct Query 1455 781 Sbjct 1395 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACCAGATCGACACCCCCTACCACCGGCCGTACGGGCCCGGGAACGACCAGCACGGCATG CCGGCCATCTGGACCGTGTACTTCGCCACCGACGACGCCGACGCACTGACCAAGCGGGTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGGCCATCTGGACCGTGTACTTCGCCACCGACGACGCCGACGCACTGACCAAGCGGGTC GAGACGGCGGGCGGCGAGGTCATCATGACTCCGATGGACGTCCTCGGCCTCGGCCGGATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGACGGCGGGCGGCGAGGTCATCATGACTCCGATGGACGTCCTCGGCCTCGGCCGGATG GCGGTCTTCGCCGACCCCGCCGGGGCCGCGTTCGCGGTCTGGCGCAAGGGAGTCATGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGGTCTTCGCCGACCCCGCCGGGGCCGCGTTCGCGGTCTGGCGCAAGGGAGTCATGGAG GGCGCGGAGGTGACGGGCGTGCCCGGCTCGGTCGGCTGGGTCGAGCTGGTGACCGACGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCGCGGAGGTGACGGGCGTGCCCGGCTCGGTCGGCTGGGTCGAGCTGGTGACCGACGGC ATCGGGGCCGCCCGGGACTTCTACCCGGCGACCCTCGGCCTGGCTCCGGCCGACACCGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCGGGGCCGCCCGGGACTTCTACCCGGCGACCCTCGGCCTGGCTCCGGCCGACACCGGA CTGAAGGGCGTCACCGACCCGGTCTGGCACATCGGTGACACACCGGTCGCCGGCACCCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGAAGGGCGTCACCGACCCGGTCTGGCACATCGGTGACACACCGGTCGCCGGCACCCAG GAGCTGGGCGTCACCGGCGCGGTACGGCCGCACTGGGCCGTGCTGTTCGCCGTGCACGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGCTGGGCGTCACCGGCGCGGTACGGCCGCACTGGGCCGTGCTGTTCGCCGTGCACGAC TGCGACGCGACGGTCCGGCGCGCCGTTGAACTCGGCGGCTCCGTCGAGAACGAGCCCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCGACGCGACGGTCCGGCGCGCCGTTGAACTCGGCGGCTCCGTCGAGAACGAGCCCGCC GACACGCCCAGGGGGCGGCGGGCGGACCTGCTCGACCCGCACGGGGCCGGCTTCTCGGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACACGCCCAGGGGGCGGCGGGCGGACCTGCTCGACCCGCACGGGGCCGGCTTCTCGGTG GTCGAACTGCGGGAGGGGTACCCCGCGGCGGCGGGCGGTGCCTCGTGA 828 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCGAACTGCGGGAGGGGTACCCCGCGGCGGCGGGCGGTGCCTCGTGA 1348 1936 300 1876 360 1816 420 1756 480 1696 540 1636 600 1576 660 1516 720 1456 780 1396 3.4 Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV Trong đề tài sử dụng vector pIBR25 làm vector biểu gen doxA Chủng vi khuẩn E coli JM109 lựa chọn chủng vi khuẩn kiểm tra tạo thành vector tái tổ hợp chủng xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 tế bào vật chủ biểu gen doxAV NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 52 Hình 3.8: Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV Cắt pGEM T.doxAV pIBR25 enzyme XbaI EcoRI Tiến hành cắt plasmid pGEM T.doxAV enzyme giới hạn XbaI EcoRI để thu nhận đoạn gen doxAV Đồng thời, cắt vector pIBR25 hai loại enzyme để tạo hai đầu dính tương ứng với gen doxAV Phản ứng cắt plasmid vector pGEM T.doxAV plasmid pIBR25 thực 300C ủ Sau kết thúc, sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 53 Hình 3.9 Cắt vector pGEM-T.doxA vector pIBR25 enzyme XbaI EcoRI điện di tren gel agarose 1% 1,2: Sản phẩm cắt plasmid pGEM-T.doxAV; 3,4: vector pIBR25; M: GeneRulerTM - Tinh sản phẩm: Từ kết điện di hình cho thấy hai giếng số xuất hai băng vạch, băng vạch phía nằm vạch 2kb 2,5kb thang marker chuẩn tương đương với kích thước gen doxAV 2100bp, băng vạch phía có kích thước tương đương với vạch 3kb thang marker phù hợp với kích thước vector pGEM-T Easy vector 3015bp Trên giếng số thấy xuất băng vạch gần vạch 8kb thang marker chuẩn tương ứng với kích thước 7500bp vector pIBR25 Như cắt thành cơng vector pGEM T.doxAV tạo vị trí tương thích để gắn gen doxAV vào vector pIBR25 (hình 3.9) NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 54 Hình 3.10 Tinh sản phẩm cắt plasmid vector pGEM T.doxAV vector pIBR25 enzyme XbaI EcoRI; Giếng 1: Plasmid vector pGEM T.doxAV; Giếng 2: Plasmid vector pIBR25 ; Giếng M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder Nối gene doxAV vào pIBR25.doxAV Thực phản ứng nối gen doxA vào vector pIBR25 enzyme T4 DNA ligase 40C, để ủ qua đêm (14-16h) Để kiểm tra tạo thành vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV, tiến hành biến nạp sản phẩm vào vi khuẩn E coli JM109 Sàng lọc chủng mang vector tái tổ hợp mơi LB có bổ sung kháng sinh Amp(100µg/ml) Sau ni cấy 16h 370C, đĩa thạch xuất khuẩn lạc Tiến hành nuôi cấy ngẫu nhiên năm khuẩn lạc 3ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp(100µg/ml), ni lắc với tốc độ 150 rpm nhiệt độ 370C 16h Sau tiến hành tách plasmid , thực phản ứng cắt emzym XbaI EcoRI Sau kết thúc, sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% hình 3.11: NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 55 Hình 3.11 Kiểm tra khuẩn lạc chuyển vector pIBR25 cắt hai enzyme EcoRI/XbaI ; Giếng M: GeneRulerTM 1kb ADN Ladder; Giếng 1-5 : Plasmid dòng đánh số từ đến Qua ảnh điện di kết rõ khuẩn lạc số 2, khuẩn lạc xác chuyển thành cơng vector pIBR25.doxAV ba giếng số 2, xuất hai băng vạch, băng vạch phía nằm vạch 2kb 2,5kb thang marker chuẩn tương ứng với kích thước gen doxAV 2100bp , băng vạch phía có kích thước vạch 7kb thang marker phù hợp với kích thước vector pIBR25 7500bp 3.5 Tạo chủng tái tổ hợp S.lividans có mang vector pIBRdoxAV Đối với xạ khuẩn để biểu gene tế bào E.Coli chủng thường gặp nhiều khó khăn cấu trúc genome xạ khuẩn thường có tỷ lệ GC lớn 70% hệ vector thương mại không sử dụng promotor khơng tương thích Phương pháp biểu gene tối ưu biểu gene xạ khuẩn tế bào vật chủ xạ khuẩn mà vật chủ áp dụng Muốn chuyển gene vào tế bào xạ khuẩn bước phải tạo tế bào trần, tế bào bị loại bỏ lớp thành tế bào (peptidoglycan) Vì cần phải thiết phải khảo sát tìm điều kiện thích hợp có ảnh hưởng đến chuyển gen như: điều kiện vi sinh vật, nồng độ lyzozyme ủ thời gian NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 56 xử lý, nồng độ PEG thêm vào chuyển gen, nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen để lựa chọn khuẩn lạc chuyển thành công (transformant) Các điều kiện cần khảo sát yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hiệu xuất chuyển gen gồm a Thời gian ủ lysozim để loại bỏ lớp thành tế bào (petidoglycon) Bảng 3.4 Thời gian ủ lysozyme để tạo tế bào trần STT Thời Số lượng gian khuẩn lạc (phút) sống 30 200 Tế bào trần thích hợp (giờ) - TB có tỷ lệ sống cao; - Không chuyển gen 40 125 - TB sống cao; - Không chuyển gen 50 75 - Tỷ lệ tế bào sống trung bình (đếm khuẩn lạc sau chuyển gene) - Chuyển gen thành công 60 15 - Tỷ lệ tế bào sống thấp - Chuyển gen thành công 70 Tế bào chết Kết khảo sát tìm điều kiện thích hợp để chuyển gen vào tế bào xạ khuẩn tổng kết theo bảng 3.1 Với thời gian xử lý lysozim 50 phút thích hợp số tế bào trần có tỷ lệ sống cao tế bào khả biến thích hợp Trong thực tế thí nghiệm ủ lysozim thời gian ngắn có lượng tế bào loại bỏ lơp vỏ peptidoglycon, thời gian dài toàn tế bào trần chết b Nồng độ PEG xúc tác cho trình chuyển gen từ 10 đến 60% NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 57 Bảng 3.5 Điều kiện thích hợp với nồng độ PEG Nồng độ Khả (%) chuyển gen Kết luận STT 10 - - TB sống cao; - Không chuyển gen 20 - - TB sống cao; - Không chuyển gen 30 + - Tỷ lệ TB sống cao - Chuyển gen thành công 40 ++ - Tỷ lệ sống thấp - Chuyển gen thành công 50 - Không thành công 60 - Không thành công Ghi chú: (+) phát triển; (-) khơng phát triển; PEG có vai trò quan trọng chuyển gene tế bào xạ khuẩn chất tạo độ tiếp xúc mạnh DNA màng tế bào cố định DNA đó, tiếp xúc màng tế bào dễ dàng chuyển DNA vào tế bào chất xạ khuẩn Tương tự qua bảng phân tích với nồng độ PEG thích hợp 40% tế bào nhận vector tái tổ hợp (tế bào tái tổ hợp đạt cao nhất) c Nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen Khi phủ kháng sinh thiostrepton với dải nồng độ khác nhau, nồng độ chủng tự nhiên bị ức chế không phát triển ta lấy nồng độ chuẩn để phủ kháng sinh với mẫu chuyển gen để lựa chọn khuẩn lạc thành công Sau phủ kháng sinh đĩa khuẩn lạc tế bào xạ khuẩn chuyển gene phát triển, tế bào không tiếp nhận vector loại bỏ Các thí nghiệm với nồng độ phủ kháng sinh sau chuyển gene từ nồng độ 50 – 100 µg.ml-1 NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 58 Kết thực nghiệm cho thấy với nồng độ kháng sinh phủ lên đĩa chuyển gen 70 µg.ml-1 tỷ lệ tế bào sống sót mức thấp chuyển gene thành cơng Bảng 36 Khảo sát điều kiện thích hợp với nồng độ kháng sinh STT N độ Tsr µg.ml-1 Số lượng khuẩn lạc sống sót Tế bào trần thích hợp (giờ) 50 250 - Tỷ lệ sống cao; - Không chuyển gen thành công 60 150 - Tỷ lệ sống cao; - Không chuyển gen 70 70 - Tỷ lệ TB thấp - Hiệu suất chuyển gene thấp 80 20 - Tỷ lệ sống thấp - Chuyển gen thành công 90 - Tế bào chết 100 - Tế bào chết Thực tế thí nghiệm cho thấy có số lượng tế bào chuyển thành cơng thơng thường hiệu xuất đạt 0,2 – 0,5% thí nghiệm để khảo sát điều kiện thích hợp hầu hết phải quan sát trực tiếp chủng xạ khuẩn có điều kiện thích hợp cho chuyển gen hoàn toàn khác Đặc biệt tế bào trần protoplast dễ vỡ, yếu dễ bị chết tế bào (Hopwood cs, 2000) Vì cần tác động khơng thích hợp cho dù nhỏ gây chêt tế bào chuyển gen khơng thành công Sau chuyển gen quan sát thấy đĩa khuẩn lạc phát triển chậm nhiều so với chủng tự nhiên, tỷ lệ chuyển gen đạt thấp khuẩn lạc tiềm có khả sinh tổng hợp kháng sinh PHẦN : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 59 4.1 Kết luận Từ kết thu trên, xin rút kết luận sau: Thiết kế thành cơng vector tách dòng pGEM-T.doxAV Thiết kế thành công vector biểu mang đoạn gen doxAV vector pIBR25 biến nạp thành công vào tế bào xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 4.2 Đề xuất Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu thu trên, xin đề xuất số kiến nghị sau: Biểu thành công gen doxA dnrV Streptomyces lividans TK24 Chuyển hóa DNR thành DXR nhờ protein tái tổ hợp biểu Streptomyces lividans TK24 NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường đại học sư phạm Thái Nguyên Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 2006 Cao Văn Thu, (2000), giảng kháng sinh vitamin, Bộ môn công nghệ Dược - trường Đại Học Dược Hà Nội Lê Xuân Phương (2000), vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất xây dựng Hà Nội, tr 47-49 Nguyễn Bảo Hưng(2010), Tạo dòng biểu gen chitinase từ nấm trichoderma, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường đại học khoa học, Đại học Huế Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Kim Nữ Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập III, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1978 PGS.TS Kiều Hữu Ảnh, giáo trình vi sinh vật học tập Tiếng Anh Weiss RB (December 1992): "The anthacylines will we ever find a better Doxorubicin " Seminars in Oncology 19 (6): 670- 86 10 Tan C, Tasaka H, Yukp, Murphy ML, Karnofsky DA (March 1967): " Daunorubicin an antitumor antibiotic in the treatment of neoplastic disease clinical evaluation with special reference to childhood leukemia ", Cancer 20 (3): 333-53 NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 61 11 Arcamone F, CassineHG, Fantini G et al (1996): " Adriamycin 14Hydroxydaunomycin, a new antitunmor antibiotic from Streptomyces Peucetius Varaesius " , Biotechnol Bioeng 11 (6): 1101-10 12 Lomovskaya N, Otten SL, Doikatayama Y et al (1999) : " Daunorubicin over production in Streptomyces Peucetius: Cloning and characterization of the dnrU keto recductase and dnrV gene and the Dox a Cytochrome P-450 hydroxylase gene", J Bacteriol 181 (1): 305-18 13 Di Marco A, Gaetani M, Scarpinato B (February 1969) : "Adriamycin (NSC-123,127): a new antibiotic with antitumor activity" Cancer Chemother Rep 53 (1): 33–7 14 Walcazak RJ, Dickens ML, Priestley ND, Strohl WR (1999): "Purification, Properties, and Characterization of Recombinan Streptomyces sp Strain C5 DoxA, a Cytochrome P-450 Catalyzing Multiple Steps in Doxorubicin Biosynthesis 15 Fornari FA, Randolph JK, Yalowich JC, Ritke MK, Gewirtz DA (April 1994): "Interference by doxorubicin with ADN unwinding in MCF-7 breast tumor cells" Mol Pharmacol 45 (4): 649–56 16 Momparler RL, Karon M, Siegel SE, Avila F (August 1976) : "Effect of adriamycin on ADN, RNA, and protein synthesis in cell-free systems and intact cells" Cancer Res36 (8): 2891–5 17 "National Academy of Sciences: NAS Award in Molecular Biology" National Academy of Science Retrieved 2009-01-07or Unwinding the ADN Topoisomerase Story: the Work of James C Wang 18 Yves (May 28, 2010) "ADN topoisomerases and their poisoning by anticancer and antibacterial drugs" Chemistry & Biology Retrieved May 28, 2010 19 Champoux JJ (2001) "ADN topoisomerases: structure, function, and mechanism".Annu Rev Biochem 70 : 369–413 Doi : 10.1146/annurev biochem 70.1.369 NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 62 20 Caroline A.A , Katherline L.M ,(1998) Eukaryotic ADN Topoisomease II beta Review BioEssays 20:215-226 21 Lown J.W.,(1993) Anthracyline and anthraquinone anticancer agents:current status and recent developments Phamacol Ther 60(2): 185214 22 Ronal M Atlas, Microoganism in our world, Publish by Mosby-year book, Inc, 1995 23 Waksman, S.A The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, 1961, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 24 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro, Transpl Immunol, 2007/4, 17 (3): 162 - 170 25 Waksman, S A (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams Wilkins Co, Baltimore, USA 26.Doxorubicin Overproduction in Streptomyces peucetius: Cloning and Characterization of the dnrU Ketoreductase and dnrV Genes and the doxA Cytochrome P-450 Hydroxylase Gene 27.Jiang H, Hutchinson C R., (2006) "Feedback regulation of doxorubicin biosynthesis in Streptomyces peucetius" Res Microbiol 157 (7): 666–74 28.Physical map of the Streptomyces lividans 66 genome and comparison with that of the related strain Streptomyces coelicolor A3 NGUYỄN THỊ NGA [2014-2016] 63 CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lâp - Tự - Hạnh phúc XÁC NHẬN LUẬN VĂN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN THẠC SĨ STT NỘI DUNG CHỈNH SỬA TRANG Nội dung 1: Hình thức - Đã rà sốt chỉnh sửa tồn lỗi tả , luận văn - Đã bổ sung thêm chữ viết tắt LB, DXR, DNR, NDYE Phần danh mục chữ viết tắt - Đã thống chỉnh sủa cách thức đánh số trang, mục luận văn Nội dung 2: Nội dung - Hình 1.1 phóng to quan sát rõ - Sơ đồ thí nghiệm để tên hình 24 - Đã bổ sung tên bảng lời trích dẫn tên 24 bảng hóa chất thiết bị - Đã bổ sung nguồn gốc chủng streptomyces peucetius ATCC27952, Vector 25 pGMT- Easy, vector pIBR25 - Đã chuyển phần thiết kế mồi lên phần vật liệu 32 - Đã chỉnh lại hình 3.8 cho rõ hơn, hình 3.9 bổ sung chạy điện di agarose 1% 48-49 - Đã bổ sung thêm tài liệu tham khảo xếp theo ABC 61 - Hình vẽ khơng minh chứng cho việc tách dòng gen nên bỏ từ DnrV … đổi tên đề tài thành : Nghiên cứu tách dòng gene doxA thiết kế vector pIBR25.doxAV biểu vật chủ xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 Tôi xin cam đoan tơi chỉnh sửa theo góp ý hội đồng Hà Nội, ngày … tháng … năm … HỌC VIÊN (ký ghi rõ họ tên) GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN (ký ghi rõ họ tên) họ tên) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký ghi rõ ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI *** LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GENE DOXA VÀ THIẾT KẾ VECTOR PIBR25.DOXAV BIỂU HIỆN TRONG VẬT CHỦ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES LIVIDANS. .. Ketoreductase Vì vậy, chúng tơi thực nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu tách dòng gene doxA, thiết kế vector pIBR25.doxAV biểu vật chủ xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 nhằm tạo Cytochrome P450 Hydroxylase,... hợp tiền chất, enzym cofactor[6] 1.3 Vật chủ biểu xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 Cấu trúc vai trò Streptomyces lividans TK24 Streptomyces lividans TK24 vi khuẩn đất gram dương, cấu trúc dạng