Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh sạch và tác dụng hàn gắn vết thương của protease từ cây thuốc xuân hoa pseuderanthemum palatiferum (ness) radlk

58 116 0
  • Loading ...
1/58 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 22/03/2018, 19:00

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ TÁC DỤNG HÀN GẮN VẾT THƢƠNG CỦA PROTEASE TỪ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NESS) RADLK Ngƣời hƣớng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ TRANG Lớp : 13-01 HÀ NỘI - 2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ TÁC DỤNG HÀN GẮN VẾT THƢƠNG CỦA PROTEASE TỪ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NESS) RADLK Ngƣời hƣớng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ TRANG Lớp : 13-01 HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Võ Hồi Bắc phòng Sinh hóa Thực Vật, Viện cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Mai Phương, Trưởng phòng Sinh hóa Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam, tạo điều kiện cho phép thực tập Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, sinh viên phòng Sinh hóa Thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi tận tình suốt q trình làm khóa luận, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc Tôi xin cảm ơn Thầy, Cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội, quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập hồn thiện luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 12 tháng năm 2017 Sinh viên Hoàng Thị Trang MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Mô tả thực vật Xuân Hoa P palatiferum 1.2 Những nghiên cứu Xuân Hoa P palatiferum 1.2.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng Xuân Hoa 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học Xuân Hoa 1.2.3 Nghiên cứu dược tính 1.3 Định nghĩa phân loại protease…………………………… ….9 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Phân loại 1.4 Ứng dụng protease 10 1.5.Những nghiên cứu protease từ thực vật từ Xuân Hoa P palatiferum 13 PHẦN II : PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………… 15 2.1 Nguyên vật liệu 15 2.1.1 Mẫu thí nghiệm 15 2.1.2 Hóa chất sử dụng 15 2.1.3 Máy móc, thiết bị 15 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phương pháp chiết rút protease từ Xuân Hoa P palatiferum 15 2.2.2 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 16 2.2.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 18 2.2.4 Phương pháp tinh enzyme 19 2.2.5 Điện di protein 21 2.2.6 Phương pháp nghiên cứu tính chất protease 23 2.2.7 Đánh giá tác dụng làm lành vết thương tế bào nguyên sợi da người theo phương pháp Laing 25 2.2.8 Phương pháp thống kê 26 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Tinh protease từ Xuân Hoa P palatiferum 27 3.2 Điện di biến tính khơng biến tính protein 32 3.3 Ảnh hƣởng số chất ức chế đặc hiệu protease 34 3.3.1 Ảnh hưởng PMSF lên hoạt tính protease 34 3.3.2 Ảnh hưởng PCMB lên hoạt tính protease 34 3.3.3 Ảnh hưởng HgCl₂ lên hoạt tính protease 35 3.3.4 Ảnh hưởng O-phenanthroline lên hoạt tính protease…… 35 3.4 Khả thủy phân protease chất khác 36 3.5 Độ bền protease 37 3.5.1 Độ bền với nhiệt 37 3.5.2 Độ bền với pH 38 3.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính protease 39 3.6 Đánh giá tác dụng làm lành vết thƣơng tế bào nguyên sợi da ngƣời 39 PHẦN IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 49 DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu: Tên đầy đủ BSA: Bovine Seurum Albumin DMSO: Dimethyl Sulfoxide EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid HPLC: High Performance Liquid Chromatography OD: Optical Density SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis TCA: Tricloacetic Acid UV: Ultra Violet PCMB: P-chloro-mercuribenzoic acid PMSF: Phenylmethane sulfonyl fluoride DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Xác định đường cong chuẩn tyrosine 17 Bảng 2.2 Xác định đường cong chuẩn protein 19 Bảng 2.3: Công thức pha gel tách (12%) 22 Bảng 2.4: Công thức pha gel cô (5%) 22 Bảng 3.1: Kiểm tra hoạt tính protease phân đoạn qua cột Sephadex G-100 29 Bảng 3.2: Kiểm tra hoạt tính protease phân đoạn qua cột DEAEcellulose 31 Bảng 3.3: Tóm tắt q trình tinh protease từ Xuân Hoa P.palatiferum 32 Bảng 3.4: Hoạt tính protease P palatiferum chất khác nhau………………………………………………………………………….36 Bảng 3.5: Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính P palatiferum protease………………………………………………………………………39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Hình Trang Hình 1.1: Cây Xuân Hoa P palatiferum Hình 3.1: Sơ đồ làm protease từ Xuân Hoa P palatiferum 27 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn protein protease từ Xuân Hoa sau qua cột lọc gel Sephadex G-100 29 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn protein protease từ Xuân Hoa sau qua cột trao đổi ion DEAE- cellulose 30 Hình 3.4: Điện di protein phân đoạn sau qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE- cellulose gel polyacrylamid 12% 33 Hình 3.5: Phát băng hoạt tính protease từ phân đoạn sau qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE- cellulose gel polyacrylamid 12.5% .33 Hình 3.6: Ảnh hưởng PMSF lên hoạt tính protease 34 Hình 3.7: Ảnh hưởng PCMB lên hoạt tính protease 34 Hình 3.8: Ảnh hưởng HgCl₂ lên hoạt tính protease 35 Hình 3.9: Ảnh hưởng O-phenanthroline lên hoạt tính protease 35 Hình 3.10: Độ bền nhiệt protease 37 Hình 3.11: Độ bền với pH protease 38 Hình 3.12: Hình ảnh kính hiển vi hàn gắn vết rạch nguyên bào sợi protease 40 Hình 3.13: Mức độ hàn gắn vết rạch protease nguyên bào sợi…… 41 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU  Đặt vấn đề Trong năm gần đây, việc ứng dụng protease Y học nhà khoa học giới quan tâm Các nghiên cứu cho thấy protease có hiệu kháng viêm, tiêu cục máu đơng, làm mau lành vết thương, chống tắc nghẽn mạch máu, chống ung thư, điều hòa miễn dịch… Các nghiên cứu trước cho thấy Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum ( Ness ) Radlk chứa hàm lượng lớn protease Cây Xuân Hoa P palatiferum ( Ness ) Radlk thuộc họ Ơrơ Acanthaceae dùng dân gian đễ chữa nhiều bệnh Trong năm gần đây, nhiều nhà khoa học Việt Nam giới xác minh số tác dụng sinh học thuốc như: kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng chống oxy hóa, giảm huyết áp, hạ đường huyết, ức chế acetylcholinesterase Tuy nhiên, việc nghiên cứu đặc tính tác dụng dược lý tập trung vào nhóm chất thứ cấp nhiều cơng dụng khác lưu truyền dân gian Xuân Hoa P palatiferum chưa chứng minh Cho đến chưa có nghiên cứu tác dụng hàn gắn vết thương protease từ thuốc Do vậy, tiến hành thực đề tài: “ Nghiên cứu hồn thiện quy trình tinh tác dụng hàn gắn vết thƣơng protease từ thuốc Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Ness) Radlk” Đề tài nghiên cứu góp phần bổ sung thơng tin khoa học thuốc quý Việt Nam  Mục tiêu nghiên cứu đề tài: - Hoàn thiện quy trình tinh protease từ Xuân Hoa P palatiferum Hoàng Thị Trang Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội - Xác định protease từ thuốc thuộc nhóm protease - Xác định tác dụng hàn gắn vết thương protease tinh từ thuốc  Nội dung đề tài: - Tinh protease từ thuốc Xuân Hoa P palatiferum (Ness) Radlk đạt hiệu cao - Xác định ảnh hưởng chất ức chế đặc hiệu lên hoạt tính protease tinh - Đánh giá độ bền protease với nhiệt độ, pH ion kim loại - Đánh giá khả thủy phân protease số chất khác - Đánh giá tác dụng hàn gắn vết thương protease in vitro Hoàng Thị Trang Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Kết hình 3.9 cho thấy o-phenanthroline khơng có ảnh hưởng đến hoạt tính protease Qua kết nghiên cứu trên, nhận thấy protease bị ức chế mạnh gần 90% hoạt tính protease PMSF (chất ức chế đặc hiệu nhóm serine protease), bị ức chế nhẹ khoảng 20-25% chất ức chế (PCMB HgCl2) (các chất ức chế đặc hiệu cho nhóm cysteine protease) không bị ức chế o-phenanthroline (chất ức chế đặc hiệu cho nhóm protease kim loại) Như kết luận protease tinh từ P palatiferum thuộc nhóm protease serine 3.4 Khả thủy phân protease chất khác Bảng 3.4 cho thấy protease P palatiferum có khả thủy phân chất casein, bovine serum albumin, gelatin and fibrinogen Protease Xuân Hoa P palatiferum không thủy phân BAPNA, chất đặc hiệu cho trypsin, thấy tính chất khác với enzyme tương tự trysin (Souza, 2007) Protease có khả thủy phân fibrinogen Với việc xác định protease thuộc nhóm serine protease chúng tơi nhận thấy enzyme có khả tiêu sợi fibrin số serine protease khác (Paik, 2007; Kim, 1996) Bảng 3.4 Hoạt tính protease P palatiferum chất khác Cơ chất Casein BAPNA Gelatin BSA Human fibrinogen Hoàng Thị Trang Hoạt tính protease P palatiferum Đặc tính Cơ chất chung cho nhiều loại protease Cơ chất cathepsin H/trypsin Cơ chất chung cho nhiều loại protease Cơ chất chung cho nhiều loại protease Thrombin-serine protease 36 Có Khơng có Có Có Có Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Trong khuôn khổ luận văn này, bước đầu khảo sát khả thủy phân protease tinh số chất khác Để so sánh, đánh giá cách xác hoạt độ protease chất cần có thời gian tối ưu điều kiện hoạt động enzyme chất Chúng tiếp tục nghiên cứu sâu thời gian tới 3.5 Độ bền protease Trong nghiên cứu trước đây, xác định protease có điều kiện tối ưu cho hoạt động (nhiệt độ: 70°C pH: pH 7,0) Trong luận văn này, chúng tơi đánh giá tính bền nhiệt, pH ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính protease tinh từ Xuân Hoa P palatiferum 3.5.1 Độ bền với nhiệt Tính bền nhiệt quan trọng cho việc ứng dụng enzyme công nghiệp Để nghiên cứu tính bền nhiệt protease Xuân Hoa P palatiferum, dịch enzyme ủ nhiệt độ khác từ 30-100°C 15 phút, sau đo hoạt tính Hình 3.10 Độ bền nhiệt protease Hoàng Thị Trang 37 Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Kết hình 3.10 cho thấy protease Xuân Hoa có độ bền nhiệt cao dải nhiệt độ 30-80°C, hoạt tính protease ổn định khơng giảm đáng kể so với dịch enzyme ban đầu Khi ủ dịch enzyme 90°C 10 phút protease gần bị biến tính hồn tồn, hoạt tính protease giảm mạnh khoảng 5% so với hoạt tính enzyme khơng xử lý nhiệt độ Enzyme thích hợp cho ứng dụng việc sản xuất quy mô lớn công nghiệp Y học 3.5.2 Độ bền với pH pH môi trường phản ứng yếu tố ảnh hưởng lớn tới độ bền enzyme Chúng tơi đánh giá tính bền protease khoảng từ pH 212 Ở vùng pH acid 2-3, protease hoạt tính hồn tồn Khi ủ protease pH 4-5 hoạt tính protease khoảng 55-60% Protease bền vùng pH 711, protease tinh từ Xuân Hoa P palatiferum có độ bền cao mơi trường pH kiềm, ( hình 3.11) Hình 3.11 Độ bền với pH protease Hoàng Thị Trang 38 Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 3.5.3 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính protease Bảng 3.5 Ảnh hƣởng ion kim loại lên hoạt tính P palatiferum protease Các ion kim loại Nồng độ Control % Hoạt tính lại 100 Ca²⁺ 5mM 91 Mg²⁺ 5mM 89 K⁺ 5mM 100 Na⁺ 5mM 100 Cu²⁺ 5mM 56.5 Pb²⁺ 5mM 68 Zn²⁺ 5mM 14.7 Kết bảng 3.5 cho thấy kim loại nhẹ K⁺, Ca²⁺, Na⁺, Mg²⁺ không ảnh hưởng đến hoạt tính protease từ Xuân Hoa P palatiferum Các ion kim loại nặng Cu²⁺, Pb²⁺ với nồng độ 5mM làm giảm khoảng nửa hoạt tính enzyme Riêng Zn²⁺ ảnh ảnh hưởng giảm mạnh hoạt tính protease 3.6 Đánh giá tác dụng làm lành vết thƣơng tế bào nguyên sợi da ngƣời Hoàng Thị Trang 39 Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội Đối chứng 0h Đối chứng 24h 24h điều trị với protease (100µg/ml) 24h điều trị với protease (50µg/ml) Hình 3.12 Hình ảnh kính hiển vi hàn gắn vết rạch nguyên bào sợi protease Khoảng cách vết rạch nguyên bào sợi xác định thời điểm 0, 4, 8, 12, 24, 48 sau tra mẫu protease nồng độ 0, 50, 100 µg/mL Kết chụp kính hiển vi cho thấy xâm lấn, tăng sinh nguyên bào sợi vào trung tâm vết rạch, khoảng cách vết rạch thu hẹp dần Tại thời điểm 24 sau tra thuốc, vết rạch thu hẹp đáng kể (hình 3.12; 3.13) Mức độ hàn gắn vết rạch xác định theo tỷ lệ phần trăm khoảng cách trung bình thời điểm quan sát sau so với thời điểm quan sát ban đầu (thời điểm sau tra thuốc) Tại thời điểm 4, 8, 12 sau tra protease khác biệt đáng kể khoảng cách vết rạch so với đối chứng Tại thời điểm 24 giờ, Hồng Thị Trang 40 Lớp 13 - 01 K20 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội giếng tra thuốc protease nồng độ 50 100 μg/mL có thu hẹp vết rạch có ý nghĩa so với đối chứng không tra thuốc thời điểm quan sát (p < 0.05) Protease bước đầu thể hiệu hàn gắn vết thương Hình 3.13 Mức độ hàn gắn vết rạch protease nguyên bào sợi  (sự khác có ý nghĩa so với nhóm đối chứng, p
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh sạch và tác dụng hàn gắn vết thương của protease từ cây thuốc xuân hoa pseuderanthemum palatiferum (ness) radlk , Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh sạch và tác dụng hàn gắn vết thương của protease từ cây thuốc xuân hoa pseuderanthemum palatiferum (ness) radlk , Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Võ Hoài Bắc phòng Sinh hóa Thực Vật, Viện công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ tôi tron..., PHẦN I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU, PHẦN III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN, Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi mới bước đầu khảo sát khả năng thủy phân của protease tinh sạch trên một số cơ chất khác nhau. Để so sánh, đánh giá một cách chính xác hoạt độ của protease trên từng cơ chất cần có thời gian tối ưu các điều kiệ..., Trong các nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã xác định được protease này có các điều kiện tối ưu cho hoạt động (nhiệt độ: 70 C và pH: pH 7,0). Trong luận văn này, chúng tôi đánh giá tính bền nhiệt, pH và ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tí..., ( (sự khác nhau có ý nghĩa so với nhóm đối chứng, p<0.05 ), TÀI LIỆU THAM KHẢO

Từ khóa liên quan

Mục lục

Xem thêm

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay