Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM GEL NANO BẠC TRONG VIỆC ỨC CHẾ MỘT SỐ BỆNH HẠI QUẢ ỔI SAU THU HOẠCH Giáo viên hướng dẫn : TS Bùi Kim Thúy Sinh viên thực : Nguyễn Thị Thu Trang Ngày sinh : 11/04/1995 Lớp : 13-01 Hà Nội – 2017 Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu, kết nêu khóa luận tốt nghiệp trung thực, xuất phát từ tình hình thực tế đơn vị thực tập Tác giả khóa luận tốt nghiệp Sinh viên Nguyễn Thị Thu Trang Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực Viện Cơ điện Nông Nghiệp Công nghệ Sau thu hoạch hướng dẫn T.S Bùi Kim Thúy Để hoàn thành luận văn này, cố gắng thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn thầy giáo, cô giáo, gia đình bạn bè xung quanh Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn T.S Bùi Kim Thúy tận tình hướng dẫn, bảo cho tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu Kiểm tra chất lượng sản phẩm nông sản - Viện Cơ điện Nông Nghiệp Công nghệ Sau thu hoạch tạo điều kiện sở vật chất trang thiết bị suốt trình thực đề tài để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội dạy dỗ dẫn dắt suốt thời gian học tập trường Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên giúp đỡ suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Trang Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ lược ổi thị trường ổi 1.1.1 Cây ổi 1.1.1.1 Nguồn gốc 1.1.1.2 Đặc điểm ổi 1.1.1.3 Các giống ổi 1.1.1.4 Điều kiện sinh thái 1.1.1.5 Công dụng ổi 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng sinh học 1.1.3 Tình hình phân bố, sản lượng, sản xuất tiêu thụ 12 1.1.3.1 Phân bố 12 1.1.3.2 Sản lượng tình hình sản xuất tiêu thụ ổi 13 1.1.3.3 Vị trí trái ổi ngành rau Việt Nam 14 1.1.4 Bao quả, thu hoạch, bảo quản 15 1.1.4.1 Bao 15 1.1.4.2 Thu hoạch 15 1.1.4.3 Bảo quản 15 1.2 Vai trò tính ứng dụng Gel nano bạc bảo quản 16 1.2.1 Giới thiệu Gel nano bạc 16 1.2.2 Vai trò tính ứng dụng Gel nano bạc 18 PHẦN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nguyên vật liệu 25 2.1.1 Đối tượng 25 2.1.2 Môi trường sử dụng 25 2.1.2.1 Môi trường phân lập bảo quản giống 25 2.1.2.2 Môi trường định tên 25 Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội 2.1.3 Hóa chất trang thiết bị 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu 26 2.2.2 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật 26 2.2.3 Phương pháp phân loại vi nấm 27 2.2.3.1 Các nguyên tắc chung 27 2.2.3.2 Quy trình định loại chủng vi nấm 27 2.2.3.3 Tiến hành định loại 28 2.2.4 Phương pháp nuôi cấy chủng kiểm tra 29 2.2.5 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật 29 2.2.6 Phương pháp xác định khả kháng vi sinh vật 30 2.2.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu 30 2.2.8 Khả ức chế nấm gây hại trực tiếp chế phẩm 31 2.2.8.1 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chủng giống 31 2.2.8.2 Phương pháp gây nhiễm nhân tạo 31 2.2.8.3 Phương pháp kiểm soát nấm mốc chế phẩm nồng độ khác 32 2.2.9 Phương pháp xử lý số liệu 32 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật gây hại ổi 33 3.2 Định tên chủng nấm gây hại ổi 34 3.3 Khả kháng nấm chế phẩm Gel nano bạc 35 3.4 Khả ức chế trực tiếp chế phẩm Gel nano bạc nấm gây hại ổi Đài Loan 37 PHẦN KẾT LUẬN 39 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 43 Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ A phoenicis Aspergillus phoenicis ĐC Đối chứng CT Công thức Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng ổi (xét với 100g phần ăn được) Bảng 3.1 Kết phân lập vi sinh vật gây hại ổi Đài Loan 33 Bảng 3.2 Khả kháng mốc chế phẩm Gel nano bạc 35 Bảng 3.3 Khả ức chế chế phẩm chủng nấm A phoenicis 36 Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc phân lập 34 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc phân lập được………………………………… 35 Hình 3.3 Cơ quan sinh bào tử bào tử Aspergillus phoenicis (x1000) 35 Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị Khả ức chế phát triển chủng A phoenicis 37 Đồ thị Tỷ lệ vết thương bị thối hỏng trình bảo quản 38 Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Rau thức ăn thiết yếu phần dinh dưỡng người Thành phần rau chủ yếu nước (80-90%), hàm lượng lipid thấp chứa nhiều chất xơ, khoáng, acid hữu cơ, chất thơm, đặc biệt vitamin C, A, E… Những thành phần góp phần làm tăng khả chuyển hóa thức ăn thể, làm tăng cân độ acid – kiềm máu dịch bào, nhờ độ pH thể ổn định Là nước nông nghiệp với nguồn thực vật phong phú chủng loại, nước ta có đủ loại rau suốt mùa năm, ưu ngành công nghiệp chế biến phát triển Trong năm gần đây, kinh tế nước tăng trưởng nhanh, đời sống nhân dân cải thiện, nhu cầu rau tăng lên nên sản xuất rau tăng trưởng nhiều Trong loại trái Việt Nam, trái ổi loại phổ biến điều khiện nước ta thích hợp cho việc sinh trưởng phát triển ổi Với phát triển kinh tế vườn, ổi chiếm diện tích đáng kể trái ổi sử dụng dừng lại dạng tươi, chưa có giá trị kinh tế cao, đặc biệt thời gian thu hoạch, ổi tiêu thụ không hết làm thiệt hại kinh tế nhà làm vườn trái ổi dễ bị hư hỏng sau thu hoạch không tiêu thụ kịp thời Trên giới Việt Nam, có phương pháp bảo quản ổi Việc nghiên cứu phương pháp bảo quản an toàn cho người tiêu dùng có hiệu chi phí bảo quản thấp vấn đề cần thiết Trong năm gần đây, nhiều nghiên cứu ứng dụng tập trung khai thác tính ức chế vi sinh vật vượt trội Gel nano bạc nông nghiệp Gel nano bạc sử dụng thuốc phòng trừ dịch hại cho trồng an toàn thân thiện với môi trường Safaa cộng (2015) nghiên cứu cơng bố khả phòng trừ hữu hiệu ốc sên số nấm bệnh hại trồng Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP 13-01 đĩa Ủ 250C 48 Công thức đối chứng không bổ sung chế phẩm thực giống cơng thức thí nghiệm Kiểm tra số khuẩn lạc công thức sau 48 Đánh giá khả ức chế quần thể VSV chế phẩm sử dụng công thức đây: % ức chế (%) = (C-T)/ C * 100 Trong đó: C số bào tử/khuẩn lạc công thức đối chứng (không sử dụng chế phẩm) T số bào tử/khuẩn lạc công thức thí nghiệm (có sử dụng chế phẩm) 2.2.8 Khả ức chế nấm gây hại trực tiếp chế phẩm 2.2.8.1 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chủng giống Chủng Aspergillus phoenicis phân lập từ thối hỏng ổi Đài Loan dùng để nghiên cứu Chủng phân lập nhân nuôi môi trường PDA 250C ngày Bào tử thu cách tráng nước tinh khiết bề mặt đĩa cấy Dung dịch cho thêm Tween 80 (0,05% khối lượng thể tích) để tạo nhũ Dịch ni cấy dùng để nghiên cứu có nồng độ 105 – 106 bào tử /ml Nồng độ xác định máy đếm bào tử 2.2.8.2 Phương pháp gây nhiễm nhân tạo Ổi đủ tiêu chuẩn thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên thành cơng thức, mối cơng thức gồm 10 quả, lặp lại lần Rửa qủa vòi nước chảy, để dùng sát trùng cồn 700 thời gian 10 phút, tráng lại nước cất vô trùng Sau khô bề mặt, vỏ làm tổn thương nhân tạo cách sử dụng kim nhỏ vô trùng tạo đường rạch dài 1cm sâu 2mm Trên quả, có số lượng vết thương, vết có đường rạch Cấy dịch bào tử nấm vào vết thương Dịch huyền phù bào tử nấm với mật số 1,75 x106 bào tử/ml Sau cấy bào tử, qủa xếp lớp vào rổ nhựa Từng rổ lại đặt vào túi ủ nhiệt độ phòng 6h trước phủ Nguyễn Thị Thu Trang 31 Lớp: CNTP 13-01 vết với cơng thức có nồng độ chế phẩm Gel nano bạc khác 2.2.8.3 Phương pháp kiểm soát nấm mốc chế phẩm nồng độ khác Mục đích phương pháp xác định nồng độ tối ưu chế phẩm để kiểm soát nấm mốc Aspergillus phoenicis Xử lý 10 cho cơng thức thí nghiệm Quả sau 24 gây nhiễm nấm mốc lô xử lý cách nhúng vào chế phẩm Gel nano bạc nồng độ khác (6%, 8%, 10%, 12%) Quả sau xử lý đem bảo quản điều kiện thường (250C) Mỗi nồng độ tương ứng với cơng thức thí nghiệm Các cơng thức khác tỷ lệ chế phẩm Gel nano bạc gồm: Công thức Nồng độ chế phẩm Thời gian (phút) ĐC CT1 6% CT2 8% CT3 10% CT4 12% Kiểm tra phát triển nấm mốc công thức 10 ngày Chỉ tiêu đánh giá tính chất kháng nấm Gel nano bạc tỷ lệ vết thương bị mốc tổng số vết gây nhiễm nhân tạo 2.2.9 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu phân tích sử dụng Hệ thống Phân tích Thống kê SAS version 610 Phân tích giả thiết thống kê theo ANOVA thực để xác định hiệu xử lý phụ thuộc vào biến số hầu hết thí nghiệm áp dụng Các giá trị trung bình so sánh LSD (sự khác biệt có ý nghĩa nhỏ nhất) mức P 8% quần thể) Từ kết cho thấy, Gel nano bạc nồng độ từ 6% bắt đầu có khả ức chế nấm A phoenicis hiệu ứng yếu Khi nồng độ chế phẩm tăng lên khả ức chế tăng lên Điều thể rõ đánh giá khả kháng nấm chế phẩm khuếch tán đĩa thạch thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Khả ức chế chế phẩm chủng nâm A phoenicis Nồng độ chế phẩm (%) Đường kính vòng ức chế trung bình (D-d, mm) 0,0 0,5 1,7 10 2,2 12 4,6 14 8,4 Khả kháng nấm thể đường kính vòng ức chế xuất xung quanh giếng thạch có chứa chế phẩm Gel nano bạc Quan sát vòng tròn ức chế đĩa thạch thí nghiệm cho thấy có xuất vòng ức chế A phoenicis nồng độ 6% chế phẩm Kích thước vòng ức chế lớn thể khả ức chế cao chế phẩm Thể hiện, đường kính vòng ức chế tăng từ 0,5 mm lên đến 8,4 mm nồng độ chế phẩm tăng từ 6% lên 14% Để đánh giá khả ức chế Gel nano bạc chủng nấm mốc cách xác nhằm tìm nồng độ thấp có khả ức chế hồn tồn quần thể, chúng tơi tiến hành thí nghiệm Nguyễn Thị Thu Trang 36 Lớp: CNTP 13-01 đánh giá % ức chế mô tả phần phương pháp Kết thu thể đồ thị Đồ thị Khả ức chế phát triển chủng A phoenicis 3.4 Khả ức chế trực tiếp chế phẩm Gel nano bạc nấm gây hại ổi Đài Loan Để khảo sát hiệu bảo quản ổi Đài Loan việc giảm tỷ lệ thối hỏng chế phẩm Gel nano bạc, tiến hành thí nghiệm gây nhiễm nhân tạo ổi sử dụng chế phẩm phủ lên vết thương ức chế phát triển nấm A phoenicis, kết thể đồ thị Nguyễn Thị Thu Trang 37 Lớp: CNTP 13-01 Đồ thị Tỷ lệ vết thương bị thối hỏng trình bảo quản Qua đồ thị nhận thấy công thức ĐC bắt đầu nhiễm bệnh sau ngày bảo quản tỷ lệ thối hỏng tăng lên nhanh ngày thứ 10 nấm mốc phát triển gây hỏng hồn tồn Các cơng thức có xử lý chế phẩm Gel nano bạc khả phát triển nấm bị chậm Công thức xử lý 8% chế phẩm bắt đầu xuất nấm hại ngày thứ mức độ Còn cơng thức xử lý 12% ngày thứ thấy nấm mọc, ngày thứ 10 tỷ lệ thối hỏng 4,3% Công thức xử lý 14% không thấy nấm mọc, điều chứng tỏ chế phẩm nồng độ ức chế hồn tồn sinh trưởng nấm A.phoenicis Như vậy, chế phẩm Gel nano bạc nồng độ 12% trở lên ức chế tốt nấm A.phoenicis sinh trưởng phát triển Nguyễn Thị Thu Trang 38 Lớp: CNTP 13-01 PHẦN KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu thu được, rút số kết luận sau: - Đã phân lập định loại chủng vi sinh vật gây hại ổi Đài Loan chủng nấm Aspergillus phoenicis - Đã khảo sát đánh giá khả ức chế chế phẩm Gel nano bạc tìm nồng độ ức chế tối thiểu 12% chế phẩm chủng nấm mốc A.phoenicis - Đánh giá khả ức chế trực tiếp chế phẩm Gel nano bạc nấm A.phoenicis gây hại ổi Đài Loan cho thấy nồng độ 12% nồng độ ức chế tốt chủng nấm Như khẳng định chế phẩm Gel nano bạc nồng độ 12% có khả kiểm sốt tốt nấm mốc gây hại ổi Nguyễn Thị Thu Trang 39 Lớp: CNTP 13-01 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Dỗn Diên Hóa sinh thực vật, Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội 1993 Nguyễn Kim Vũ (chủ biên), Phạm Đức Việt, Nguyễn Duy Đức, Nguyễn Duy Lâm Kết nghiên cứu khoa học công nghệ sau thu hoạch năm 2011, Viện Công nghệ Sau thu hoạch, Bộ Nông Nghiệp phát triển Nông thôn, Hà Nội 2002 Trần Minh Tâm Bảo quản chế biến nông sản sau thu hoạch, Nhà xuất Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh 1997 Hà Văn Thuyết, Trần Quang Bình Bảo quản rau tươi bán chế phẩm, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 2000 Qch Đình Nguyễn Văn Tiếp Nguyễn Văn Thoa Cơng nghệ sau thu hoạch chế biến rau 1996 Trần Văn Chương Công nghệ bảo quản chế biến nông sản sau thu hoạch Nguyễn Mạnh Khải Bảo Quản Nông Sản Nhà xuất Giáo Dục Tiếng nước Baier A.C (2009) Regulating nanosilver as a pesticide Environmental Defense Fund, February 12 Kim H.S., Kang H.S., Chu G.J and Byun H.S (2008) Antifungal effectiveness of nanosilver colloid against rose powdery mildrew in greenhouses Solid State Phenomena, 135: 15-18 Kim S.W., Jungg J.H., Lamsal K., Kim Y.S., Min J.S and Lee Y.S (2012) Antifungal effects of silver nanoparticles (AgNPs) against various plant pathogenic fungi Mycobiology, 40: 53-58 Lamsal K., Kim S.W., Jung J.H., Kim Y.S., Kim K.S and Lee Y.S (2011a) Inhibition effects of silver nanoparticles against powdery mildews on cucumber and pumpkin Mycobiology, 39: 26-32 Nguyễn Thị Thu Trang 40 Lớp: CNTP 13-01 Lamsal K., Kim S.W., Jung J.H., Kim Y.S., Kim K.S and Lee Y.S (2011b) Application of silver nanoparticles for the control of Collectotrichum species in vitro and pepper anthracnose disease in field Mycobiology, 39: 194-199 Min J.S., Kim K.S., Kim S.W., Jung J.H., Lamsal K., Kim S.B., Jung M And Lee Y.S (2009) Effects of colloidal silver nanoparticles on sclerotium-forming phytopathogenic fungi Journal of Plant Pathology, 25: 376-380 Prathap M., Alagesan A., Ranjitha Kumari B.D (2014) Antibacterial activities of silver nanoparticles synthesized from plant leaf extract of Abutilon indicum (L.) Sweet J Nanostruct Chem 4:106 Safaa M Ali, Naeima M.H.Yousef, and Nivien A Nafady Application of biosynthesized silver nanoparticles for the control of land snail Eobania vermiculata and some plant pathogenic fungi Journal of Nanomaterials, volume 2015, article ID 218904 Samuel U and Guggenbichler J.P (2004) Prevention of catheterrelated infections: the potential of a new nanosilver impregnated catheter International Journal of Antimicrobial Agents, 23, Supplement 1: 75-78 10 Sharma K., Sharma R., Shit S And Gupta S (2012) Nanotechnological application on diagnosis of a plant disease International Conference on Advances in Biological and Medical Sciences (ICABMS, 2012) July 15-16, 2012 Singapore 11 Samson, James A R (1986) Tropical Fruits (Tropical Agriculture Series) (ấn 2.) London: Prentice Hall 12 Rätsch, Christian (1998) Enzyklopädie der psychoaktiven Pflanzen Botanik, Ethnopharmakologie und Anwendungen (ấn 3.) Aarau: AT 13 Baumann, Thomas W (2007) Tropenfrucht Ein Streifzug durch eine Finca in Costa Rica zum 150 Geburtstag von Henri Pittier (1857-1950) Nguyễn Thị Thu Trang 41 Lớp: CNTP 13-01 Flurlingen: villacoffea 14 Bernd Nowak, Bettina Schulz, Bernd; Schulz, Bettina (1998) Tropische Früchte: Biologie, Anbau und Ernte München: BLV Nguyễn Thị Thu Trang 42 Lớp: CNTP 13-01 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết ức chế Aspergillus phoenicis chế phẩm Gel nano bạc nồng độ 12% sau ngày đĩa thạch Nguyễn Thị Thu Trang 43 Lớp: CNTP 13-01 Phụ lục 2: Kết ức chế chế phẩm Gelnano bạc công thức sau ngày xử lý (ĐC: Không xử lý CP; CT1: xử lý 6% Gel nano bạc; CT2: 8% Gel nano bạc; CT3: 10% Gel nano bạc; CT4: 12% Gel nano bạc) Nguyễn Thị Thu Trang 44 Lớp: CNTP 13-01 Phụ lục 3: Một số hình ảnh ổi Nguyễn Thị Thu Trang 45 Lớp: CNTP 13-01 ... đích đánh giá hiệu ức chế vi sinh vật chế phẩm, tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm Gel nano bạc việc ức chế số bệnh hại ổi sau thu hoạch Mục tiêu nghiên cứu Phân lập định tên... vật gây hại ổi Đài Loan, từ xác định liều lượng thích hợp chế phẩm Gel nano bạc việc ức chế vi sinh vật gây hại ổi sau thu hoạch Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng vi sinh vật gây hại ổi - Định... Định tên chủng nấm gây hại ổi - Đánh giá khả kháng nấm chế phẩm Gel nano bạc đĩa thạch - Đánh giá khả ức chế trực tiếp chế phẩm Gel nano bạc nấm gây hại ổi Đài Loan Nguyễn Thị Thu Trang Lớp: CNTP