Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA METAGENOME HỆ VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ Người hướng dẫn :TS Nguyễn Thị Trung Sinh viên thực hiện :Nguyễn Bảo Hân Lớp :1302.K20 HÀ NỘI - 2017 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA METAGENOME HỆ VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ Giáo viên hướng dẫn : TS.Nguyễn Thị Trung Sinh viên thực hiện : Nguyễn Bảo Hân Lớp : 1302 – K20 Hà Nội - 2017 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã trang bị kiến thức cho em suốt quá trình học tập Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Trung - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tận tình và hướng dẫn em những kiến thức và phương pháp nghiên cứu suốt quá trình thực khóa luận này Em xin cảm ơn GS.TS Trương Nam Hải, TS Đỗ Thị Huyền, Thạc sĩ Lê Ngọc Giang và các anh chị Phòng Kĩ thuật Di truyền - Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho em thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, các anh chị và các bạn, những người động viên quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất cũng tinh thần giúp em hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Bảo Hân Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học MỤC LỤC BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT I DANH MỤC HÌNH II DANH MỤC BẢNG III LỜI MỞ ĐẦU A Lý chọn đề tài B Mục tiêu C Ý nghĩa thực tiễn PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chung sự tiêu hóa ở mợt số đợng vật nhai lại 1.1.1 Khái niệm động vật nhai lại 1.1.2 Cấu trúc hệ tiêu hóa đợng vật nhai lại 1.1.2.1 Cấu trúc chung hệ tiêu hóa đợng vật nhai lại 1.1.2.2 Cấu trúc hệ tiêu hóa dê 1.1.2.3 Sự nhai lại 1.1.3 Cấu trúc hệ vi sinh vật hệ tiêu hóa đợng vật nhai lại 1.1.3.1 Vi khuẩn 1.1.3.2 Động vật nguyên sinh 1.1.3.3 Nấm 10 1.2 Tổng quan DNA metagenome 10 1.2.1 Các khái niệm DNA metagenome 10 1.2.1.1 Khái niệm metagenome 10 1.2.1.2 Khái niệm metagenomic 11 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 1.2.2 Khái niệm thư viện DNA metagenome 12 1.3 Tổng quan tách chiết tinh sạch DNA metagenome 13 1.3.1 Tổng quan một số phương pháp tách chiết DNA metagenome 13 1.3.1.1 Phương pháp Repeated bead beating plus column (RBBC) 13 1.3.1.2 Phương pháp Repeated bead beating (RBB) 14 1.3.1.3 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) 14 1.3.1.4 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) 14 1.3.1.5 Phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) 14 1.3.2 Tổng quan một số phương pháp tinh sạch DNA metagenome 15 1.3.2.1 Tinh sạch phương pháp điện di gel 15 1.3.2.2 Tinh sạch cột ly tâm (cột tinh sạch DNA) 15 1.3.2.3 Tinh sạch túi thẩm tích (màng bán thấm) 16 1.3.3 Xác định độ sạch DNA 16 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.1.1 Vật liệu 18 2.1.2 Hóa chất, vật tư nghiên cứu 18 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu dịch dạ cỏ dê 20 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA metagenome 22 2.2.2.1 Phương pháp Repeated bead beating plus column (RBBC) 22 2.2.2.2 Phương pháp Repeated bead beating (RBB) 24 2.2.2.3 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) 24 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 2.2.2.4 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) 26 2.2.2.5 Phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) 26 2.2.3 Kiểm tra chất lượng và tính toàn vẹn DNA metagenome 27 2.2.4 Nhân bội PCR với cặp mồi 16S rDNA vi khuẩn 29 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Thu thập mẫu vi sinh từ dạ cỏ dê 31 3.1.1 Thu mẫu dạ cỏ dê 31 3.1.1.1 Hình ảnh mơi trường sống loài dê thu mẫu 31 3.1.1.2 Thu dạ cỏ dê 33 3.1.2 Thu mẫu vi sinh từ dạ cỏ dê 34 3.2 Tách chiết DNA metagenome 35 3.2.1 Tách chiết DNA metagenome phương pháp sử dụng hạt thủy tinh (RBB) 36 3.2.2 Tách chiết DNA metagenome phương pháp sử dụng hạt thủy tinh và tinh sạch cột Qiagen (RBBC) 36 3.2.3 Tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) 37 3.2.4 Tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) 38 3.2.5 Tách chiết DNA metagenome phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) 39 3.3 Tinh sạch DNA metagenome 40 3.4 Đánh giá chất lượng mẫu 40 3.5 Đánh giá khả tồn tại chất ức chế polymerase mẫu DNA metagenome 42 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 3.6 Tách chiết đủ khối lượng DNA metagenome phương pháp PSP1 44 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ETDA Ethylendiamin Tetraacetic Acid DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease dNTPs Deoxyribonucleotides OD Optical Density PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi) PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis RNase Ribonuclease rRNA Ribosomal Ribonucleic Acid SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris- acetate- EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine Taq Polymerase Thermus aquaticus TE Tris- EDTA Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 I Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo dạ dày kép gia súc nhai lại Hình 1.2 Cấu trúc hệ tiếu hóa dê Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp thu mẫu vi khuẩn từ dịch dạ cỏ dê 21 Hình 3.1 Dê cỏ núi ở Ninh Bình 31 Hình 3.2 Dê Bách Thảo 32 Hình 3.3 Dê Lai Boer 33 Hình 3.4 Hình thái vị trí lấy mẫu 33 Hình 3.5 Hình thái mẫu vi sinh vật thu từ các vùng tương ứng dạ cỏ dê 34 Hình 3.6 DNA metagenome tách chiết phương pháp sử dụng hạt thủy tinh RBB 36 Hình 3.7 DNA metagenome tách chiết phương pháp sử dụng hạt thủy tinh RBB và tinh sạch cột Qiagen 37 Hình 3.8 DNA metagenome tách chiết phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) 38 Hình 3.9 DNA metagenome tách chiết phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) 38 Hình 3.10 DNA metagenome tách chiết phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) 39 Hình 3.11 Sản phẩm PCR khuếch đại gen mã cho 16s rDNA các mẫu DNA thu từ các phương pháp tách chiết khác 43 Hình 3.12 Kết điện di kiểm tra mẫu DNA metagenome tách phương pháp PSP1 45 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 II Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị nghiên cứu sử dụng đề tài 19 Bảng 2.2 Trình tự mồi 16s rDNA 29 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 30 Bảng 3.1 Đặc điểm thức ăn tìm thấy các khoang, giá trị pH và nhiệt độ 35 Bảng 3.2 Nồng độ và độ tinh sạch DNA metagenome sử dụng các phương pháp tách chiết khác 41 Bảng 3.3 Kết đo quang phổ 10 mẫu DNA metagenome ngẫu nhiên tách chiết phương pháp PSP1 46 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 III Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học ở Hình 3.7 cho thấy DNA metagenome thu có kích thước lớn 10 kb Sau DNA tách chiết phương pháp sử dụng hạt thủy tinh RBB, DNA metagenome tinh sạch cột Qiagen Kết nhận các băng DNA rõ nét, các vệt DNA không còn nhiều màng cột tinh sạch giữ lại chủ yếu DNA kích thước lớn Hình 3.7 DNA metagenome tách chiết phương pháp sử dụng hạt thủy tinh RBB tinh sạch cột Qiagen Đường chạy 1: Lần tách thứ 1, 2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, M: Thang chuẩn DNA 1kb (Fermentas) 3.2.3 Tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) Mẫu vi sinh vật thu từ dạ cỏ tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP1 Kết DNA metagenome tách chiết điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.8) Kết điện di ở Hình 3.8 cho thấy DNA metagenome thu có kích thước lớn 10 kb Các băng DNA thu ở các lần tách chiết rất tập trung kích thước, rõ nét Không thấy vệt DNA bị đứt gãy hình ảnh điện di Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 37 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 10 kb Hình 3.8 DNA metagenome tách chiết phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP1) Đường chạy 1: Lần tách thứ 1, 2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, M: Thang chuẩn DNA 1kb (Fermentas) 3.2.4 Tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) Mẫu vi sinh vật thu từ dạ cỏ tách chiết DNA metagenome phương pháp PSP2 Kết DNA metagenome tách chiết điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.9) 10 kb Hình 3.9 DNA metagenome tách chiết phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol (PSP2) Đường chạy 1: Lần tách thứ 1, 2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, M: Thang chuẩn DNA 1kb (Fermentas) Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 38 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học Kết điện di ở Hình 3.9 cho thấy DNA metagenome thu có kích thước lớn 10 kb Tương tự tách phương pháp SPS1, kết thu nhận các băng DNA từ phương pháp SPS2 là rất tốt Tuy nhiên, ở dải kích thước băng DNA từ 1-5kb xuất một phông bắt màu, chứng tỏ có DNA bị đứt gãy số lượng khơng nhiều 3.2.5 Tách chiết DNA metagenome phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) Mẫu vi sinh vật thu từ dạ cỏ tách chiết DNA metagenome phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) Kết DNA metagenome tách chiết điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.10) 10 kb Hình 3.10 DNA metagenome tách chiết phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) Đường chạy 1: Lần tách thứ 1, 2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, M: Thang chuẩn DNA 1kb (Fermentas) Kết điện di ở Hình 3.10 cho thấy DNA metagenome thu có kích thước lớn 10 kb Các băng DNA metagenome thu từ các lần tách chiết tập trung không sắc nét Chứng tỏ lượng DNA thu không nhiều Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 39 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 3.3 Tinh DNA metagenome Ban đầu chúng em dự kiến sử dụng phương pháp bẫy máng tinh sạch kit tinh sạch để tinh sạch DNA metagenome thu Từ các kết DNA metagenome thu nhận phân tích điện di gel agarose, chúng quyết định không tiếp tục tinh sạch thêm DNA metagenome nữa Thực phương pháp tách chiết mà chúng đã sử dụng có tới phương pháp đã sử dụng cột để tinh sạch DNA metagenome tách chiết Do đó, hình ảnh điện di (Hình 3.7, Hình 3.8, Hình 3.9 và Hình 3.10) cho thấy các băng DNA metagenome thu có kích thước lớn 10 kb Băng DNA metagenome thu rõ nét, không thấy có các dải DNA đứt gãy ở phía dưới Riêng kết ở Hình 3.9 có mợt lượng nhỏ DNA bị đứt gãy, nhiên số lượng này tiên đoán là không nhiều Đối với kết ở Hình 3.6 là DNA metagenome tách phương pháp sử dụng hạt thủy tinh không sử dụng các cợt tinh chế thu rất nhiều DNA Nhưng DNA metagenome bị đứt gãy không còn nguyên vẹn bị lẫn mợt số tạp chất nào Các băng DNA thu tồn tại ở trạng thái cưa và kéo đuôi thành một vệt đến vị trí kb Tuy nhiên, sử dụng cột QIA để tinh sạch sản phẩm DNA metagenome này các băng đứt gãy, lẫn tạp chất đã bị loại bỏ, có phần DNA tương đối nguyên vẹn thu lại (Hình 3.7) 3.4 Đánh giá chất lượng mẫu Các mẫu DNA metagenome lượng DNA cũng các số A260/280 và A260/230 thu sử dụng các phương pháp tách chiết khác kiểm tra máy Nanodrop (Bảng 3.2) Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 40 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Bảng 3.2: Nồng độ và độ tinh sạch DNA metagenome sử dụng phương pháp tách chiết khác Phương Nồng độ DNA pháp metagenome (ng/µl) RBBC A260/280 A260/230 61,70 ± 28,84 1,930 ± 0,111 2.097 ± 0,387 RBB 143,5 ± 20,51 1,878 ± 0,011 1,462 ± 0,008 PSP1 149,7 ± 29,94 1,921 ± 0,031 1,832 ± 0,394 PSP2 195,5 ± 98,29 1,893 ± 0,001 1,902 ± 0,020 QIA 55,93 ± 42,34 1,887 ± 0,096 1,797 ± 0,677 Nồng độ DNA thu cao đáng kể tách chiết kit PSP, lần lượt là 149,7 và 195,5 ng/µl cho protocol và và phương pháp RBB là 143,5 ng/µl Tuy nhiên, đối với DNA tách chiết phương pháp RBB sau sử dụng cợt tinh sạch QIAgen (RBB+C) nồng độ DNA metagenome đã bị giảm hai lần Nồng độ DNA thu từ phương pháp RBBC ở mẫu DNA metaenome vi khuẩn ruột dê không cao mẫu mà Yu và Morrison đã tách chiết [31] Nồng độ DNA tách chiết trực tiếp theo kit QIAgen thấp nhất so với các phương pháp còn lại, kết này tương ứng với kết một số nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA từ dịch dạ cỏ động vật nhai lại khác [12], [5] Dịch dạ cỏ dê cũng các động vật ăn cỏ khác chứa nhiều tạp chất có nguồn gốc từ thực vật tannin, saponin, mimosine và nitrate-nitrite Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 41 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học [16] Trong đó, tannin và mợt số hợp chất chứa nhóm phenol tự có khả ảnh hưởng đến hiệu sử dụng DNA tách chiết cho các mục đích sinh học phân tử PCR, cắt giới hạn và giải trình tự ức chế hoạt động enzyme polymerase endonuclease [26], [20] Do đó, ngoài hàm lượng DNA, chất lượng DNA tách chiết còn xác định dựa các số A260/230 (xác định sự có mặt carbohydrate, hợp chất chứa nhóm phenol) và A260/280 (cho protein) DNA cho là “sạch” nếu số A260/280 1,8 và A260/230 2,0 (có thể chấp nhận từ 1,5 đến 1,8) Tất các phương pháp tách chiết DNA metagenome sử dụng cho nghiên cứu này cho kết số A260/280 1,8 DNA tách chiết cũng đạt tiêu chuẩn hàm lượng carbohydrate và hợp chất phenol mẫu, có phương pháp RBB cho kết A260/230 thấp (1,462) Điều này cho thấy, các phương pháp có khả loại bỏ protein quá trình tách chiết phương pháp có sử dụng cợt tinh sạch mới có thể loại bỏ đáng kể các hợp chất không mong muốn khác mẫu DNA tách chiết từ dạ cỏ dê Như vậy, DNA tách chiết từ các phương pháp RBBC, sử dụng kit thương mại PSP QIAgen đạt tiêu chuẩn độ tinh sạch ở hai số A260/280 và A260/230 3.5 Đánh giá khả tồn chất ức chế polymerase mẫu DNA metagenome Để khẳng định chắn DNA thu có thể sử dụng để giải trình tự phục vụ mục đích khai thác dữ liệu DNA metagenome, chúng tiến hành thực khuếch đại gen mã cho 16S rRNA vi khuẩn PCR với cặp mồi 1527R-27F đối với DNA thu từ các phương pháp tách chiết sau đưa cùng nồng độ Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose tương ứng với dự đoán Chúng tơi quan sát thấy có băng sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1500 bp ở tất các mẫu DNA trừ mẫu tách chiết phương Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 42 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học pháp RBB Điều này phản ánh đúng kết đo số A260/230, chứng tỏ mẫu còn chứa nhiều tạp chất ảnh hưởng tới hiệu PCR Hình 3.11 Sản phẩm PCR khuếch đại gen mã cho 16s rDNA mẫu DNA thu từ các phương pháp tách chiết khác Đường chạy 1: Lần tách thứ 1, 2: lần tách thứ 2, 3: lần tách thứ 3, PC: đối chứng dương, M: Thang chuẩn DNA 1kb (Fermentas) Kết quả, DNA metagenome tách từ năm phương pháp có số A260/280 đạt 1,8 Mặc dù phương pháp RBB cho nồng độ DNA cao không tinh chế nên DNA từ mẫu này có số A260/230 thấp, đạt khoảng 1,4 và mẫu vẫn còn chất ức chế Taq polymerase Mẫu tách từ RBB sau tinh sạch lại cợt Qiagen có số A260/230 tăng lên đáng kể, đạt khoảng 2,0 và không còn chất ức chế Taq polymerase hàm lượng cũng nồng độ DNA metagenome giảm 57% và đạt gần tương đương với DNA metagenome tách QIA Phương pháp sử dụng kit tách chiết PSP®Spin Stool DNA cho nồng độ DNA metagenome thu cao nhất (từ 149,7 đến 195,5 ng/µl), số A260/280 đạt khoảng 1,9 A260/230 đạt 1,8-1,9, không còn chất ức chế Taq polymerase và tiêu tốn ít Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 43 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học thời gian Vì vậy, là phương pháp thích hợp cho tách chiết DNA metagenome vi khuẩn ruột dê DNA thu từ phương pháp này đủ chất lượng cho việc giải trình tự thiết bị giải trình tự DNA thế hệ mới Illumina Tóm lại, các phương pháp mang lại hiệu tách chiết nhất định Trong đó, các phương pháp RBBC, PSP1, PSP2 và QIA cho kết thu DNA đạt tiêu chuẩn đợ tinh sạch, có thể sử dụng cho các thí nghiệm sau PCR, cắt giới hạn giải trình tự Xét hiệu tách chiết, thực phương pháp RBBC cần từ 20 đến 30 phút sử dụng kit tinh sạch thương mại tiêu tốn ít thời gian hàm lượng DNA thu tương đương cao 3.6 Tách chiết đủ khối lượng DNA metagenome phương pháp PSP1 Để giải trình tự thiết bị giải trình tự DNA thế hệ mới Illumina cần lượng DNA ít nhất 50 µg Như để đủ lượng DNA metagenome chúng đã sử dụng phương pháp PSP1 để tách chiết DNA metagenome Các mẫu tách riêng lẻ kiểm tra điện di gel agarose 0,8%, đo nồng độ và tính độ sạch trước chuyển chung vào một ống lưu trữ Kết ở Hình 3.12 minh họa một số lần tách chiết DNA metagenome vi sinh vật từ dịch dạ cỏ dê phương pháp PSP1 Kết đo nồng độ và độ sạch các mẫu tương ứng trình bày bảng 3.3 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 44 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 10 kb Hình 3.12 Kết điện di kiểm tra mẫu DNA metagenome tách phương pháp PSP1 Đường chạy 1-10: 10 mẫu DNA metagenome từ 10 lần tách chiết, chạy µl dịch DNA metagenome cho giếng, M: Thang chuẩn DNA 1kb (Fermentas) Sản phẩm DNA metagenome hệ vi sinh vật dạ cỏ dê tách chiết lượng lớn phương pháp PSP1, tiến hành điện di kiểm gel agarose 0.8% Nhìn vào hình ảnh kết điện di nhận thấy đường chạy 10 mẫu DNA metagenome từ hệ vi sinh vật dạ cỏ dê x́t mợt băng đậm có kích thước 10kb Các băng điện di rất sáng, tập trung và ít bị phân cắt Điều này chứng tỏ khơng có DNA bị đứt gãy quá trình tinh sạch Như vậy, chúng em đã tách chiết và tinh sạch DNA metagenome gần toàn vẹn Kết đo mẫu cho thấy tất các các mẫu đạt độ tinh sạch A260/280 1.9 (yêu cầu tối thiếu cao 1.8) Nồng độ DNA các mẫu thu phần lớn khoảng từ 100 đến 200 ng/µl Tổng lượng DNA metagenomic đã tinh sạch là 50 µg Do đó, mẫu DNA metagenome vi Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 45 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học khuẩn dạ cỏ dê chúng tơi đã đạt tiêu ch̉n để thực quá trình giải trình tự Bảng 3.3 Kết đo quang phổ 10 mẫu DNA metagenome ngẫu nhiên tách chiết phương pháp PSP1 Mẫu Nồng độ (ng/ul) A260/280 214 ± 16,97 1,966 ± 0,00071 156,5 ± 38,89 1,933 ± 0,03111 152,5 ± 6,364 1,965 ± 0,01485 166,5 ± 2,121 1,956 ± 0,003536 117,5 ± 9,192 1,967 ± 0,002121 216 ± 12,73 1,964 ± 0,01697 77 ± 35,36 1,962 ± 179 ± 15,56 1,951 ± 0,004243 181,5 ± 14,85 1,959 ± 0,03465 10 259 ± 21,21 1,963 ± 0,007778 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 46 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học KẾT LUẬN Chúng em đã thử nghiệm phương pháp khác là RBB, RBBC, PSP1, PSP2 và QIA để tách chiết DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê Kết cho thấy: Tất các phương pháp tách chiết RBB, RBBC, PSP1, PSP2 QIA tách DNA metagenome Các phương pháp tách chiết RBBC, PSP1, PSP2 và QIA đã thu DNA metagenome có nồng đợ cao, đợ sạch đảm bảo Tách chiết kit PSP cho sản phẩm DNA có chất lượng đảm bảo cho giải trình tự DNA metagenome hệ thống HiSeq 2000 (Illumina) với số A260/280 là 1,893; A260/230 là 1,902 và nồng độ cao nhất đạt 195,5 ng/µl Sử dụng phương pháp PSP1 đã tách chiết 50 µg DNA metagenome vi sinh vật từ dã cỏ dê đủ chất lượng để giải trình tự gen Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 47 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Dê Bách Thảo, Wikipedia tiếng Việt (2015) Dê cỏ, Wikipedia tiếng Việt (2015) Dê lai Boer, Wikipedia tiếng Việt (2015) Tài liệu tiếng Anh Allen, Eric E., and Jillian F Banfield (2005) "Community genomics in microbial ecology and evolution." Nature Reviews Microbiology 3.6: 489498 Chen K, Pachter L (2005) Bioinformatics for Whole-Genome Shotgun Sequencing of Microbial Communities PLoS Comput Biol 1(2): e24 doi:10.1371/journal.pcbi.0010024 Cowan D, Meyer Q, Stafford William, Muyanga S, Cameron R, Wittwer P (2005), Metagenomic gene discovery: past, present and future, TRENDS in Biotechnology, 23(6), 321-329 Cunha IS, Barreto CC, et al (2011), Bacteria and Archaea community structure in the rumen microbiome of goats (Capra hircus) from the semiarid region of Brazil, Anaerobe, 17 (3), pp 118-124 Czerkawski JW, and Cheng KJ, (1988), Compartmentation in the rumen, in The rumen microbial ecosystem, Elsevier Science Publishing, London, pp 361- 385 Dehority BA, Grubb AJ, (1980), Effect of Short-Term Chilling of Rumen Contents on Viable Bacterial Numbers, Appl Environ Microbiol 39(2), pp Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 48 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ sinh học 376–381 10 Flint HJ, Thomson AM, (1990), Deoxyribonuclease activity in isolated rumen bacteria and rumen fluid Lett Appl Microbiol 11, pp 18-21 11 Handelsman J, Rondon M R, Brady S F, Clardy J, Goodman R M (1998) Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products Chem Biol.; 5:R245–R249 12 Henderson G, Cox F, Kittelmann S, Miri VH, Zethof M, Noel SJ, Waghorn GC, Janssen PH (2013) Effect of DNA extraction methods and sampling techniques on the apparent structure of cow and sheep rumen microbial communities PLoS ONE 9:e74787 13 Hultman J, Auvinen P, (2010), Metagenomics opens up new frontiers in microbiology, duodecim, 126(11), 1278-1285 14 Jami E, Israel A, Kotser A, Mizrahi I, (2013), Exploring the bovine rumen bacterial community from birth to adulthood, The ISME journal, (6), pp 1069-1079 15 Jenkins T, Wallace R, Moate P, Mosley E, (2008), Board-invited review: Recent advances in biohydrogenation of unsaturated fatty acids within the rumen microbial ecosystem, Journal of animal science, 86 (2), pp 397-41 16 Kamra D, (2005), Rumen microbial ecosystem, Current science, 89 (1), pp 124-135 17 Kim M, Morrison M, Yu Z, (2011), Status of the phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes, FEMS microbiology ecology, 76 (1), pp 49- 63 18 Kocherginskaya SA, Aminov RI, White BA, (2001), Analysis of the rumen bacterial diversity under two different diet conditions using Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 49 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học denaturing gradient gel electrophoresis, random sequencing, and statistical ecology approaches, Anaerobe, (3), pp 119-134 19 Koike S, and Kobayashi Y, (2009), Fibrolytic rumen bacteria: their ecology and functions, Asian-Aust J Anim Sci, 22, pp 131-138 20 Kontanis EJ, Reed FA, (2006), Evaluation of real‐ time PCR amplification efficiencies to detect PCR inhibitors J Forensic Sci 51(4), pp 795-804 21 Krause D, Nagaraja T, Wright A, Callaway T, (2013), Board-invited review: Rumen microbiology: Leading the way in microbial ecology, Journal of animal science, 91 (1), pp 331-341 22 Liggenstoffer AS, Youssef NH, Couger M, Elshahed MS, (2010), Phylogenetic diversity and community structure of anaerobic gut fungi (phylum Neocallimastigomycota) in ruminant and non-ruminant herbivores, The ISME journal, (10), pp 1225-1235 23 Lim S, Seo J, et al (2013), Metagenome analysis of protein domain collocation within cellulase genes of goat rumen microbes, AsianAustralasian journal of animal sciences, 26 (8), pp 1144 24 Mcallister T, Bae H, Jones G, Cheng K, (1994), Microbial attachment and feed digestion in the rumen, Journal of animal science, 72 (11), pp 30043018 25 Minato H, Mitsumori M, Cheng KJ, (1993), Attachment of microorganisms to solid substrate in the rumen, in Genetics, Biochemistry and Ecology of Lignocellulose Degradation, K Shimada, S Hoshino, K Ohmiya, K Sakka, Y.Kobayashi, and S Karita, Editors, Uni Publishers, Tokyo, pp 139- 145 26 Porebski S, Bailey LG, Baum BR (1997) Modification of a CTAB DNA Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 50 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components Plant Mol Biol Rep 15(1), pp 8-15 27 Rainey FA, Ward-Rainey N, Kroppenstedt RM, Stackebrandt E (1996) The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage: proposal of Nocardiopsaceae fam nov Int J Sys Evol Microbiol 46(4), pp 1088-1092 28 Rappe M, Giovannoni S (2003) The uncultured microbial majority Annu Rev Microbiol 57: 369–394 29 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, (2001), Molecular cloning: A laboratory manual, 3th ed., Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 30 Yu Z, Morrison M, (2004), Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples Biotechniques 36(5), pp 808-813 Nguyễn Bảo Hân – K20.1302 51 ... cỏ dê để thực đề tài Nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn cỏ dê B Mục tiêu Đánh giá hiệu các phương pháp tách chiết DNA metagenome từ các mẫu dạ cỏ dê thu... Cơng nghệ sinh học VI ̣N ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA METAGENOME HỆ VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ Giáo vi n... thư vi n DNA là tập hợp tất các đoạn DNA bảo quản riêng rẽ các tế bào vi sinh vật Có nhiều loại thư vi n DNA khác nhau, vi dụ: thư vi n cDNA, thư vi n genome… [6] Thư vi n DNA metagenome