BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -*** - TRƯƠNG VĂN HỢP Hoàn chỉnh kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR nam giới khơng có tinh trùng KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2009 - 2015 Hà Nội – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -*** - BỘ Y TẾ TRƯƠNG VĂN HỢP Hoàn chỉnh kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR nam giới khơng có tinh trùng KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2009 - 2015 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN ĐỨC PHẤN Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS TS Trần Đức Phấn, Trưởng Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội, người dành cho quan tâm, trực tiếp bảo tận tình từ bước đầu trình nghiên cứu đến hồn thiện khóa luận, thầy đặt viên gạch làm móng cho đường nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Trang, Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ hết lòng q trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới: Tồn thể Thầy Cơ, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Y sinh họcDi truyền Trường Đại học Y Hà Nội gần gũi, động viên, giúp đỡ cho lời khuyên quý báu Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập, hồn thành khóa luận Xin bày tỏ lòng kính u sâu sắc đến bố mẹ người thân gia đình, bạn bè, ln bên hỗ trợ, cổ vũ động viên hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 25/ 05/ 2015 Sinh viên Trương Văn Hợp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Nếu sai tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Tác giả luận văn Trương Văn Hợp MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình vơ sinh vô sinh nam 1.1.1 Vô sinh 1.1.2 Vô sinh nam 1.1.3 Tình hình vơ sinh vô sinh nam giới 1.1.4 Tình hình vơ sinh vơ sinh nam Việt Nam 1.2 Nguyên nhân vô sinh nam 1.2.1 Phân loại nguyên nhân vô sinh nam theo Tổ chức Y tế giới 1.2.2 Nguyên nhân vô sinh nam rối loạn di truyền 1.2.3 Các nguyên nhân không di truyền gây vô sinh nam 1.3 Đột biến gen CFTR vô sinh nam 1.3.1 Đột biến gen CFTR 1.3.2 Mối liên quan đột biến gen CFTR vô sinh nam 10 1.3.3 Các phương pháp xác định đột biến gen CFTR 12 1.3.4 Kỹ thuật Multiplex - PCR 13 1.3.5 Kỹ thuật điện di 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 16 2.1.2 Cỡ mẫu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Lấy mẫu 17 2.2.2 Chuẩn bị dụng cụ - vật liệu 17 2.3 Phương pháp tiến hành kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR 18 2.3.1 Tóm tắt bước 18 2.3.2 Tiến hành xác định đột biến gen CFTR kỹ thuật Multiplex PCR điện di đứng thạch polyacrylamid 10% 19 2.4 Xử lý số liệu 23 2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 Đặc điểm chung nam giới khơng có tinh trùng 24 3.1.1 Phân bố theo tuổi 24 3.1.2 Đặc điểm tinh dịch nam giới khơng có tinh trùng 25 3.2 Hoàn chỉnh kỹ thuật Multiplex-PCR điện di đứng sản phẩm thạch polyacrylamid 10% 26 3.2.1 Chuẩn hóa quy trình xác định đột biến gen CFTR 27 3.2.2 Độ tinh DNA tách chiết 27 3.2.3 Điện di đứng sản phẩm phản ứng Multiplex - PCR thạch polyacrylamid 10% 28 3.2.4 Phân tích kết thu hình ảnh điện di 30 3.3 Đặc điểm đột biến gen CFTR nam giới khơng có tinh trùng 32 3.3.1 Các đột biến gen CFTR 32 3.3.2 Phân bố loại đột biến gen CFTR 33 3.3.3 Số lượng đột biến gen CFTR người nam khơng có tinh trùng 34 3.3.4 Tỷ lệ đột biến gen CFTR dạng đồng hợp tử dị hợp tử 34 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 35 4.1 Đặc điểm chung nam giới khơng có tinh trùng 35 4.1.1 Đặc điểm tuổi 35 4.1.2 Thể tích tinh dịch 36 4.1.3 Độ pH 37 4.2 Hồn chỉnh quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR phản ứng Multiplex - PCR điện di đứng thạch polyacrylamid 10% 38 4.2.1 Độ tinh DNA sau tách chiết 38 4.2.2 Điện di đứng sản phẩm Multiplex - PCR thạch polyacrylamid 10% 39 4.2.3 Phân tích kết đột biến gen CFTR ảnh điện di 41 4.2.4 Quy trình xác định đột biến gen CFTR nam giới khơng có tinh trùng phương pháp Multiplex - PCR điện di sản phẩm thạch polyacrylamid 10% 42 4.3 Mô tả đột biến gen CFTR nam giới khơng có tinh trùng 43 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AR Androgen Receptor - Thụ thể androgen AZF Azoospermia factor CBAVD Congenital bilateral aplasia of the vas deferens Bất sản ống dẫn tinh hai bên CF Cystic Fibrosis – Xơ nang CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator CFTR - RD Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator related disorder ddNTP 2',3' dideoxynucleotides DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid KRNN Không rõ nguyên nhân mRNA Messenger ribonucleic acid - ARN thông tin M-PCR Multiplex polymerase chain reaction NBD Nucleotide-binding domains OD Optical Density NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction WHO World health organization - Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các nhóm ngun nhân vơ sinh nam giới (Theo WHO) [6] Bảng 2.1 Thành phần chất để tách chiết DNA 17 Bảng 2.2 Thành phần chất cho phản ứng Multiplex-PCR 17 Bảng 2.3 Thành phần chất để pha thạch polyacrylamid 10% 18 Bảng 2.4 Chu trình luân nhiệt phản ứng Multiplex - PCR 20 Bảng 2.5 Kích thước 11 loại đột biến gen CFTR 21 Bảng 3.1 Độ pH tinh dịch nam giới khơng có tinh trùng 26 Bảng 3.2 Tỷ lệ phát loại đột biến gen CFTR nam giới khơng có tinh trùng 32 Bảng 3.3 Số lượng loại đột biến gen CFTR bệnh nhân 34 Bảng 4.1 Quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen CFTR nam giới khơng có tinh trùng 42 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí gen CFTR nhiễm sắc thể Hình 1.2 Tỷ lệ phần trăm đột biến gen CFTR bệnh nhân xơ nang Nga [39] Hình 3.1 Phân bố theo tuổi bệnh nhân nam khơng có tinh trùng 24 Hình 3.2 Phân bố tỉ lệ thể tích tinh dịch 25 Hình 3.3 Hình ảnh điện di đứng sản phẩm phản ứng Multiplex - PCR thạch polyacrylamid 10% gen CFTR 28 Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm thạch polyacrylamid 10% chụp máy quang phổ tử ngoại 29 Hình 3.5 Đột biến gen CFTR loại 394delTT ảnh điện di 31 Hình 3.6 Đột biến gen CFTR loại 1677delTA ảnh điện di 31 Hình 3.7 Đột biến gen CFTR loại 604insA ảnh điện di 32 Hình 3.8 Phân bố loại đột biến gen CFTR 33 Hình 3.9 Tỷ lệ đột biến gen CFTR dạng đồng hợp tử dị hợp tử 34 43  Cho đầy đủ thành phần tiến hành phản ứng Mutiplex - PCR với chu trình luân nhiệt sau: Tiến hành phản ứng Multiplex PCR Nhiệt độ 95о 94о 62о 72о 72о 12о Điện di sản phẩm phản ứng Multiplex PCR thạch polyacrylamid 10% Phân tích kết Thời gian phút 30 giây 45 giây phút 30 giây phút 30 chu kỳ Vô  Điện di đứng sản phẩm PCR thạch polyacrylamid 10% với hiệu điện 50 V giờ, kích thước kính điện di 10 x 10 cm  Ngâm nhẹ gel dung dịch nhuộm ethidium bromide 15 phút, lấy gel thấm khô bề mặt gel  Quan sát chụp ảnh gel máy soi tử ngoại  Xác định loại đột biến, đồng hợp tử hay dị hợp tử 4.3 Mô tả đột biến gen CFTR nam giới khơng có tinh trùng Trong tổng số 51 bệnh nhân nam tinh trùng đến khám làm xét nghiệm xác định đột biến gen CFTR Bộ môn Y sinh học - Di truyền, có 25/51 mẫu phát có đột biến gen CFTR chiếm 49,02% Đa số bệnh nhân khám nhiều nơi, làm thăm dò loại trừ ngun nhân vơ sinh như: rối loạn hormone sinh dục, bất thường quan sinh dục ngoài, bất thường nhiễm sắc thể, đột biến đoạn AZF… nên việc đến khám Phòng khám chuyên khoa nam học Bệnh viện Đại học Y Hà Nội làm xét nghiệm Bộ môn Y sinh học - Di truyền chủ yếu để xác định xác xem có đột biến gen CFTR gây tình trạng khơng có tinh trùng liên quan bất sản ống dẫn tinh hay khơng Vì tỷ lệ phát đột 44 biến gen CFTR đối tượng nghiên cứu cao (chiếm gần nửa) Mặt khác, số đối tượng nghiên cứu, có đến 61% bệnh nhân nam tích tinh dịch thấp 54,9% có độ pH tinh dịch