Đang tải... (xem toàn văn)
Phân lập các hợp chất thiên nhiên rất quan trọng, qua việc phân lập tìm ra các hợp chất góp phần nâng cao điều kiện sống, cũng như tìm ra các lớp chất có khả năng chữa bệnh Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân có thể thấy là phương pháp đo phổ hữu hiệu và hiện đại nhất hiện nay. Cùng với các phương pháp hóa lý khác để xác định cấu trúc hợp chất, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C và phổ NMR 2 chiều đã góp phần quan trọng trong việc tìm kiếm, tổng hợp ra các hợp chất mới có nhiều tính năng ưu việt. Khi khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, sự ứng dụng của phương pháp phổ này càng được mở rộng và được cải tiến để thu được những kết quả có độ chính xác cao hơn.
Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc MỞ ĐẦU Các hợp chất thiên nhiên bao gồm hợp chất hình thành trình khởi tạo, hay trình trì sống hệ thực vật động vật Hệ thực vật hệ động vật phong phú, với điều kiện sống khác góp phần hình thành lớp chất với hoạt tính khác VD acid amin ɷ-3, ɷ -6, hay Flavonoid, alkanoid… Mỗi lớp chất ứng dụng với vai trò khác Việc phân lập, xác định cấu trúc hợp chất từ thiên nhiên ngành khoa học nghiên cứu thú vị nghiên cứu từ lâu Hóa học cấu trúc hợp chất thiên nhiên nghiên cứu từ lâu, từ phương pháp cổ điển với nhứng hệ máy cổ điển phương pháp cải tiến hỗ trợ hệ máy đại Với hệ máy đại thập niên nay, việc xác định rõ ràng hợp chất làm sáng tỏ Cấu trúc với hoạt tinh sinh học nghiên cứu nhằm xác định hợp chất có tiềm Rõ ràng việc xác định cấu trúc hợp chất đóng vai trò quan trọng sống, đặc biệt ứng dung cấu trúc hóa học sinh học Với việc xã hội phát triển kèm theo thiết yếu sống, nhiều phương pháp xác định cấu trúc đời Trong khn khổ tiểu luận này, em xin trình bày số phương pháp tách chất xác định cấu trúc hợp chất sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng tử hạt nhân NMR - phương pháp phổ đại với độ xác định cấu trúc hợp chất cao Tiểu luận môn phương pháp phân tích cấu trúc PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT I.1: Các phương pháp phân tách hợp chất thiên nhiên Từ đời có bước phát triển mạnh mẽ, sắc ký trở thành phương pháp hữu hiệu thay việc phân tách chất tinh khiết khỏi hỗn hợp để định tính, định lượng, tinh khiết hóa phân lập chất mong muốn Sắc ký ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học, hóa tổng hợp, dược liệu, hóa phân tích, kiểm nghiệm v.v… Bên cạnh việc sử dụng để định tính, định lượng chất (sắc ký phân tích) sắc ký dùng để phân lập, điều chế, tinh chế chất mong muốn hỗn hợp nhiều thành phần (sắc ký điều chế hay gọi sắc ký chế hóa) Đây ứng dụng quan trọng, đặc biệt hóa tổng hợp dược liệu I.1.1 Sắc kí mỏng Một kỹ thuật sắc ký nhanh, tiện lợi, dễ thực thơng dụng sắc ký lớp mỏng Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) dùng để định tính, thử tinh khiết đơi để bán định lượng định lượng hoạt chất thuốc Sắc ký lớp mỏng kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đặt hỗn hợp chất cần tách Pha tĩnh chất hấp phụ chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích Pha động hệ dung môi đơn đa thành phần trộn với theo tỷ lệ quy định chuyên luận Trong trình di chuyển qua lớp hấp phụ, cấu tử hỗn hợp mẫu thử di chuyển lớp mỏng, theo hướng pha động, với tốc độ khác Kết quả, ta thu sắc ký đồ lớp mỏng Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển chất phân tích hệ số di chuyển Rf tính tỷ lệ khoảng dịch chuyển chất thử khoảng dịch chuyển dung môi: Rf= a/b Trong đó: Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử, tính cm b khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung mơi đo đườn vết, tính cm Rf: Chỉ có giá trị từ đến I.1.2 Sắc kí cột Nguyên lí tách sắc kí cột loại sắc kí khác: mẫu thử nạp lên cột chứa chất hấp phụ (thường silica gel, nhôm oxyt).Cột chứa chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột làm di chuyển cấu tử mẫu thử, cấu tử có độ phân cực khác nên lực chúng với pha tĩnh khác I.1.3 Sắc kí cột nhanh Sắc ký cột nhanh, biết sắc ký cột với áp lực trung bình, ứng dụng Clark Still trường đại học Columbia mô tả J.Org Chem 43, 2923 (1978) Sắc ký cột nhanh khác kỹ thuật truyền thống khác điểm: Sử dụng phân tử silica gel nhỏ 250-400 mesh Vì giới hạn dòng chảy dung môi gây phân tử silica gel nhỏ, đó, khí nén (áp lực từ 10-15 psi) sử dụng để đẩy dung môi qua cột pha tĩnh Do q trình sắc ký nhanh, có độ phân giải cao I.1.4 Sắc kí cột chân khơng.(Vacuum liquid chromatography-VLC) Sắc kí cột chân khơng (VLC) dạng sắc kí cột cải tiến Hệ thống hoạt động nhờ áp suất hút vòi cột, dung mơi chảy xun qua hệ thống với lưu lượng lớn Mục đích tách mẫu phức tạp thành vài phân đoạn có độ phân cực khác Đây dạng sắc kí hấp phụ, có khả tách trung bình I.1.5 Sắc kí lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography-HPLC) Tiểu luận môn phương pháp phân tích cấu trúc HPLC - High Performance Liquid Chromatography phương pháp sắc ký phân tích có tốc độ nhanh hiệu suất cao, dùng để phân tích định tính (xác định thành phần hỗn hợp) định lượng (xác định nồng độ chất) hợp chất hữu số lĩnh vực như: hóa cơng nghiệp, hóa thực phẩm, hóa dược,… HPLC phân ra: sắc kí dùng để phân tích định tính định lượng sắc kí điều chế Đây hệ thống sắc kí với hệ máy đại nhât với nhiều hệ thống kết nối với Hệ thống HPLC bao gồm : Hệ thống dung môi, bơm, kim tiêm, cột, detecto, máy tính Về ngun tắc phân tách hợp chất HPLC sắc kí cổ điển sắc kí cột, khác sắc ki lỏng cao áp có hệ thống bơm hệ thống cột (Cột dùng sắc ký lỏng thường ống làm thép không rỉ thủy tinh đặc biệt) hệ thống detector kết nối với máy tính ghi nhận tín hiệu pic HPLC tồn nhiều loại dung môi khác loại cột detecto khác Tùy mục đích sử dụng phương pháp áp dụng mà chọn lựa điều kiện thích hợp để tách chất Ngồi việc định tính, định lượng, HPLC điều chế ứng dụng phân tách hợp chất sử dụng hệ thống cột điều chế Fraction Collecto I.1.6 Sắc kí khí (Gas chromatography-GC) Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc Sắc kí khí phương pháp sắc kí mà pha động lỏng thay dòng khí liên tục chạy qua pha tĩnh Các chất tách khỏi hỗn hợp tương tác khác chúng với pha tính Do khả hòa tan chất khí, hay dòng khí khơng đóng vai trò pha động thực hệ thống sắc kí Nó làm nhiệm vụ lơi chất pha chạt dọc theo pha tĩnh để chúng tương tác pha tĩnh Dòng khí gọi khí mang Hệ thống ghi nhận liệu giống sắc kí lỏng, sau qua detector ghi nhận máy tính Do đặc điểm sắc kí khí mà được áp dụng cho chất có khả bay nhiệt độ tiến hành sắc kí Ứng dụng sắc kí khí lớn phân tách xác định loại tinh dầu, ngồi có ứng dụng đáng quan tâm việc phân tích dư lượng chất bảo vệ thực vật dư dược liệu, dioxin… Trên số phương pháp phân tách hợp chất đề cập, việc phân tách phải kèm với việc xác định cấu trúc hợp chất I.2 Xác định cấu trúc hợp chất sử dụng phổ NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ CHTHN) viết tắt tiếng Anh NMR (nuclear Magnetic Resonance) phương pháp vật lý đại nghiên cứu cấu tạo hợp chất hữu cơ, có ý nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo phân tử phức tạp hợpchất thiên nhiên Phương pháp phổ biến sử dụng NMR-1H phổ NMR -13C Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc Hệ thống máy NMR I.2.1 Cơ sở vật lý học I.2.1.1 Hạt nhân từ trường - Hạt nhân đồng vị nguyên tử đặc trưng số lượng tử spin I số lượng tử từ m I: số lượng tử spin hạt nhân (I = 0, ½, 1, 3/2, 5/2… ) mI : số lượng tử từ hạt nhân mI= (2I+1) có giá trị khác -I, -I + 1, +I - Thực nghiệm cho thấy hạt nhân nguyên tử có số lượng tử spin I hạt nhân định, phụ thuộc vào số khối nguyên tử A số thứ tự nguyên tử Z: Các hạt nhân ngun tử tích điện dương, ln ln tự quay quanh trục nó, quay vậy, sinh mơmen qn tính gọi momen spin hạt nhân P momen từ µ Mặt khác, hạt nhân nguyên tử quay quanh trục điện tích hạt nhân chuyểnđộng Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc vòng tròn quanh trục quay, làm xuất dòng điện Mỗi dòng điện kèm theo m ột từ trường nên hạt nhân quay xuất từ trường cómơmen từ µ hạt nhân trở thành nam châm vĩnh cửu Mômen spin hạt nhân P tỷ lệ thuận với momen từ µ: µ = γ P Trong đó: µ - mơmen từ có giá trị tuyệt đối µ P - mơmen spin hạt nhân có giá trị tuyệt đối P γ: hệ số từ thẩm đặc trưng cho hạt nhân nguyên tử Giá trị tuyệt đối momen spin hạt nhân P tính theo I: P=(h/2π)/I Giá trị tuyệt đối momen từ µ tính theo I: µ = γ (h/2π).I I: số lượng tử spin hạt nhân, I = µ = P = 0, I ≠ µ ≠ P ≠ 0: hạt nhân gọi hạt nhân từ Đây điều kiện để có cộng hưởng từ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân phụ thuộc vào % đồng vị momen từ µ Khi µ lớn độ nhạy cao I.2.1.2 Hạt nhân ngồi từ trường Khi khơng từ trường, hạt nhân có µ mức lượng Khi đặt hạt nhân từ vào từ trường ngồi có cường độ B o momen từ µ hạt nhân từ xoay theo hướng có đường sức từ từ trường Hạt nhân nguyên tử từ từ trường khác với kim nam châm từ trường trái đất: hạt nhân từ tiếp nhận vị trí từ trường bên ngồi mà số vị trí định khơng gian tương ứng với số trạng thái lượng xác định nghĩa lượng hạt nhân từ thể qua giá trị cosθ: cosθ = m/I Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc I: số lượng tử spin hạt nhân (I = 0, ½, 1, 3/2, 5/2…) mI : số lượng tử từ hạt nhân (m = -I đến +I) có 2I + giá trị ∆E=h.ν= (h/2π).γ.Bo Vậy ν = (1/2π).γ.B0 Ở đây, ∆E lượng cộng hưởng, ν tần số cộng hưởng, B o cường độ từ trường nam châm, γ hệ số từ thẩm, hạt nhân có giá trị khác γ (1H) ~ 4γ(13C) Do Muốn xảy tượng cộng hưởng phải chiếu vào hạt nhân từ trường B1 có tần số cộng hưởng ν1 cho B1 vng góc với Bo Khi h.ν1 = ∆E = h.ν = (h/2π).γ.Bo => ν1 = (1/2π).γ.Bo ν1 tần số cộng hưởng từ (tương ứng với lượng cần kích thích hạt nhân chuyển từ mức thấp lên mức cao nằm vùng sóng vơ tuyến 108 – 106 Hz I.2.1.3 Hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân Khi cho từ trường B o tác dụng lên phân tử có chứa hạt nhân dẫn tới tách mức lượng dẫn đến phân bố hạt nhân theo cân Boltzmann Trong từ trường B0, hạt nhân không nằm yên mà trạng thái cân động Nếu muốn phá vỡ trạng thái c ân động cần phải cung cấp lượng từ vào cách cho từ trường khác có cường độ B tác dụng vào phân tử Điều làm thay đổi lại phân bố hạt nhân hai mức lượng Một số hạt nhân hấp thụ lượng từ trường B1 để nhảy từ mức lượng thấp lên mức lượng cao ngược lại, số hật nhân mức lượng cao xạ lượng để chuyển xuống mức lượng hấp Năng lượng cần thiết để cung cấp cho q trình thay đổi ∆E = lượng cộng hưởng từ nhân Quá trình hấp thụ lượng ∆E để phân bố lại cân động từ trường B gọi tượng cộng hưởng từ nhân Hiện tượng cộng hưởng từ xảy hạt nhân hấp thụ lượng có tần số ν 0được gọi tần số cộng hưởng từ Tiểu luận môn phương pháp phân tích cấu trúc I.2.1.4 Độ chuyển dịch hố học A, Hằng số chắn từ trường hiệu dụng Hằng số chắn xuất hai nguyên nhân: - Hiệu ứng nghịch từ: điện tử bao quanh nguyên tử sinh từ trường riêng, ngược chiều với từ trường ngồi nên làm giảm tác dụng lên hạt nhân nguyên tử Lớp vỏ điện tử dày đặc từ trường riêng ngược chiều với từ trường ngồi lớn tức số chắn lớn Vì vậy, proton nằm nhóm có nguyên tử hay nhóm nguyên tử gây hiệu ứng – I (Cl, Br, I, NO2…) có số chắn nhỏ, trái lại nhóm nguyên tử gây hiệu ứng +I (CH3, C2H5…) có số chắn lớn - Hiệu ứng thuận từ: bao quanh phân tử lớp vỏ điện tử, điện tử chuyển động sinh dòng điện vòng, xuất diện từ trường riêng có hướng thay đổi ngược hướng hướng với từ trường ngồi B, Độ chuyển dịch hố học Đối với hạt nhân phân tử phức tạp nguyên tử ảnh hưỏng đám mây electron nguyên tử bên cạnh Do hiệu ứng chắn từ khác nên hạt nhân 1H và13C phân tử có tần số cộng hưởng khác Đặc trưng cho hạt nhân H và13C phân tử giá trị độchuyển dịch hoá học δ I.2.1.6 Tương tác Spin-Spin Đối với hạt nhân nhóm hạt nhân người ta nhận tín hiệu đặc trưng có đỉnh nhóm 2, 3, 4, đỉnh khác Nguyên nhân xuất nhiều đỉnh hạt nhân có I = ½ sinh hai từ trường riêng Hai từ trường riêng tác dụng lên hạt nhân bên cạnh làm phân tách mức lượng thành mức lượng khác Trường hợp 2, hạt nhân tác động từ trường riêng lên hạt nhân khác lượng cộng hưởng hạt nhân bị phân tách thành nhiều mức lượng khác mà lượng cộng hưởng cho đỉnh phổ cộng hưởng từ hạt nhân Thực nghiệm cho thấy phân tách đỉnh hay mức lượng tuân theo tam giác pascal Tiểu luận môn phương pháp phân tích cấu trúc Ngồi khoảng cách hai đỉnh liền nhóm đo Hertz (Hz) gọi số tương tác spin-spin J Đây thông số phổ quan trọng độ chuyển dịch hố học I.2.2.Các phổ có NMR Bộ phổ chiều : H-NMR 13C-NMR (với chương trình DEPT): Brucker AM 400, Brucker DRX 500 Brucker AMX 600 Phổ 1H-NMR: Trong phổ này, độ chuyển dịch hóa học (δ) proton xác định thang ppm từ – 14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa nguyên tử đặc trưng riêng phần Dựa vào đặc trưng độ chuyển dịch hóa học tương tác spin mà xác định cấu trúc phân tử hợp chất Độ dịch chuyển hóa học 1H-NMR 10 Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc Phổ 13 C-NMR: Phổ cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon cộng hưởng trường khác cho tín hiệu phổ khác Thang đo phổ - 230 ppm Độ dịch chuyển hóa học 13C-NMR Phổ DEPT: Phổ cho ta tín hiệu để phân loại loại cacbon khác Trên phổ DEPT, tín hiệu cacbon bậc bốn biến mất, phổ DEPT 135, tín hiệu CH CH nằm phía, CH2 nằm phía; Phổ DEPT 90 xuất tín hiệu CH Bộ phổ chiều: - HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Biểu diễn tương tác xa C H phân tử thông qua liên kết Dựa vào tương tác phổ mà phần phân tử toàn phân tử xác định cấu trúc - HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C xác định dựa vào tương tác phổ Trên phổ, trục phổ 1H-NMR, trục 13C-NMR, tương tác nằm đỉnh ô vuông 11 Tiểu luận môn phương pháp phân tích cấu trúc PHẦN II THỰC NGHIỆM Ở em xin trình bầy trình phân lập xác định cấu trúc Mẫu TM3K sau đem đo viện Khoa học công nghệ Việt Nam để xác định cấu trúc 12 Tiểu luận môn phương pháp phân tích cấu trúc 13 Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc 14 Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc 15 Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc Trên phổ 13C- NMR xuất tín hiệu 18 tín hiệu cacbon, có 13 cacbon vòng thơm (2 cặp cacbon đối xứng (90-170 ppm)); cacbon nhóm cacboxylic (–COO) (170, 42 ppm, 165,26 ppm) cacbon no (trong số có cacbon liên kết với nguyên tử oxi C-2 ( 76,54 ppm) C-3 (68,06 ppm) 16 Tiểu luận môn phương pháp phân tích cấu trúc Nhìn phổ DEPT hợp chất TM3K ta thấy tín hiệu cacbon bậc C-1 ’ (128, 69 ppm); C-9 (94,39 ppm); C-10 (97,45 ppm); C-1’’ (119,37 ppm); tín hiệu cacbon bậc C-2 ’’ & C6 ’’ (105,56 ppm); C-8 (94,39 ppm); C-6 (95,59 ppm); C-2’’ & 6’’ (108,74 ppm) Từ ta dự kiến khung Epigallocatechin gallate (EGCG) Cấu trúc Epigallocatechin gallate (EGCG) khẳng định thêm phân tích phổ 1H-NMR Cụ thể ta thấy cấu trúc vòng A thơng qua proton H-8 H-6 tương tác ortho với số tương tác J = 2,2 HZ ( 5,38 5,93 ppm) Đồng thời ta thấy cấu trúc vòng C thể tín hiệu H-2 (4,95 ppm ); H-3 (5,37 ppm); H4eq H4 ax ( Ha (2,66 ppm ; J= 17,5HZ); (Hb (2,93 ppm ; J=5Hz; J=17,5HZ) Cuối so sánh giá trị phổ khối 1H- NMR 13 C- NMR với tư liệu [3] Epigallocatechin gallate (EGCG) cho thấy trùng khớp, điều khẳng định TM3K Epigallocatechin gallate (EGCG) Độ chuyển dịch hóa học δH δC củaTM3K (epi-Gallocatechin gallate) Stt δH (ppm) δ C (ppm) 4,95 brs 76,54 d 5,37 brs 68,06 d 17 Ha: 2,66 d J = 17,5 Hz Hb: 2,93 dd J = Hz; 17,5 Hz 25,78 t 9,27 brs (Ar-OH, C5) 156,52 s 5,93 d J = 2,2 Hz 95,59 d 9,03 brs (Ar-OH, C7) 156,57 s 5,83 d J = 2,2 Hz 94,39 d - 155,66 s 10 - 97,45 s 1’ - 128,69 s 2’ & 6’ 6,41 brs (2 H) 105,56 d (2 C) 3’ & 5’ 8,68 brs (2 Ar-OH, C3’ & C5’) 145,67 s (2 C) 4’ 7,98 brs (Ar-OH, C4’) 132,41 s -COO- - 165,26 s 1’’ - 119,37 s Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc 2’’ & 6’’ 6,81 brs (2 H) 108,74 d (2 C) 3’’ & 5’’ 9,16 brs (2 Ar-OH, C3’’ & C5’’) 145,43 s (2 C) 4’’ 8,86 brs (Ar-OH, C4’’) 138,59 s Từ kết luận chất thu là Epigallocatechin gallate (EGCG) có cơng thức 18 Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc KẾT LUẬN Phân lập hợp chất thiên nhiên quan trọng, qua việc phân lập tìm hợp chất góp phần nâng cao điều kiện sống, tìm lớp chất có khả chữa bệnh Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân thấy phương pháp đo phổ hữu hiệu đại Cùng với phương pháp hóa lý khác để xác định cấu trúc hợp chất, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13C phổ NMR chiều góp phần quan trọng việc tìm kiếm, tổng hợp hợp chất có nhiều tính ưu việt Khi khoa học kỹ thuật ngày phát triển, ứng dụng phương pháp phổ mở rộng cải tiến để thu kết có độ xác cao Do thời gian tìm hiểu chưa nhiều, kiến thức hạn hẹp nên q trình làm tiểu luận khơng tránh sai sót Rất mong thầy, góp ý để em hoàn thiện tiểu luận, cuxnh tăng them hiểu biết 19 ... dioxin… Trên số phương pháp phân tách hợp chất đề cập, việc phân tách phải kèm với việc xác định cấu trúc hợp chất I.2 Xác định cấu trúc hợp chất sử dụng phổ NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ CHTHN)... Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân thấy phương pháp đo phổ hữu hiệu đại Cùng với phương pháp hóa lý khác để xác định cấu trúc hợp chất, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13C phổ NMR chiều góp... để xác định cấu trúc 12 Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc 13 Tiểu luận môn phương pháp phân tích cấu trúc 14 Tiểu luận mơn phương pháp phân tích cấu trúc 15 Tiểu luận mơn phương pháp