TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA NÔNG HỌC BỘ MƠN BỆNH CÂY MIỄN DỊCH THỰC VẬT (3 tín chỉ) Biên soạn Hà Viết Cường 2011 Mục lục CHƯƠNG GIỚI THIỆU VỀ MIỄN DỊCH THỰC VẬT Định nghĩa đối tượng nghiên cứu 1.1 Nguồn gốc từ miễn dịch (immunity) 1.2 Định nghĩa miễn dịch thực vật 1.3 Đối tượng nghiên cứu Lịch sử miễn dịch động vật 2.1 Lịch sử miễn dịch thực vật So sánh miễn dịch động vật thực vật 3.1 Sự khác 3.2 Sự giống Các khái niệm tính kháng bệnh thực vật 11 CHƯƠNG CƠ CHẾ GÂY BỆNH CỦA TÁC NHÂN GÂY BỆNH 14 Cấu tạo tế bào thực vật 14 1.1 Vách tế bào 14 1.1.1 Phiến (middle lamella) 14 1.1.2 Vách sơ cấp (primary cell wall) 14 1.1.3 Vách thứ cấp (secondary cell wall) 14 1.1.4 Các chất cấu tạo nên vách tế bào 15 1.2 Màng tế bào 16 1.3 Các chất bề mặt 16 Đặc điểm chung tác nhân gây bệnh 16 2.1 Nấm gây bệnh 16 2.2 Vi khuẩn gây bệnh 17 2.3 Virus thực vật 18 Cơ chế gây bệnh tác nhân gây bệnh 19 Quá trình xâm nhập tác nhân gây bệnh vào tế bào 19 4.1 Xâm nhập (penetration)của nấm vào 19 4.1.1 Trực tiếp qua bề mặt ký chủ nguyên vẹn (chủ động) 19 4.1.2 Qua lỗ mở tự nhiên (thụ động) 21 4.1.3 Qua vết thương giới, vết nứt tự nhiên (thụ động) 21 4.2 Xâm nhập vi khuẩn 21 4.2.1 Xâm nhập virus, mollicute (phytoplasma, spiroplasma) 22 4.3 Dinh dưỡng ký sinh tác nhân gây bệnh 22 4.4 Các enzyme tác nhân gây bệnh 23 4.4.1 Các enzyme phân hủy vách tế bào 23 4.4.2 Enzyme phân giải vật chất tế bào ký chủ 24 4.5 Độc tố tác nhân gây bệnh 24 4.5.1 Độc tố không chọn lọc ký chủ (NST) 25 4.5.2 Các độc tố chọn lọc ký chủ (HST) 27 4.6 Hocmon thực vật 27 4.6.1 Auxins 27 4.6.2 Gibberellins 28 4.6.3 Cytokinin 28 4.6.4 Ethylene 28 4.7 Khái niệm tính gây bệnh, tính độc tác nhân gây bệnh 29 4.8 Phân loại tác nhân gây bệnh theo tính ký sinh 29 4.9 Phân loại tác nhân gây bệnh theo phương thức sử dụng nguồn dinh dưỡng 30 CHƯƠNG 3: CÁC BIỂU HIỆN CỦA TÍNH KHÁNG 32 Giới thiệu 32 Phòng thủ thụ động 32 2.1 Phòng thủ nhờ rào cản vật lý có sẵn 32 2.2 Phòng thủ nhờ chất hóa học có sẵn 33 2.2.1 Các chất ức chế tiết bên 33 2.2.2 Các chất ức chế có sẵn tế bào 33 Phòng thủ chủ động 34 3.1 Phòng thủ chủ động nhờ hình thành cấu trúc bảo vệ 34 3.1.1 Phản ứng phòng thủ tế bào chất 34 3.1.2 Hình thành cấu trúc phòng thủ vách tế bào 34 3.1.3 Hình thành cấu trúc phòng thủ mơ 35 3.2 Phòng thủ chủ động sinh hóa 36 3.2.1 Phytoalexin 36 3.2.2 Các hợp chất phenolic 38 3.2.3 PR protein (pathogenesis-related protein) 38 Sự chết tế bào lập trình (Programmed Cell Death – PCD), Apostosis phản ứng siêu nhạy (Hypersensitive Responnd – HR) 40 4.1 Sự chết tế bào lập trình (PCD) 40 4.2 Tự thực bào (Autophagy) 40 4.3 Apoptosis 40 4.4 Phản ứng siêu nhạy 41 CHƯƠNG 4: THUYẾT GEN ĐỐI GEN 43 Giới thiệu 43 Thí nghiệm bệnh gỉ sắt lanh Flor 43 2.1 Vòng đời nấm gỉ sắt Melampsora lini 43 2.2 Kỹ thuật phân tích lai nấm M lini 44 2.3 Đặc điểm ký chủ 45 2.4 Các thí nghiệm Flor 45 Khái niệm gen - đối – gen 45 3.1 Khái niệm 46 3.2 Đặc điểm quan hệ gen-đối-gen 46 Đặc điểm gen không độc (gen Avr) ký sinh 47 Gen kháng R protein R 48 5.1 Pto 49 5.2 CNL (CC-NB-LRR) 49 5.3 TNL (TIR-NB-LRR) 49 5.4 Cf 49 5.5 Xa21 49 Tương tác protein R Avr 50 6.1 Tương tác trực tiếp – mơ hình Elicitor – Receptor 50 6.2 Tương tác gián tiếp – mơ hình bảo vệ (Guard model) 51 Đồng tiến hóa gen Avr gen R 52 7.1 Sự đa dang quần thể tác nhân gây bệnh 52 7.1.1 Nấm - Sinh sản hữu tính 52 7.1.2 Nấm – chuyển gen theo chiều ngang 53 7.1.3 Nấm – Đột biến 53 7.1.4 Vi khuẩn – sinh sản hữu tính 53 7.1.5 Vi khuẩn – đột biến 54 7.1.6 Virus – tái tổ hợp 54 7.1.7 Virus – đột biến 54 7.2 Các yếu tố điều khiển tiến hóa tác nhân gây bệnh 54 7.3 Đồng tiến hóa gen Avr gen kháng R 55 7.3.1 Đồng tiến hóa sản xuất nơng nghiệp 55 7.3.2 Đồng tiến hóa hệ sinh thái tự nhiên 55 CHƯƠNG 5: MIỄN DỊCH BẨM SINH 58 Quan hệ vi sinh vật 58 Miễn dịch bẩm sinh (innate immunity) động vật máu nóng 58 Miễn dịch bẩm sinh (innate immunity) thực vật 58 3.1 Tính kháng không đặc hiệu (Non-specific resistance) 59 3.2 Tính kháng đặc hiệu (tính kháng đặc hiệu giống cây/chủng tác nhân gây bệnh 60 Các receptor nhận biết PAMP/MAMP/Avr protein 60 Nhận biết tương tác protein R PAMP/MAMP/Effector 60 Dẫn truyền tín hiệu miễn dịch thực vật 61 6.1 Đường hướng salicyclic acid (SA) 61 6.2 Đường hướng dẫn truyền JA ET 62 6.3 Giao tiếp chéo (cross talk) đường hướng SA JA/ET 63 6.4 Dòng thác ion đốt cháy oxy hóa 63 6.5 Đường hướng MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases) 64 CHƯƠNG TÍNH KHÁNG TẬP NHIỄM HỆ THỐNG 66 Định nghĩa Error! Bookmark not defined 1.1 Các hóa chất ngoại bào có khả cảm ứng SAR 67 CHƯƠN MIỄN DỊCH TV ĐỖI VỚI MỘT SÔ BỆNH 71 Bệnh đạo ơn (tham khảo giáo trình bệnh nơng nghiệp) 71 1.1 Triệu chứng 71 1.2 Tác nhân gây bệnh: 71 1.3 Xâm nhiễm gây bệnh 71 1.4 R Avr proteins 72 1.5 Đa dạng nấm/ Bộ giống thị 72 1.6 Quần thể nấm P oryzae miền Bắc Việt Nam 73 1.7 Các giống kháng nhiễm 73 Bệnh bạc (tham khảo giáo trình bệnh nơng nghiệp) 73 2.1 Tác nhân gây bệnh 73 2.2 Xâm nhiễm gây bệnh 74 2.3 R Avr gen 74 2.4 Đa dạng vi khuẩn Xoo 75 2.5 Đa dạng Xoo Việt Nam 76 2.6 Các giống kháng nhiễm Việt nam 76 Bệnh xoăn cà chua (begomovirus) 76 3.1 Triệu chứng bệnh 76 3.2 Nguyên nhân gây bệnh 76 3.2.1 Tác nhân gây bệnh phức hợp loài 76 3.2.2 Hình thái begomovirus gây bệnh xoăn vàng cà chua 77 3.2.3 Đặc điểm gien begomovirus gây bệnh xoăn vàng cà chua 77 3.3 Xâm nhiễm gây bệnh 78 3.3.1 Lan truyền begomovirus 78 3.3.2 Tái sinh (sinh sản) begomovirus 78 3.4 Tính kháng begomovirus 78 3.4.1 Tính kháng begomovirus thông qua gen kháng 78 3.4.2 RNA silencing begomovirus 78 3.5 Bệnh xoăn cà chua Việt Nam 79 CHƯƠNG CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG 80 Giới thiệu 80 Đa dạng quần thể tác nhân gây bệnh 80 2.1 Đa dạng tác nhân gây bệnh 80 2.2 Các kỹ thuật dùng để nghiên cứu mức độ đa dạng tác nhân gây bệnh là: 81 2.2.1 Sử dụng giống thị (khái niệm ví dụ: xem chương ) 81 2.2.2 Các phân tích phân tử 81 Xác định nguồn gen kháng 83 3.1 Sự đa dạng thực vât 83 3.2 Nguồn gen kháng 83 Lựa chọn gen kháng 84 4.1 Vai trò tính kháng ngang kháng dọc tạo giống kháng 84 4.1.1 Tính kháng dọc 84 4.1.2 Tính kháng ngang 85 4.2 Lựa chọn gen kháng 86 Sử dụng marker phân tử chọn tạo giống kháng 86 Đánh giá tính kháng 87 CHƯƠNG GIỚI THIỆU VỀ MIỄN DỊCH THỰC VẬT Định nghĩa đối tượng nghiên cứu 1.1 Nguồn gốc từ miễn dịch (immunity) Miễn dịch (immunity) có nguồn gốc từ từ la tinh “immunitas” có nghĩa “ngoại lệ” chẳng hạn “không phải phục vụ quân đội”, “không phải trả thuế dịch vụ công cộng khác” Trong văn học Roman, “immunity” có nghĩa rộng khả sống sót bị nhiễm độc bị bệnh truyền nhiễm 1.2 Định nghĩa miễn dịch thực vật Hiện nay, miễn dịch (immunity) thuật ngữ y học mô tả trạng thái có đủ phòng thủ sinh học nhằm chống lại nhiễm bệnh công tác nhân sinh học Tương tự, thực vật, miễn dịch, hiểu khả trì khơng bị bệnh trước công tác nhân sinh học Cần ý theo phân chia truyền thống tác nhân gây bệnh bao gồm vi sinh vật (ví dụ nấm, vi khuẩn), virus, tuyến trùng tác nhân môi trường bất lợi Tuy nhiên, nay, số ý kiến, vào định nghĩa bệnh cây, cho côn trùng (đặc biệt nhóm trùng chích hút) gây bệnh Miễn dịch môn học miễn dịch thực vật cần phải hiểu rộng khả chống lại mức độ công tác nhân gây bệnh nhờ đặc điểm cấu trúc di truyền Theo nghĩa rộng này, miễn dịch thực vật hiểu tính kháng với tác nhân gây bệnh 1.3 Đối tượng nghiên cứu Miễn dịch thực vật, vậy, nghiên cứu tương tác tác nhân gây bệnh ký chủ trình gây bệnh nhằm hiểu ứng dụng khả kháng bệnh Lịch sử miễn dịch động vật Miễn dịch động vật, thường gọi miễn dịch học, ngành khoa học quan trọng y học thú y học Nhiều khám phá lịch sử phát ngẫu nhiên gắn liền với nhiều tên tuổi lớn khoa học sinh học Phương pháp chủng đậu người Trung Quốc Ấn Độ Bệnh đậu mùa người Variola major virus (chi Orthpoxvirus) xuất khoảng 10.000 năm trước công nguyên, bệnh nguy hiểm người, đặc biệt trẻ em Từ 20 – 60 % người nhiễm bệnh (trong 80% trẻ em) bị chết Bệnh gây khoảng 300-500 triệu người chết kỷ 20 Năm 1979, Tổ chức Y tế giới (WHO) tuyên bố xóa bỏ bệnh nhờ chiến dịch tiêm chủng vacxin suốt kỷ 19 20 Từ nhiều kỷ trước, người Trung Quốc Ấn Độ (khoảng kỷ 16) biết chữa bệnh cách nghiền vảy đậu mùa từ người bệnh, sau nhỏ vào mũi bơi vào vết cắt da người khỏe để phòng bệnh Vào khoảng 1720, bà Mary Montagu, vợ đại sứ người Anh Thổ Nhĩ Kỳ giới thiệu phương pháp chủng đậu người Thổ (tương tự người Ấn người Trung Quốc) vào Tây Âu Phương pháp tạo miễn dịch chéo Cuối kỷ 18, Edward Jenner, dược sĩ người Anh, nghe thông tin có gái khơng bị bệnh đậu mùa bị bệnh đậu bò (do Cowpox virus, virus chi Orthpoxvirus với virus đậu mùa), bệnh gia súc người triệu chứng nhẹ nhiều Thông tin gợi ý Jenner thực thí nghiệm chủng đậu người khỏe cách sử dụng vết bệnh lấy da người bị bệnh đậu bò nhằm chống lại bệnh đậu mùa Phương pháp Jenner, sau sử dụng rộng rãi Anh Vào năm1838, phủ Anh thơng qua luật chủng đậu miễn phí cho người dân, 20 năm sau (1858), chủng đậu bắt buộc Anh Phương pháp tạo miễn dịch dùng tác nhân gây bệnh nhược độc Phương pháp gắn liền với tên tuổi Louis Pasteur, nhà hóa học vi sinh vật học người Pháp Ông khám phá kỹ thuật tiêm chủng nhờ nghiên cứu bệnh tả gà (Pasteurella multocida), bệnh than (Bacillus anthracis) bệnh dại (Rabies virus) 2.1 Lịch sử miễn dịch thực vật 1894, Ericksson phát thấy nấm gỉ sắt cốc (Puccinia graminis) gồm chủng sinh lý phân biệt hình thái khác tính gây bệnh ký chủ (ví dụ số chủng nấm gây bệnh lúa mỳ không gây bệnh đại mạch tiểu mach) Hiện nay, chủng sinh lý xác định là: - Puccinia graminis f.sp tritici gây hại lúa mỳ (wheat) - P graminis f.sp avenae gây hại đại mạch (oat) - P graminis f.sp secalis gây hại tiểu mach (barley) 1902, Ward 1915, Stakman Khi nghiên cứu bệnh gỉ sắt lúa mỳ, tác giả ghi nhận phản ứng chết hoại nhanh mô lúa mỳ nấm gọi phản ứng “phản ứng siêu nhạy, hypersensitive respond” 1964, Klement đồng nghiệp ghi nhận phản ứng siêu nhạy xảy bị vi khuẩn công Cần ý vào năm 1972, phản ứng siêu nhạy phát động vật gọi phản ứng apoptosis Apotosis lĩnh vực nghiên cứu hấp dẫn sinh học (y học, thú y học bệnh cây, xem chương ) 1905, Biffen cho biết tính kháng bệnh gỉ sắt giống lúa mỳ (Michigan Bronze (S) Rivet (R)) di truyền theo luật Mendel 1909, Orton, nghiên cứu bệnh héo Fusarium (Fusarium oxysporum) bông, dưa hấu đậu phân biệt khái niệm kháng bệnh (resistance), thoát bệnh (escape), chịu bệnh (tolerance) 1914, Stakman đồng nghiệp đưa khái niệm chủng khác lồi tác nhân gây bệnh khơng thể phân biệt hình thái phân biệt cở sở tính gây bệnh khác giống khác loài ký chủ Điều giải thích (i) giống kháng bệnh vùng nhiễm bệnh vùng khác, (ii) tính kháng bệnh thay đổi từ năm sang năm khác (iii) giống kháng trở lên nhiễm bệnh Tất có mặt hay thay đổi thành phần chủng sinh lý tác nhân gây bệnh 1940-1965 Flor, nhà bệnh Mỹ, nghiên cứu bệnh gỉ sắt lanh phát thấy rằng: gen qui định tính kháng ký chủ có gen tương ứng qui định tính gây bệnh ký sinh “For each gene that conditions resistance in the host there is a corresponding gene that conditions pathogenicity in the parasite” Ông đặt tên mối quan hệ quan hệ gen-đối-gen (gene-for-gene) thuyết ơng khám phá gọi thuyết gen-đối-gen Ơng xem nhà khoa học có công lao thuyết gen-đối-gen thuyết quan trọng lĩnh vực tính kháng bệnh bệnh học thực vật Ngày nay, nhiều khía cạnh thuyêt gen-đối-gen chứng minh bổ sung mức phân tử Hình Nếu khơng có tương tác đặc hiêu tác nhân gây bệnh (hàng ) ký chủ (hàng dưới) dẫn tới bị bệnh 1963, Vanderplank cho biết có hai loại tính kháng: (1) tính kháng dọc (vertical resistance) điều khiển vài gen kháng chủ (“major” resistance gene), có tính kháng cao chống hay vài chủng tác nhân gây bệnh; (2) tính kháng ngang (horizontal resistance) nhiều gen kháng thứ (“minor” resistance gene) có tính kháng yếu chống tất chủng tác nhân gây bệnh Vanderplank xem nhà khoa học có đóng góp lớn bệnh học So sánh miễn dịch động vật thực vật Trong năm gần đây, nhà nghiên cứu thường so sánh tính kháng thực vật với tính miễn dịch động vật áp dụng nhiều khái niệm miễn dịch động vật vào nghiên cứu tính kháng thực vật Cơ chế miễn dịch động vật với tính kháng thực vật chia sẻ nhiều điểm khác có nhiều điểm giống 3.1 Sự khác Sự khác dễ thấy động vật máu nóng có hệ miễn dịch thực vật khơng có Hệ miễn dịch động vật máu nóng bao gồm quan có thẩm quyền miễn dịch tế bào có thẩm quyền miễn dịch Các quan có thẩm quyền miễn dịch (tuyến ức, lách, tủy ) nơi sản sinh, trì, biệt hố điều khiển hoạt động tế bào có thẩm quyền miễn dịch Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch (chủ yếu gồm loại lympho bào B lympho bào T) tham gia vào trình đáp ứng miễn dịch thể nhằm chống lại tác nhân lạ xâm nhập Có kiểu đáp ứng miễn dịch: Kiểu đáp ứng miễn dịch dịch thể: Khi kháng nguyên xâm nhập vào thể, bị đại thực bào vây bắt, xử lý trình diện cho lympho bào T Lympho bào T trở thành trợ bào T Trợ bào T hoạt hóa lympho bào B thành tế bào plasma để sản xuất kháng thể dịch thể Các kháng thể dịch thể globulin miễn dịch (Immuno globulin = Ig) bao gồm lớp IgG, IgM, IgA, IgD IgE Kháng thể dịch thể tồn dịch thể (huyết tương) kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên Ở số trường hợp, kháng ngun kích thích trực tiếp lympho bào B thành tế bào plasma Kiểu đáp ứng miễn dịch tế bào: Khi kháng nguyên xâm nhập vào thể, bị đại thực bào vây bắt, xử lý trình diện cho lympho bào T Lympho bào T biệt hoá thành lympho bào T mẫn cảm kháng nguyên thân chúng kháng thể tế bào Kháng thể kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên 3.2 Sự giống Ở mức độ phân tử tế bào, phản ứng phòng thủ thực vật động vật chia sẻ nhiều đặc điểm chung mà quan trọng trình nhận biết khởi động phản ứng kháng hay miễn dịch Để kích hoạt phản ứng kháng hay miễn dịch, tế bào động vật thực vật phải có khả nhận biết tác nhân vi sinh vật ngoại lai Các tác nhân vi sinh vật hình thành phân tử chứa vùng bào thủ (gọi mô hình phân tử) có nguồn gốc vi sinh vật (gây bệnh hay khơng gây bệnh) Các phân tử có ký hiệu MAMP/PAMP (Microbe/Pathogen-Associated Molecular Pattern) Một số ví dụ MAMP/PAMP vi sinh vật lipopolysacharide (LPS) vi khuẩn Gram (-), peptidoglycan vi khuẩn Gram (+), flagellin lông roi vi khuẩn; glucan, chitin vách tế bào nấm Một đặc điểm quan trọng MAMP/PAMP bảo thủ; điều dẫn tới receptor nhận biết phân tử (PRR, viết tắt từ Pattern Recognition Receptor) tức nhận biết PAMP/MAMP giống động vật thực vật Các PRR động vật protein Toll receptor ruồi dấm, Toll-like receptor (TLR) động vật khác (kể Interleukin receptor động vật máu nóng) Các PRR thực vật nhiều loại protein kháng (gọi protein R = Resistance protein) Các PRR có đặc điểm cấu trúc giống nhau, chẳng hạn có vùng lặp giàu leucine đầu carboxyl (gọi vùng LRR, viết tắt từ Leucine Rich Repeats) – nơi nhận biết MAMP/PAMP; vùng TIR (viết tắt từ Toll – Interleukin Receptor) đầu amin Các PRR có đặc điểm chức giống nhận biết MAMP/PAMP khởi động phản ứng miễn dịch/kháng kháng bẩm sinh Hình So sánh phản ứng phòng thủ mức tế bào động vật thực vật (Nurnberger et al., 2004) 10 1.6 Quần thể nấm P oryzae miền Bắc Việt Nam Sử dụng kỹ thuật AFLP, Nguyễn Thị Ninh Thuận (2006) nghiên cứu mức độ đa dạng tính gây bệnh 114 isolates nấm thu thập nhiều tỉnh thuộc đồng sông Hồng Nghiên cứu cho thấy:  Quần thể nấm P oryzae đồng sơng Hồng có tính đa dạng cao gồm nhóm VNG1, VNG2, , VNG7  Quần thể nấm phân lập giống lúa tẻ khác quần thể nấm phân lập giống lúa nếp Quần thể nấm lúa tẻ gồm nhóm VNG1, VNG2, VNG3 VNG4, lúa nếp gồm nhóm VNG 5, VNG6 VNG7  Các nhóm VNG1, VNG3, VNG chiếm ưu với VNG1 chiếm tới 50%  Nhiều giống thị mang nhiều gen kháng chống quần thể nấm P oryzae miền Bắc (ví dụ giống Morobenekan mang gen kháng Pi-7(t), Pi-10(t), Pi-12(t), Pi44(t), Pi-157), nhiên khơng thể biết gen điều khiển tính kháng Dựa phản ứng đại diện nhóm giống thị có số lượng gen kháng ít, gen kháng sau nên sử dụng để tạo giống kháng nấm đạo ôn miền Bắc: Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta2, Pi-k 1.7 Các giống kháng nhiễm Việt Nam thuộc khu vực khởi nguyên lúa với tập đoàn giống phong phú Nhiều giống cổ truyền Việt Nam mang gen kháng bệnh đạo ôn q Hiện nay, Việt Nam có giống lúa cổ truyền Tetep nhiều nước sử dụng (thơng qua IRRI) làm vật liệu nghiên cứu tính kháng Tetep giống có tính kháng cao nhiều chủng đạo ôn; số gen kháng xác định giống Pi-3(t), Pi-ta, Pi-ta2, Pi-tp(t) Ở Việt Nam, số giống lúa kháng đạo ôn tạo C70, C71, IR1820, X20, X21 Hiện nay, số giống lúa trồng phổ biến miền Bắc có chất lượng suất tốt Khang Dân 18, Bắc Thơm số 7, Hương Thơm số 1, Nếp IR352… nhiễm nấm đạo ôn Bệnh bạc (tham khảo giáo trình bệnh nông nghiệp) Bệnh bạc bệnh vi khuẩn nguy hiểm lúa Bệnh phân bố tất nước trồng lúa nhiệt đới ôn đới Tại Việt Nam, bệnh xuất nặng lúa mùa đặc biệt nghiêm trọng giống lúa lai Trung Quốc 2.1 Tác nhân gây bệnh Bệnh bạc vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây Vi khuẩn lúc đầu đặt tên Bacillus oryzae, đổi tên thành X oryszae (năm 1922) Năm 1978, vi khuẩn đặt lại tên Xanthomonas campestris pv oryzae vào năm 1990, vi khuẩn phân loại lại với tên sở dụng Xoo Xo vi khuẩn gram (-) hình gậy, dầu tròn, kích thước (0.7-2) x (0.4-0.7), vi khuẩn di động với lơng roi Khuẩn lạc mơi trường nhân tạo tròn, lồi, nhầy, màu vàng (do hình thành sắc tố xanthomonadin) Xoo tạo nhiều polysacharide ngoại bào EPS (= extracellualar polysacharide), có vai trò quan trọng việc hình thành giọt dịch vi khuẩn bệnh, bảo vệ vi khuẩn khỏi bị khô tạo điều kiện cho vi khuẩn phát tán nhờ gió, mưa Vi khuẩn hảo khia bắt buộc, khơng hình thành bào tử, nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng 25-30OC 73 2.2 Xâm nhiễm gây bệnh Xoo xâm nhập vào qua thủy khổng mép chót chủ yếu Vi khuẩn bề mặt di chuyển màng nước (nhiều vào ban đêm) để xâm nhập vào thủy khổng Sau xâm nhập vào bên trong, vi khuẩn nhân lên gian bào tiếp theo, xâm nhập lan truyền theo mạch xylem Vi khuẩn xâm nhập vào xylem qua tổn thương giới lỗ mở rễ hình thành gốc bẹ Bên xylem, vi khuẩn di chuyển theo chiều dọc theo gân từ xylem, di chuyển sang bên Trong vòng vài ngày, tế bào vi khuẩn EPS lấp đầy mạch xylem tiết dịch vi khuẩn qua thủy khổng thành giọt dịch sợi dịch vi khuẩn (dấu hiệu đặc trưng bệnh nguồn bệnh thức cấp quan trọng) (Phân biệt với đốm sọc vi khuẩn (Xoc) : Xoc xâm nhập chủ yếu qua khí khổng, nhân lên xoang khí khổng, sau phát triển gian bào nhu mô) 2.3 R Avr gen Các gen kháng lúa bắt đầu nghiên cứu Nhật IRRI khảng 30 năm trước Tạo giống kháng mang gen kháng chủ cách phòng chống hiệu bệnh bạc Cho tới (tính tới 2007), khoảng 29 gen kháng Xoo (ký hiệu từ Xa21 tới Xa29) khám phá lúa, số đó, 19 gen kháng trội Sáu gen (Xa1, Xa5, Xa21, Xa26 Xa27) phân lập giải trình tự Trong số gen này, gen Xa21 Xa26 có đặc điểm giống receptor Một số gen Xa quan trọng : Xa21 Đây gen số gen kháng phân lập lúa Xa21 phân lập từ lúa dại Oryzae longistaminata, chuyển vào giống IR24 để tạo dòng gần đẳng gen IRBB21 Xa21 protein xuyên màng giống receptor bề mặt có cấu tạo gồm đầu LRR bên ngồi màng có chức nhận biết, phần xuyên màng đầu có hoạt tính kinase có chức truyền tín hiệu Xa21 gen kháng chủ, trội, phổ rộng chống nhiều chủng Xoo (ít chứng minh nhiều chủng Ấn Độ, Philippin) Ngồi Xa21 có khả kháng cao đặc hiệu chủng Xoo thuộc race Nhật Bản sử dụng rộng rãi chương trình tạo giống kháng bạc Nhật Xa21 biểu lây nhiễm nhân tạo Xoo gây tổn thương giới Xa21 gen R qui định tính kháng vào giai đoạn trưởng thành lúa xa5 Đây gen kháng lặn, qui định tính kháng phổ rộng (ít chứng minh nhiều race Xoo Philippin Việt Nam) xa5 mã hóa tiểu phần γ yếu tố phiên mã TFIIA (yếu tố phiên mã hồn chỉnh ký hiệu TFIIAγ) Tính kháng lặn xa5 giải thích sau : xa5 Xa5 mã hóa isoform TFIIAγ (chỉ khác aa số 39) có lực liên kết khác với vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain – AD) AvrXa5 vi khuẩn (AvrXa5 Avr thuộc họ AvrBs3 vi khuẩn, chương 4) AvrXa5 liên kết với isoform TFIIAγ Xa5 (gen trội giống nhiễm) dẫn tới hoạt hóa gen ký chủ có lợi cho gây bệnh Trái lại AvrXa5 không liên kết với isoform TFIIAγ xa5 (gen lặn giống kháng) dẫn tới gen ký chủ có lợi cho gây bệnh khơng biểu hiện, hậu kháng bệnh Xa1 Đây gen kháng trội thuộc nhóm NBS-LRR Xa1 có đặc điểm cấu trúc chức tương tự gen RPS2 Arabidopsis, gen N thuốc gen L6 lanh Tổn thương giới nhiễm bệnh Xoo cảm ứng biểu gen Xa1 Xa1 qui định tính kháng cao phổ hep, chống chủng thuộc race1 cua Nhật 74 Xa27 Đây gen kháng phổ rộng chống nhiều chủng Xoo Tính kháng Xa27 di truyền theo kiểu bán trội Các allen locus Xa27 mã hóa cho protein đồng (có nghĩa protein Xa27 giống hệt protein xa27) Điều cho thấy khác tính kháng Xa27 tính mẫn cảm xa27 khác trình tự nts vùng promotor gen Xa27/xa27 Người ta chứng minh thực nghiệm gen Xa27 biểu nhiễm với Xoo mang gen AvrXa27 (là Avr thuộc họ AvrBs3 vi khuẩn, chương 4) AvrXa27 tương tác vơí vùng promotor gen Xa27, kích hoạt biểu gen dẫn tới tính kháng 2.4 Đa dạng vi khuẩn Xoo Vi khuẩn Xoo có tính đa dạng cao Tới (2007), khoảng 30 race vi khuẩn công bố từ nhiều nước giới dựa vào đặc tính gây bệnh giống thị dựa vào nghiên cứu phân tử Tuy nhiên, đánh giá độc lập nên race từ nước không giống (mặc dù chung ký hiệu) Ví dụ isolates Philippin chia thành 10 race (ký hiệu race 1, 10) isolates Trung Quốc chia thành races (cũng ký hiệu race 1, 3, 9) race Trung Quốc không tương ứng với race Philippin Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, có di chuyển vi khuẩn từ vùng sang vùng khác nhìn chung có khác quần thể Xoo nước Điều dẫn tới việc nghiên cứu mức độ đa dạng nước/vùng sinh thái cần thiết trước thực chương trình chọn tạo giống kháng bệnh bạc Các giống thị sử dụng phổ biến gồm giống/dòng gần đẳng gen (near isogenic lines) chứa gen kháng (single gene) vài gen (pyramid line) Ví dụ giống/dòng thị gen kháng tương ứng trình bày Bảng Tuy nhiên dòng đa gen (pyramid) thường biểu tính kháng với hầu hết chủng nên có giá trị phân biệt chủng Bảng Các dòng thị đẳng gen mang vài gen kháng vi khuẩn bạc Xoo Dòng Gen kháng IR24 IRBB1 Xa1 IRBB2 Xa2 IRBB3 Xa3 IRBB4 Xa4 IRBB5 xa5 IRBB7 Xa7 IRBB8 Xa8 IRBB10 Xa10 10 IRBB11 Xa11 11 IRBB13 xa13 12 IRBB14 Xa14 13 IRBB21 Xa21 14 IRBB50 Xa4 + xa5 15 IRBB51 Xa4 + xa13 16 IRBB52 Xa4 + Xa21 17 IRBB53 xa5 + xa13 18 IRBB54 xa5 + Xa21 18 IRBB55 xa13 + Xa21 20 IRBB56 Xa4 + xa5 + xa13 21 IRBB57 Xa4 + xa5 + Xa21 22 IRBB58 Xa4 + xa13 +Xa21 23 IRBB59 Xa5 + xa13 + Xa21 24 IRBB60 Xa4 + xa5 + xa13 + Xa21 75 2.5 Đa dạng Xoo Việt Nam Nghiên cứu hợp tác trường ĐHNNI ĐH Kyushu Nhật Bản giai đoạn 2001-2005 dựa phản ứng kháng nhiễm 11 dòng đẳng gen mang gen kháng đơn (dòng số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 13, bảng trên) cho thấy quần thể Xoo tỉnh phía bắc Việt Nam đa dạng gồm 12 race (chú ý, số nước dùng dòng đẳng gen tương tự phát thấy mức đa dạng lớn; chẳng hạn Nepal 26 races; Srilanka 14) Các race chiếm ưu miền Bắc Việt Nam, theo thứ tự, race (gen kháng: xa5, Xa7 Xa21), race (gen kháng: Xa4, xa5, Xa7 Xa21) race (gen kháng: Xa4, xa5, Xa7, Xa14 Xa21) 2.6 Các giống kháng nhiễm Việt nam Một số giống lúa cổ truyền Việt Nam Tẻ tép, tám có tính kháng cao Các giống lúa lai Trung Quốc Nhị ưu-838; Tạp giao Tạp giao nhiễm bệnh bạc cao Bệnh xoăn cà chua (begomovirus) Bệnh xoăn cà chua ghi nhận giới từ cuối năm 40 Israel Bệnh phát vùng Đông Nam Á, châu Phi châu Âu vào năm 80 Bệnh lần công bố châu Mỹ vào năm 1993 Hiện nay, bệnh xoăn vàng trở thành bệnh virus quan trọng cà chua khắp giới 3.1 Triệu chứng bệnh Bệnh xoăn vàng xuất triệu chứng vòng 2-4 tuần sau nhiễm bệnh phát triển đầy đủ triệu chứng vòng tháng Triệu chứng thay đổi theo điều kiện môi trường, giai đoạn sinh trưởng điều kiện sinh lý thời điểm nhiễm bệnh Triệu chứng sớm cong xuống vào phía bên Về sau, khơng có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép chót lan vào gân; cong lên phía thành hình thuyền; non biến vàng mạnh, giòn nhỏ hẹp Cuống xoắn vặn Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn Cây nhiễm sớm thường không hoa bị rụng Triệu chứng loài begomovirus khác gây cà chua thường tương tự 3.2 Nguyên nhân gây bệnh 3.2.1 Tác nhân gây bệnh phức hợp loài Trước năm 90, tác nhân gây bệnh xoăn vàng cà chua xác định begomovirus (chi Begomovius, họ Geminiviridae) truyền qua bọ phấn (Bemisia tabaci) gây Các begomovirus gây bệnh thường đặt tên theo ký chủ (tomato) triệu chứng (chủ yếu dạng xoăn (leaf curl) biến vàng (yellow)) nên tên virus gây bệnh thường “Tomato yellow leaf curl virus” tên isolate virus gây bệnh thường kèm theo từ địa phương nơi bệnh xuất hiện; ví dụ Tomato yellow leaf curl - Is (TYLCV-Is) phân lập từ Israel, Tomato yellow leaf curl – Th (TYLCV-Th) phân lập từ Thái Lan Do có lựa chọn việc đặt tên, tác giả có xu hướng lấy triệu chứng xoăn “leaf curl” để đặt tên virus; chẳng hạn Tomato leaf curl virus-Au (ToLCV-Au) phân lập từ Úc Tomato leaf curl Guzarat virus (ToLCGV) virus tạo triệu chứng biến vàng cà chua 76 Từ năm 90 trở lại đây, tiến công nghệ sinh học cho phép giải trình tự tồn bộ gen virus cách dễ dàng Dựa vào phân tích phân tử, Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (International Committee on Taxonomy of Viruses -ICTV) xác định ngưỡng phân biệt loài begomovirus 89 % tương đồng chuỗi nucleotide cho DNA-A Chỉ tiêu cho phép tách nhiều begomovirus, vốn xem isolate khác loài gây bệnh xoăn vàng cà chua, thành lồi phân biệt; ví dụ TYLCV-Ch trở thành loài Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV), TYLCV-Th trở thành loài Tomato yellow leaf curl Thailand virus (TYLCSV) isolate TYLCV-Is phân lập từ Israel, quyền ưu tiên, cơng nhận lồi Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) Tương tự, Tomato leaf curl virus – Taiwan (ToLCV-TW) trở thành loài Tomato leaf curl Taiwan virus (ToLCTWV) isolate ToLCV-Au phân lập từ Úc, quyền ưu tiên, công nhận Tomato leaf curl virus (ToLCV) Như vậy, tác nhân gây bệnh xoăn vàng cà chua xem phức hợp lồi khác Hiện có khoảng 40 lồi begomovirus hại cà chua công bố giới với triệu chứng phân biệt Hậu là, dựa triệu chứng quan sát, bệnh gán cho loài begomovirus cụ thể danh tính virus xác định 3.2.2 Hình thái begomovirus gây bệnh xoăn vàng cà chua Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng cà chua nói riêng begomovirrus nói chung thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus) Các geminivirus có cấu trúc phân tử (virion) tương tự bao gồm hình cầu 20 mặt (icosahedron) nối với để tạo phân tử hình cầu đa diện kép (gemini) 3.2.3 Đặc điểm gien begomovirus gây bệnh xoăn vàng cà chua Các begomovirus virus thực vật có gien DNA vòng đơn có kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb Chúng có gien kép gồm phân tử DNA sợi vòng đơn gọi DNA-A DNA-B có gien đơn tương đương DNA-A Đối với virus có gien đơn DNA-A chúng chứa gien tổ chức theo chiều ngược Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có gien (i) V1 mã hóa vỏ protein có chức tạo vỏ phân tử virus, lan truyên qua vector, vận chuyển gien virus vào khỏi nhân tế bào ký chủ vận chuyển gien virus tế bào; (ii) V2 mã hóa protein V2 có chức liên quan đến vận chuyển virus tế bào Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) có gien (i) C1 mã hóa protein tái sinh hay gọi protein Rep có chức cắt - nối gien virus vị trí đặc biệt vùng nguồn gốc tái sinh tương tác với protein ký chủ để tạo điều kiện thuận lợi cho tái sinh virus, (ii) C2 mã hóa protein hoạt hóa phiên mã, (iii) C3 mã hóa protein tăng cường tái sinh (iv) C4 mã hóa protein C4 với chức liên quan đén phổ ký chủ phát triển triệu chứng Giữa vùng gen mã hóa ngược chiều vùng không mã hóa chứa nguồn gốc tái sinh (ori = origin of replication) gồm (i) chuỗi lặp đảo (iteron) cần thiết cho nhận biết gắn kết protein Rep (ii) cấu trúc thân – thòng lọng chuỗi TAATACTAT vùng thòng lọng giống tất begomovirus vị trí TA cuối nơi protein Rep cắt nối gien begomovirrus trình tái sinh Đối với begomovirus có gien kép DNA-A có tổ chức gienome chức gien tương tự DNA-A begomovirus có gien đơn (tên gien 77 thêm ký tự A vào đằng trước thành AV1, AV2, AC1, AC2, AC3 AC4); DNA-B chúng chứa gien xếp theo chiều ngược mã hóa protein (i) protein thoi có chức vận chuyển gien virus vào khỏi nhân tế bào (ii) protein vận chuyển có chức vận chuyển gien virus tế bào ký chủ 3.3 Xâm nhiễm gây bệnh 3.3.1 Lan truyền begomovirus Tất begomovirus lan truyền tự nhiên nhờ bọ phấn (B tabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn Chưa có chứng chứng minh begomovirus nhân lên thể bọ phấn Bọ phấn dùng vòi cho vào mơ mạch dẫn để hút dịch từ mạch phloem Virus hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang thể, đạt tới tuyến nước bọt cuối vào ống nước bọt Nghiên cứu với TYLCV cho thấy thời gian chích nạp chích truyền tối thiểu bọ phấn khoảng 15 – 20 phút Kể từ bắt đầu chích nạp, virus phát có mặt phần đầu sau khoảng 10 phút, ruột giữa.sau khoảng 50 phút, xoang thể sau khoảng 90 phút tuyến nước bọt sau khoảng Thời gian từ virus phát thấy tuyến nước bọt tới bọ phấn truyền bênh khoảng Như thời kỳ ẩn TYLCV thể bọ phấn khoảng 3.3.2 Tái sinh (sinh sản) begomovirus Begomovirus, giống geminivirus khác, tái sinh theo chế vòng lăn (rolling circular mechanism) Cơ chế vòng lăn chia làm pha thực nhân tế bào ký chủ Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gien có mặt phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép gien virus chuyển vào nhân tế bào Như sợi kép gồm sợi virus sợi tương đồng virus Pha chưa hiểu rõ Pha tái sinh theo chế vòng lăn: Protein Rep (sau tổng hợp) cắt sợi virus chuỗi bảo toàn TATATTAC Nhờ vật liệu enzyme DNA polymearase tế bào, sợi virus tổng hợp liên tục sợi tương đồng virus Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus tổng hợp chuỗi TATATTAC (cũng vừa tổng hơp) thành sợi virus hoàn chỉnh dạng sợi đơn mạch thẳng Protein Rep sau nối đầu mạch thẳng để tạo gien virus sợi đơn mạch vòng hồn chỉnh 3.4 Tính kháng begomovirus 3.4.1 Tính kháng begomovirus thông qua gen kháng Cho tới nay, người ta chưa phát thấy gen kháng R chống lại begomovirus cà chua trồng (Lycopersicon esculentum) Tuy nhiên số gen kháng chống lại begomovirus phát thấy số giống cà chua dại Ví dụ Ty1 gen phân lập từ cà chua dại (Lycopersicon chilense) gen kháng trội khơng hồn tồn Ty1 dường tương tác với protein chịu trách nhiệm di chuyển virus để tạo tính kháng Ty-1 chuyển vào cà chua trồng để tạo giống kháng 3.4.2 RNA silencing begomovirus RNA silencing chế quan trọng (cũng nấm, động vật) nhằm điều hòa biểu gen chống xâm nhiễm virus Cây có số đường hướng silencing, 78 quan trọng đường hướng RNA silencing thông qua siRNA Đây đường hướng xảy tế bào chất trường hợp chống xâm nhiễm virus gồm bước sau: Hình thành dsRNA tế bào chất Các virus RNA thực vật trình tái sinh hình thành sản phẩm trung gian dsRNA Các begomovirus, gen mã hóa theo chiều ngược dẫn sản phẩm phiên mã chúng (các transcripts) gối lên tương đồng đầu 3’ Phần tương đồng gối lên bắt cặp để tạo đoạn dsRNA Các protein Dicer (là endonuclease thuộc RNAse nhóm 3, chịu trách nhiệm cắt phân tử RNA sợi kép) tế bào ký chủ cắt đoạn dsRNA thành phân tử dsRNA nhỏ có kích thước 21-22 nts gọi siRNA Các phân tử siRNA sợi kép tách thành phân tử siRNA sợi đơn kết hợp với phân tử protein tế bào tạo thành phức hợp RISC (RNA Induced Silencing Complex), chứa RNA endonuclease Argonaute (ký hiệu AGO) RISC nhận biết phân tử RNA virus tế bào chất tương đồng với siRNA Đoạn siRNA sợi đơn bắt cặp đặc hiệu với phần tương đồng phân tử RNA virus AGO RISC cắt phân tử RNA virus RNA silencing chế chống lại virus virus có chế để chống lại silencing Người ta chứng minh thực nghiệm C4 (hay AC4) begomovirrus ức chế đường hướng RNA silencing ký chủ tế bào chất 3.5 Bệnh xoăn cà chua Việt Nam Trong số bệnh virus hại cà chua Việt Nam, bệnh xoăn vàng xem bệnh quan trọng Hiện tỉ lệ nhiễm bệnh xoăn ruộng trồng cà chua thường cao, có tới 100 % Ở Việt Nam, có lồi begomovirus phát gây bệnh xoăn cà chua Loài thứ Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), phân lập từ cà chua bị bệnh xoăn miền Bắc vào năm 2001 Loài thứ hai Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi (TYLCKaV), phân lập tỉnh Kanchanaburi (Thái Lan) vào năm 2002 phát thấy cà chua Việt Nam vào năm 2005 Gần đây, từ mẫu cà chua bị bệnh xoăn thu thập Hà Nội, với ToLCVV, loài begomovirus thứ ba phân lập Các phân tích phân tử cho thấy loài thứ ba loài đặt tên Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) TYLCVNV ToLCVV chia sẻ vùng khoảng 1000 nts gần đồng bên trái gen 79 CHƯƠNG CHỌN TẠO GIỐNG KHÁNG Giới thiệu Các nhà chọn giống sản xuất nhận giá trị tính kháng bệnh trồng từ đầu kỷ 19 Ngày nay, việc chọn tạo giống kháng dịch hại trở nên quan trọng mức độ thâm canh ngày tăng người hiểu rõ ảnh hưởng bất lợi môi trường sức khỏe việc sử dụng biện pháp hóa học Các kỹ thuật công nghệ sinh học giúp nhà chọn giống kháng hiểu rõ chế tương tác tác nhân gây bệnh, đa dạng quần thể tác nhân gây bệnh chất gen kháng bệnh Các kiến thức sở khoa học cho chương trình chọn tạo giống kháng Giống kháng bệnh thành phần quan trọng chiến lược phòng chống dịch nào; sẵn có, sử dụng giống kháng biện pháp phòng chống hiệu nhất, rẻ tiền nơng dân Các bước chương trình chọn tạo giống kháng bao gồm Xác định mức độ đa dạng quần thể tác nhân gây bệnh Xác định nguồn gen kháng Lựa chọn gen kháng phù hợp Chuyển gen vào giống ưu tú Chọn lọc đánh giá dòng/giống ưu tú mang gen kháng Đánh giá qui mô đồng ruộng Đăng ký ứng dụng Các bước trên, tương tự bước chọn tạo giống mang tính trạng nơng học Các kỹ thuật lai chuyển gien tham khảo nhiều giáo trình chọn giống cơng nghệ sinh học Dưới trình bày số chủ đề ý liên quan đến chọn tạo giống kháng bệnh Đa dạng quần thể tác nhân gây bệnh 2.1 Đa dạng tác nhân gây bệnh Các cá thể loài tác nhân gây bệnh vùng địa lý thường không đồng Chúng tồn dạng chủng (race, strain), type sinh học (biotype), nòi sinh học (biovar, pathovar = pv.), dạng chuyên hóa (forma specialis = f.sp.) Cần ý khái niệm race, strain nêu khái niệm phân loại khơng thức mức loài thường khác khơng tương đương nhóm/lồi tác nhân gây bệnh (thường nhà khoa học nghiên cứu nhóm/lồi tác nhân qui định) Ngồi ra, dựa vào nghiên cứu phả hệ (phylogenetic), thường nghiên cứu phân tử, quần thể tác nhân gây bệnh xếp vào nhóm phả hệ khác (phylogenetic group) Các nhóm đa dạng khác tính gây bệnh/tính độc loài/giống ký chủ tương ứng Do vậy, để tạo giống kháng bệnh áp dụng cho vùng đó, đầu tiên, người ta cần phải biết mức độ đa dạng tác nhân gây bệnh 80 Một số ví dụ mức độ đa dạng: Nấm Pyricularia oryzae (bệnh đạo ôn lúa): xem chương Nấm Fusarium oxysporum Đây loài nấm đa dạng, gây bệnh héo mạch dẫn nhiều lồi thực vật có hoa Lồi gồm khoảng 100 dạng chuyên hóa (formae speciales = số nhiều) tính gây bệnh lồi trồng khác Mỗi dạng chuyên hóa lại bao gồm chủng khác dựa tính gây bệnh giống khác Ví dụ: Fusarium oxysporum f.sp cubense gây hại thuộc họ Musaceae Heliconeaceae (bộ Zingiberales) Dạng chun hóa này, tính gây bệnh giống chuối lại chia thành race race 1, race 2, race race Trong race này, race nhiễm chủ yếu giống Cavendish (AAA) = nhóm chuối tiêu, lại chia tiếp thành race nhiệt đới (tropical race 4) race cận nhiệt đới (subtropical race 4) 2.2 Các kỹ thuật dùng để nghiên cứu mức độ đa dạng tác nhân gây bệnh là: 2.2.1 Sử dụng giống thị (khái niệm ví dụ: xem chương ) 2.2.2 Các phân tích phân tử Nhiều kỹ thuật phân tử sử dụng để đánh giá mức độ đa dạng tác nhân gây bệnh Nguyên lý ứng dụng kỹ thuật tham khảo nhiều tài liệu tiếng Việt, tiếng Anh internet Dưới tóm tắt số kỹ thuật phổ biến nghiên cứu đa dạng tác nhân gây bệnh RAPD (random amplified polymorphic DNA) Kỹ thuật dựa phản ứng PCR sử dụng mồi ngẫu nhiên Các mồi ngẫu nhiên có kích thước khoảng khoảng 10 nts phản ứng PCR với mồi nhìn chung có Ta thấp (khoảng 34-37 OC) Ưu diểm kỹ thuật đơn giản, khơng đòi hỏi biết trước thơng tin trình tự gien tác nhân gây bệnh đánh giá mức độ đa hình tồn bộ genome Mức độ đa hình hình thành sai khác vị trí gắn mồi sai khác độ dài (mất đoạn, thêm đoạn) vị trí gắn mồi Nhược điểm lớn điều kiện PCR thường khác phòng thí nghiệm dẫn tới kết không thống RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Kỹ thuật gồm bước sau  Tinh chiết DNA tác nhân gây bệnh Vì bước cắt enzyme cắt giới hạn (RE = restriction enzyme) nên chất lượng DNA yêu cầu phải thật khiết  Cắt DNA RE  Lai hóa (Southern blot) sản phẩm cắt với dò (probe) đặc hiệu Việc chọn lựa dò quan trọng đảm bảo cho băng đa hình (polymorphism) hình thành đủ để phân biệt mẫu  Phân tích mức độ đa hình phần mềm thích hợp Ví dụ: Adhikari et al (1995): 308 mẫu Xoo thu thập từ nhiều nước châu Á đánh giá mức độ đa dạng kỹ thuật RFLP DNA vi khuẩn sau tinh chiết cắt với EcoRI BamHI Hai loại dò sử dụng (i) đoạn chứa nguyên tố lặp (repetitive element) (ii) đoạn chứa gen AvrXa10 Kết phân tích cho thấy mẫu Xoo châu Á gồm cụm, vừa phân bố độc lập theo quốc gia, vừa có di chuyển nước 81 AFLP (Amplified Restriction Fragment Polymorphism) Đây kỹ thuật kết hợp ưu điểm RFLP PCR Sức mạnh AFLP khả kiểm tra mức độ đa hình toàn bộ genome tác nhân gây bệnh Kỹ thuật gồm bước sau:  Tinh chiết DNA tác nhân gây bệnh Vì bước cắt enzyme cắt giới hạn nên, giống kỹ thuật RFLP, chất lượng DNA yêu cầu quan  Cắt DNA RE, thường ER có chuỗi cắt (như EcoRI) ER có chuỗi cắt phổ biến  Nối sản phẩm cắt với adaptor (chứa chuỗi ER) Sản phẩm nối khn cho phản ứng PCR Trình tự adapter trình tự RE trình tự găn mồi bước  PCR lần (preselective amplification): sử dụng mồi tiền chọn lọc Trình tự mồi tiền chọn lọc trình tự adapter + trình tự RE + nucleotid thêm vào đầu 3’ Sản phẩm PCR lần (hòa lỗng) sử dụng làm khuôn cho PCR lần Chú ý: số protocol, mồi tiền chọn lọc không chứa nucleotid bổ sung  PCR lần (selective amplification): sử dụng mồi chọn lọc Trình tự mồi chọn lọc trình tự mồi tiền chọn lọc + nucleotid thêm vào đầu 3’ Số lượng nucleotid (1,2,3) thêm vào đầu 3’ tăng mức độ chọn lọc đồng thời giảm số sản phẩm PCR tương ứng từ 4, 16 64 lần) Một mồi chọn lọc thường đánh dấu xạ huỳnh quang nhằm phân tích điện di tự động Nhiều cặp mồi chọn lọc được sử dụng để đánh giá xác mức độ đa hình  Sản phẩm PCR băng chung + băng khác mẫu Các băng khác DNA đa hình hình đánh giá dùng phần mềm thích hợp Ví dụ Nguyễn Thị Ninh Thuận (2006): 114 mẫu P oryzae thu thập miền Bắc phân tích dùng kỹ thuật AFLP RE sử dụng EcoRI MseI Mồi tiền sử dụng EcoRI primer (5’- GACTGCGTACCAATTC-3’, không chứa nt bổ sung) MSEI primer (5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’, không chứa nt bổ sung) Tác giả sử dụng cặp mồi chọn lọc để tạo 733 sản phẩm AFLP-PCR 160 sản phẩm đa hình (xem thêm chương 6) Sequencing Kỹ thuật giải trình tự thực dễ dàng nhiều phòng thí nghiệm Nghiên cứu phả hệ dựa vào chuỗi nucleotid hay aa thường phản ánh xác mối quan hệ mức độ đa dạng quần thể tác nhân gây bệnh chọn vùng gen thích hợp Hiện nhiều loại vector dòng hóa thuộc nhóm vector TA sẵn có thị trường tạo điều kiện cho việc dòng hóa nhanh chóng sản phẩm PCR mà khơng cần phải xử lý enzym RE Sản phẩm PCR giải mã trực tiếp khơng cần dòng hóa Ví dụ Đối với potyvirus (chi Potyvirus, họ Potyviridae), gen mã hóa vỏ protein (CP = Coat Protein) gen thường sử dụng nhiều cho mục đích phân loại nghiên cứu đa dạng Các nghiên cứu gần dựa vào trình tự gen CP số potyvirrus thu thập Việt Nam cho thấy Papaya ring spot virus (PRSV) gây bệnh đốm hình nhẫn đu đủ Việt Nam (1) đa dạng, (2) chia thành cụm miền Nam miền Băc, (3) số mẫu chia xẻ mức độ tương đồng cao với chuỗi có nguồn gốc nước ngồi Philippin, Nhật Bản, Đài Loan Tương tự, số 13 potyvirrus phân tích, virus Bean common mosaic virus (BCMV), Sugarcane mosaic virus Potatovirus Y (PVY) có mức độ đa dạng cao Hơn nữa, số isolate BCMV SCMV có vị trí nằm gốc phả hệ (được phân tích với phần lớn chuỗi sẵn có GenBank) cho thấy dường Việt Nam trung tâm đa dạng virus Mức độ đa dạng cao 82 potyvirrus kể dẫn tới khó khăn đáng kể áp dụng biện pháp phòng chống dựa tính đặc hiệu trình tự (chẳng hạn RNA silencing) Xác định nguồn gen kháng 3.1 Sự đa dạng thực vât Cây trồng ngày kết q trình chọn lọc nhân giống dạng/dòng vốn tiến hóa tự nhiên nhiều vùng địa lý qua hàng triệu năm Sự tiến hóa loài từ tổ tiên hoang dại tới trồng ngày diễn chậm và, trình tiến hóa tạo vơ số biến dị mà nhiều số chúng tồn tới ngày dạng loài hoang dại Mặc dù nhiều lồi hoang dại khơng có ý nghĩa nông nghiệp đa dạng sống sót chúng đương đầu vói nhiều tác nhận gây bệnh chứng tỏ chúng mang gen kháng chống lại tác nhân gây bệnh Khi người bắt đầu làm nông nghiệp, họ chọn số dạng dại để trồng Ở vùng, thích ứng với điều kiện thời tiết địa phương, cho suất chất lượng tốt chống chịu công dịch hại đặc trưng địa phương tiếp tục chọn lọc Quá trình chọn lọc xem tác động yếu tố (i) tự nhiên, (ii) dịch hại (iii) người Hai yếu tố đầu loại bỏ cá thể yếu đuối mẫn cảm yếu tố thứ giữ lại cá thể có suất tốt số cá thể sống sót Vì q trình chọn lọc diễn tương đối độc lập nên hậu laf có nhiều giống trồng mang đặc điểm chống chịu khác giới Trong kỷ 20 21, người tiến hành chương trình chọn tạo giống mang tính hệ thống hơn, dựa vào kiến thức ký sinh, trồng tương tác chúng Tuy nhiên xét mức độ đa dạng trồng, chia làm giai đoạn Lúc đầu, mức độ đa dạng cao nhà chọn giống, trình tìm kiếm gen gen hữu ích (năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu dịch hại tốt, đồng nhất, thời gian sinh trưởng ngắn ) lai giống có nguồn gốc khác (địa phương, nhập nội, dại ) chí gây đột biến nhân tạo tạo vơ số dòng/giống có kiểu gen khác Gần đây, mức độ đa dang có xu hướng giảm nhà chọn giống có xu hướng tổng hợp gen tốt vào số giống loại bỏ giống khơng tốt Trong nhiều trường hợp, giống tốt lại trồng diện tích lớn Khi ký chủ đồng mặt di truyền, đặc biệt xét tới gen kháng bệnh, trồng diện tích lớn, có khả lớn chủng tác nhân gây bệnh xuất công ký chủ này, dẫn tới vụ dịch Do đồng di truyền, tốc độ phát triển dịch bệnh cao nhất, nhìn chung, bắt gặp trồng nhân giống vơ tính (Vd khoai tây, mía…); tốc độ trung bình bắt gặp trồng tự thụ (Vd lạc…); tốc độ thấp bắt gặp giao phấn (Vd ngơ…) Điều giải thích hầu hết dịch bệnh quần thể thực vật tự nhiên, vốn có kiểu gen khơng đồng nhất, lại phát triển chậm 3.2 Nguồn gen kháng Nguồn gen kháng bệnh có chung ”bể gen” gen qui định tính trạng di truyền khác ”Bể gen” giống địa phương trồng, giống nhập nội, giống địa phương cổ truyền, giống bị loại bỏ, loài họ hàng hoang dại giống gây đột biến nhân tạo Thơng thường, gen kháng bệnh tìm thấy sống sót nơi có áp lực bệnh cao nơi có bệnh nặng Trong trường hợp khơng thể tìm thấy sống sót nơi có bệnh nặng gen kháng tìm lồi tương ứng trồng nơi khác tìm 83 họ hàng hoang dại Một khả để tìm nguồn gen kháng tìm trung tâm khởi nguyên tác nhân gây bệnh tồn lâu dài với có mặt bệnh chứng tỏ chúng phải mang gen kháng Tương tự nguồn gen kháng tìm thấy trung tâm khởi nguyên Thuyết Vavilop đồng tiến hóa ký sinh – ký chủ  Vùng khởi nguyên xuất sứ loài trồng trung tâm hình thành phong phú loại, dạng, giống lồi trồng dại Nhưng trung tâm hình thành đầy đủ lồi, dạng, chủng, nòi ký sinh nhờ có q trình tiến hố chọn lọc tự nhiên KS KC diễn lâu đời  Tính đa dạng trồng ký sinh vùng thể qua trình biến dị mạnh mẽ nhất, nhờ xuất tích luỹ nhiều giống có tính kháng cao đồng thời xuất tích luỹ nhiều chủng ký sinh có tính độc cao  Quan hệ ký sinh ký chủ ln biến động song đảm bảo cân bền ký sinh ký chủ tạo thuận lợi cho phát triển phía Phía trồng có đặc tính chống bệnh mới, đồng thời tạo cho ký sinh có độc tính để vựot qua tính kháng trồng  Trong mối quan hệ đồng tiến hố tiến hố khởi đầu thấy lồi ký chủ sau xuất chủng ký sinh có tính độc để tồn Vậy cần tìm kiếm nguồn gen kháng loài cây, giống vùng địa lý, xuất sứ khởi nguyên chúng giới Nguồn gen kháng nguồn vật liệu nguyên thuỷ có triển vọng lai tạo chọn lọc giống có tính miễn dịch kháng sâu bệnh Lựa chọn gen kháng 4.1 Vai trò tính kháng ngang kháng dọc tạo giống kháng 4.1.1 Tính kháng dọc Tính kháng dọc thường một vài gen qui định nên gọi tính kháng đơn gen Các gen điều khiển bước/sự kiện quan trọng q trình phát triển bệnh gọi gen kháng chủ Chỉ cần một vài gen kháng chủ tạo tính kháng Tính kháng dọc mang tính đặc hiệu cao, nhằm vào chủng tác nhân gây bệnh chống chủng tương thích tác nhân gây bệnh (nên gọi tính kháng đặc hiệu chủng) Di truyền tính kháng dọc tuân theo qui luật di truyền Mendel quan hệ gen ký chủ qui định tính kháng dọc gen tương ứng ký sinh quan hệ gen-for-gen Cây mang tính kháng dọc nhìn chung kháng hồn tồn tác nhân gây bệnh Hơn tính kháng dọc dễ thao tác (phân lập, chuyển gen, đánh giá) chương trình nhân giống nên thường ưa thích Tính kháng dọc, hiệu chống lại chủng tương ứng tác nhân gây bệnh nhìn chung khơng bền vững Tính kháng bị xuất quần thể tác nhân gây bệnh chủng khơng tương thích (từ nơi khác tới chủng bị kháng đột biến) có khả gây bệnh (xem thêm phần đồng tiến hóa R-Avr chương 4) Tính kháng dọc, vậy, có hiệu khi:  Được tổng hợp vào hàng năm dễ nhân giống cốc hạt nhỏ (lúa mỳ, lúa ) 84  Nhằm chống loại tác nhân gây bệnh không sinh sản phát tán nhanh nấm Fusarium, không đột biến nhanh nấm Puccinia  Bao gồm gen kháng chủ đủ ”mạnh” để bảo vệ hoàn toàn lâu dài ký chủ  Quần thể ký chủ không gồm giống đồng di truyền trồng vùng rộng lớn Nếu nhiều điều kiện không đáp ứng tính kháng dọc nhanh chóng bị phá vỡ Ngồi ra, tính kháng dọc, mức độ kháng cao nên tạo áp lực chọn lọc lớn lên quần thể tác nhân gây bệnh dẫn tới dễ hình thành chủng tác nhân gây bệnh Vì tính kháng dọc dễ bị bẻ gẫy chủng tác nhân gây bệnh độc hình thành nên nhiều chiến lược áp dụng để khắc phuch nhược điểm chẳng hạn hỗn hợp giống tạo giống mang nhiều gen kháng chủ Hỗn hợp giống (cultivar mixture) Trong trồng trọt, người ta làm giảm phát triển dịch bệnh cách tạo đa dạng di truyền loài trồng Phương pháp đơn giản để tạo đa dạng hỗn hợp giống (cultivar mixture) Hỗn hợp giống hỗn hợp giống giống đặc trưng nông học thời gian sinh trưởng, phát triển, chất lượng hình dạng hạt khác gen kháng Hỗn hợp giống khơng chống hồn toàn bệnh làm giảm đáng kể tốc độ phát triển bệnh nhờ chế: (i) Khoảng cách mẫn cảm tăng dẫn tới giảm tốc độ phát tán (ii) Tương tự, tạo rào cản vật lý giống có tính kháng cao (iii) Tạo tính kháng tạo chủng khơng độc gây (iv) Thay đổi vi khí hậu theo hướng bất lợi cho bệnh Vd thí nghiệm hỗn hợp giống lúa nếp (mẫn cảm với nấm đạo ơn, có chiều cao cao 35-40 cm ) giống lúa tẻ, số ngày với ẩm độ 100% vào sáng ruộng thí nghiệm giảm từ 20 ngày xuống khoảng ngày diện tích lúa nếp bị phủ sương giảm từ 84% xuống 36% (Zhu et al 2005) Kết TLB giống lúa nếp giảm 90% Hỗn hợp giống đặc biệt có ý nghĩa bệnh hại phần mặt đất đa chu kỳ Ví dụ: TQ, đến năm 2000, >3000 lúa tỉnh Vân Nam áp dụng phương pháp hỗn hợp giống để chống bệnh đạo ôn, TLB giảm – 20 % Tham http://199.86.26.56/education/AdvancedPlantPath/Topics/cultivarmixtures/ khảo : Tổng hợp nhiều gen kháng giống Người ta lai giống mang gen kháng khác để tạo giống chứa nhiều gen kháng Thơng thường tính kháng giống mang nhiều gen kháng chủ thường bền vững tác nhân gây bệnh khơng dễ đột biến đồng thời để bẻ gẫy nhiều gen kháng Tuy nhiên, việc tạo giống mang nhiều gen kháng phức tạp 4.1.2 Tính kháng ngang Tính kháng ngang thường nhiều gen qui định (nên gọi tính kháng đa gen), gen đóng góp mức độ nhỏ vào tính kháng (nên gọi tính kháng gen thứ) Tính kháng ngang di truyền theo qui luật di truyền số lượng (nên gọi tính kháng số lượng) 85 Tính kháng ngang qui đinh tính kháng khơng hồn tồn bền vững Tính kháng ngang khơng bị bẻ gẫy nhanh tính kháng dọc Tính kháng ngang liên quan đến nhiều trình dẫn tới phản ứng phòng thủ Tính kháng ngang có mặt khắp nơi, trồng lẫn dại, chống tất chủng tác nhân gây bệnh kể chủng độc (nên gọi tính kháng khơng đặc hiệu) Tính kháng ngang (tính kháng bản) nhìn chung có mức độ kháng thấp tạo áp lực chọn lọc thấp lên quần thể tác nhân gây bệnh Có thể tóm tắt tính kháng dọc ngang bảng sau Chỉ tiêu 1.Số lượng gen kháng Giống kháng dọc vài gen kháng (đơn gen) Giống kháng ngang Nhiều gen kháng(đa gen) 2.Tính (chọn lọc) Rất chun tính Khơng chun tính chuyên tính gen kháng 3.Mức độ kháng Cao Thấp 4.Tính ổn định Khơng bền vững ) Bền vững Kháng chủng Hầu hết chủng thành phần chủng trong quần thể ký sinh quần thể ký sinh 6.Tác động gen Thúc đẩy phát sinh Không thúc đẩy kháng vào quần thể ký sinh hình thành nòi, race phát sinh hình thành nòi (áp lực chọn lọc) (chủng có độc tính cao hơn) race (quần thể ký sinh ổn định lâu dài) 8.Phản ứng tự vệ Thường phản ứng Các phản ứng khác siêu nhạy 9.Di truyền Theo quy luạt di Theo di truyền số truyền Mendel, phần lớn di lượng truyền tính trội 10 Ảnh hưởng Ít bị ảnh hưởng Dễ bị ảnh hưởng ngoại cảnh 4.2 Lựa chọn gen kháng Việc lựa chọn gen kháng yếu tố kháng vào nhiều yếu tố, quan trọng mức độ đa dạng quần thể tác nhân gây bệnh, đặc tính gây bệnh tính độc quần thể tác nhân gây bệnh đặc biệt chủng, nòi chiếm ưu Ngồi gen lựa chọn nên có khả kháng phổ rộng  Ví dụ Đối với bệnh đạo ôn miền Bắc Việt Nam, gen kháng Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pita2, Pi-k nên sử dụng để tạo giống kháng nấm đạo ơn  Ví dụ Đối với bệnh bạc miền Bắc Việt Nam, race 5, chiếm ứu quần thể vi khuẩn bạc nên gen kháng xa5, Xa7 Xa21 nên sử dụng  Ví dụ Đối với bệnh xoăn vàng cà chua begomovirus, trường hợp sử dụng kỹ thuật kháng dựa vào RNA silencing, người ta nên chọn vùng gen gen bảo thủ cho chi begomovirus, chẳng hạn đầu C gen CP đầu N gen Rep để tạo cấu trúc RNA silencing chuyển vào cà chua Sử dụng marker phân tử chọn tạo giống kháng 86 Nhiều loại marker phân tử (phổ biến marker dựa RFLP PCR) sử dụng để (i) tìm kiếm gen kháng từ vật liệu khởi đầu (các dòng/giống trồng dại thu thập được) để chọn lọc giống mang gen kháng tạo thông qua lai giống chuyển gen công nghệ sinh học Việc kết hợp marker phân tử công cụ đánh giá truyền thống khác lây nhiễm nhân tạo tiết kiệm nhiều thời gian tiền bạc trình chọn tạo giống kháng  Ví dụ Đối với bệnh đạo ôn, Wang et al (2007) sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen Pita để thử 141 mẫu lúa thu thập từ nhiều nơi giới Trong số này, 20 mẫu lúa xác định mang gen kháng trội Pi-ta, thu thập chủ yếu nước trồng lúa châu Á (trong có giống Tetep – giống cổ truyền Việt Nam)  Ví dụ Đối với bệnh bạc lá, Huang et al (1997) sử dụng marker phân tử dựa vào RFLP PCR để qui tụ gen kháng Xa4, xa5, xa13 Xa21 vào giống lúa Đánh giá tính kháng Đối với chọn tạo giống kháng bệnh, việc đánh giá tính kháng ln phần quan trọng trình chọn lọc cá thể mang gen kháng sau lai chuyển gen trình tìm kiếm vật liệu khởi đầu Đánh giá tính kháng yêu cầu yếu tố  Phương pháp lây nhiễm  Điều kiện lây nhiễm  Hệ thống tính điểm xác Cả yếu tố khác tùy thuộc đối tượng nghiên cứu (cả tác nhân gây bệnh)  Ví dụ Đối với bệnh bạc Phương pháp lây nhiễm dùng kéo nhúng vào dung dịch vi khuẩn cắt đỉnh lúa Phản ứng kháng nhiễm đánh giá chiều dài vết bệnh sau 18 ngày  Ví dụ Đối với bệnh xoăn vàng Phương pháp lây nhiễm sử dụng vector bọ phấn dùng kỹ thuật gọi agroinoculation Phản ứng kháng nhiễm đánh giá dùng thang phân cấp thứ tự (dựa theo mức độ biểu triệu chứng) trình bày bảng Thang phân cấp bệnh xoăn vàng cà chua Cấp Mô tả Không triệu chứng Biến vàng nhẹ mép chét đỉnh Biến vàng nhẹ đỉnh chét nhẹ Biến vàng nhiều, và cng thành hình thía Cây sinh trưởng Biến vàng lùn dội; cong lại thành hình thìa rõ Cây ngừng sinh trưởng 87 ... miễn dịch động vật thực vật Trong năm gần đây, nhà nghiên cứu thường so sánh tính kháng thực vật với tính miễn dịch động vật áp dụng nhiều khái niệm miễn dịch động vật vào nghiên cứu tính kháng thực. .. thực vật Cơ chế miễn dịch động vật với tính kháng thực vật chia sẻ nhiều điểm khác có nhiều điểm giống 3.1 Sự khác Sự khác dễ thấy động vật máu nóng có hệ miễn dịch thực vật khơng có Hệ miễn dịch. .. Đối tượng nghiên cứu Lịch sử miễn dịch động vật 2.1 Lịch sử miễn dịch thực vật So sánh miễn dịch động vật thực vật 3.1 Sự khác 3.2 Sự giống