BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG BÙI HUY CHÍCH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII DOTY (DOTY) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN SURIMI LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2017 i BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG BÙI HUY CHÍCH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII DOTY (DOTY) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN SURIMI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 60.54.10.05 Người hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Văn Ninh PGS TS Vũ Ngọc Bội KHÁNH HÒA - 2017 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án Trước hết xin gửi tới Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sau đại học Ban Chủ nhiệm Khoa Cơng nghệ Thực phẩm kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu Trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin giành cho TS Đỗ Văn Ninh - Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Thái Bình Dương TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang tận tình hướng dẫn động viên tơi suốt trình thực luận án Xin chân thành cám ơn: PGS TS Trang Sỹ Trung - Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Nha Trang, PGS TS Nguyễn Anh Tuấn - Bộ môn Công nghệ Chế biến Thủy sản thầy cô phản biện cho lời khun q báu để cơng trình nghiên cứu hồn thành có chất lượng Xin cám ơn q thầy giáo khoa Công nghệ Thực phẩm cán - Phòng thí nghiệm Cơng nghệ Thực phẩm tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian thực luận án Xin chân thành cám ơn Ông Mai Thanh Quang - Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ Tỉnh Bà Rịa - Vũng Tầu tạo mội điều kiện thuận lợi cho tơi học hồn thành Luận án tiến sĩ Đặc biệt, xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ, động viên gia đình bạn bè ln ln chia sẻ tơi q trình nghiên cứu iv MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH xiii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xviii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ RONG SỤN VÀ CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN 1.1.1 Giới thiệu rong sụn 1.1.2 Giới thiệu carrageenan 1.1.3 Tính chất lý hố carrageenan 1.1.4 Giới thiệu số kỹ thuật sản xuất carrageenan 11 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ OLIGOCARRAGEENAN .14 1.2.1 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan Việt Nam 14 1.2.2 Tình hình nghiên cứu oligocarrageenan nước 15 1.3 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME POLYSACCHARASE .16 1.3.1 Enzyme viscozyme L khả sử dụng sản xuất carrageenan từ rong sụn 16 1.3.2 Enzyme Termamyl 120L khả sử dụng thủy phân carrageenan 18 1.4 MỘT SỐ KỸ THUẬT TINH SẠCH CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN 19 1.5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC CỦA CARRAGEENAN 21 1.6 GIỚI THIỆU VỀ NGHIÊN CỨU ĐỘC CHẤT 26 1.7 SURIMI VÀ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG CARRAGEENAN, OLIGOCARRAGEENAN TRONG SẢN XUẤT SURIMI .28 1.7.1 Giới thiệu surimi 28 1.7.2 Nghiên cứu ứng dụng carrageenan oligocarrageenan đồng tạo gel thực phẩm 32 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .34 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU .34 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu phân tích 35 2.2.2 Phương pháp tinh sạch, xác định cấu trúc độc chất 37 v 2.2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 44 2.2.3.1 Nghiên cứu sử dụng enzyme polysaccharase thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan 49 2.2.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng surimi trình chế biến 52 2.2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng việc phối trộn carrageenan, oligocarrageenan đến chất lượng surimi trình bảo quản đông 56 2.4 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN 59 2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU .60 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME VISCOZYME L TRONG SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY .61 3.1.1 Tối ưu hóa q trình xử lý rong sụn enzyme viscozyme L 61 3.1.2 Xác định chế độ chiết carrageenan 69 3.1.2.1 Xác định thời gian chiết carrageenan 69 3.1.2.2 Xác định nhiệt độ chiết carrageenan 71 3.1.2.3 Xác định tỷ lệ nước/rong thích hợp cho q trình chiết carrageenan 73 3.1.2.4 Đề xuất quy trình sử dụng enzyme Viscozyme L sản xuất carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty 75 3.2 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH CARRAGEENAN THU NHẬN TỪ RONG SỤN 80 3.2.1 Xác định nhiệt độ tinh .80 3.2.2 Xác định nồng độ ethanol kết tủa protein tinh carrageenan 81 3.2.3 Xác định chế độ kết tủa carrageenan dung dịch car sau kết tủa protein .83 3.2.4 Đề xuất quy trình tinh carrageenan ethanol 86 3.3 NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN CARRAGEENAN THÀNH OLIGOCARRAGEENAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME POLYSACCHARASE 91 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme polysaccharase thích hợp cho thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan 91 3.3.2 Nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp cho trình thủy phân carrageenan thành oligocar enzyme Termamyl 120L 93 3.3.2.1 Xác định nồng độ enzyme Termamyl 120L 93 3.3.2.2 Xác định pH thích hợp cho q trình thủy phân 94 3.3.2.3 Xác định nhiệt độ thích hợp cho q trình thủy phân 96 vi 3.3.2.4 Xác định nồng độ carrageenan 98 3.3.2.5 Xác định thời gian thủy phân 99 3.3.2.6 Đề xuất quy trình thủy phân carrageenan enzyme Termamyl 120L 101 3.4 NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CẤU TRÚC CỦA OLIGOCARRAGEENAN 102 3.4.1 Xác định nhiệt độ tinh 102 3.4.2 Xác định nồng độ ethanol kết tủa phân đoạn protein 103 3.4.3 Xác định chế độ kết tủa oligocarrageenan dung dịch oligocar sau kết tủa protein105 3.4.4 Đề xuất quy trình tinh oligocarrageenan ethanol 108 3.4.5 Đánh giá độ oligocarrageenan tinh 109 3.4.2 Xác định số đặc tính cấu trúc oligocarrageenan 112 3.5 NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC CHẤT HỌC CỦA CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN 127 3.6 THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG CARRAGEENAN VÀ OLIGOCARRAGEENAN TRONG SẢN XUẤT SURIMI TỪ CÁ ĐỔNG 140 3.6.1 Thử nghiệm sử dụng carrageenan sản xuất surimi từ cá 140 3.6.2 Thử nghiệm sử dụng oligocarrageenan sản xuất surimi từ cá 152 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .166 TÀI LIỆU THAM KHẢO .169 PHỤ LỤC 178 vii DANH MỤC KÝ HIỆU  : Kappa  : Iota  : Lambda v/w : Thể tích/khối lượng v/v : Thể tích/thể tích kDA : kilodalton viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BLO: hồng cầu máu ẩn BIL: bilirubin Car: Carrageenan ĐVTN: động vật thí nghiệm EU: Liên minh châu Âu GLEU: bạch cầu GLU: đường niệu JECFA: Ủy ban Chuyên gia Phụ gia Thực phẩm KPH: không phát KET: Ketin Liều TB: liều trung bình MPV: thể tích tiểu cầu NIT: Nitrit; Oligocar: Oligocarrageenan Pro: Protein QCVN: quy chuẩn Việt Nam SG: tỷ trọng TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam Thận T: thận trái Thận P: thận phải URO: Urobilin w/v: khối lượng/thể tích WFT: nước cất pha tiêm vơ khuẩn ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học rong sụn Bảng 1.2 Một số tính chất đặc trưng loại carrageenan Bảng 1.3 Độ dịch chuyển hoá học sigma từ sở liệu SUGABASE dạng glucose galactose 23 Bảng 2.1 Thành phần hóa học cá Đổng cờ 35 Bảng 2.2 Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng 42 Bảng 2.3 Đánh giá biểu lâm sàng chuột thí nghiệm an tồn 42 Bảng 2.4 Tóm tắt thiết kế nghiên cứu đối chứng không làm mù 43 Bảng 2.5 Các tiêu chí đánh giá kết nghiên cứu độc tính 43 Bảng Nhiệt độ pH tối thích enzyme 51 Bảng 3.1 Điều kiện thí nghiệm chọn 61 Bảng 3.2 Kết ma trận thực nghiệm trực giao cấp I, k = 61 Bảng 3.3 Tối ưu hóa trình xử lý rong sụn enzyme Viscozyme L theo hàm mục tiêu sức đông carrageenan 64 Bảng 3.4 Kết thí nghiệm leo dốc theo hàm mục tiêu hiệu suất thu carrageenan từ rong sụn 66 Bảng 3.5 Kết thí nghiệm theo hướng leo dốc hàm chập YL 67 Bảng 3.6 Kết thí nghiệm leo dốc cho hàm mục tiêu YL 68 Bảng 3.7 So sánh thí nghiệm leo dốc theo hàm mục tiêu 68 Bảng 3.8 Kết đánh giá chất lượng carrageenan theo phương pháp xử lý enzyme với phương pháp xử lý hóa chất 78 Bảng 3.9 Thành phần hóa học carrageenanrageenan trước tinh 80 Bảng 3.10 Nhiệt độ nóng chảy nhiệt độ đơng đặc carrageenan thô 81 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ ethanol tới hàm lượng protein, lipid, carbohydrate kết tủa dung dịch car sau tinh chế 82 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nồng độ ethanol tới khối lượng kết tủa carrageenan hàm lượng protein, lipid, carrageenan lại dung dịch 84 Bảng 3.13 Ảnh hưởng thời gian đến khối lượng kết tủa carrageenan 85 Bảng 3.14 Kết phân tích số tiêu hóa lý carrageenan trước sau tinh 88 x Lấy hiệu số đọc máy mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng, đối chiếu đường chuẩn làm tính số miligam glucose bị phân giải Kết trình bày bảng 3.4 hình 3.3 Bảng 3.4 Xây dựng đường chuẩn glucose theo phương pháp Miller Nồng độ glucose (mg/ml) ∆ OD 0,1955 0,4360 0,6240 0,7704 1,0264 Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Miller 3.1.3.4 Tính kết Đơn vị hoạt độ enzyme Viscozyme xác định sau: đơn vị hoạt độ enzyme tương ứng với µg glucose thời gian thủy phân chất CMC 60phút Dựa vào nồng độ glucose sinh trình thủy phân CMC enzyme viscozyme trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Nồng độ glucose sinh enzyme cellulase thủy phân CMC Chỉ tiêu Mẫu đối chứng Mẫu thí nghiệm OD540 (nm) 0,2999 0,4242 Nồng độ glucose (mg/ml) 1,4672 2,0856 Nồng độ glucose sinh G (µg /ml) 618,4 Thay nồng độ glucose sinh q trình thu vào cơng thức: G x Độ pha lỗng X= Vxτ Trong đó: - G= G (mẫu không bất hoạt) - G (mẫu bất hoạt) 47 (đvhđ/ml) - G: nồng độ glucose sinh trình thủy phân chất enzyme Viscozyme - τ: Thời gian (phút) - V: thể tích enzyme Viscozyme phản ứng thủy phân chất Ta có: HđViscozyme (đvhđ/ml) 3.1.3.5 Xác định hoạt độ riêng Hoạt độ riêng chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh chế phẩm enzyme Từ hoạt độ chung enzyme hàm lượng protein xác định, tính hoạt độ riêng enzyme theo cơng thức: đvht Hđr(đvht/mg protein) = mg protein Kết trình bày Bảng 3.6 đây: Bảng 3.6 Kết xác định hàm lượng protein enzyme Viscozyme Mẫu ∆ OD 660 Đối chứng Thí nghiệm 0,6547 Hàm lượng protein (mg/ml) 364,25 Hàm lượng protein enzyme viscozyme 364,25 (mg/ml)  Kết xác định hoạt độ riêng tính dựa hoạt độ hàm lượng protein enzyme Viscozyme Hoạt độ riêng enzyme Viscozyme 5,66 (đvht/mg protein) 3.2 XÁC ĐỊNH KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ TRUNG BÌNH [1], [14] Phân tử khối chất polime xác định nhiều phương pháp khác dựa vào phụ thuộc đặc trưng vật lí hợp chất polime vào phân tử khối Phương pháp đo độ nhớt phương pháp đơn giản mặt thực nghiệm, đồng thời cho phép đánh giá phân tử khối khoảng tương đối rộng (M = 10 4÷106) Trước hết ta xét số định nghĩa chung độ nhớt như: độ nhớt tuyệt đối, độ nhớt tương đối, độ nhớt riêng, độ nhớt rút gọn độ nhớt đặc trưng Độ nhớt tuyệt đối (η) Theo định luật Poadây, chất lỏng chảy qua mao quản chiều dài L(cm), bán kính r (cm) tác dụng áp suất P (đin/cm2), sau thời gian t chảy qua 48 thể tích V, độ nhớt tuyệt đối tính theo công thức sau:  P.r  8LV t (1) Nếu chất lỏng chảy qua mao quản tác dụng trọng lực nó, P = g.H.d (2) g- gia tốc trọng trường H- hiệu số mức dung dịch mao quản D - tỉ trọng dung dịch Thay giá trị P từ (2) vào (1) ta có:   g.H d r 8LV t đơn vị   đin cm s đin.s   poise cm cm.cm cm Nếu phép đo thực nhớt kế, đại lượng V, L, H, r giá trị khơng đổi Khi đó: η = K.d.t (3) đó: k   g.H r 8LV gọi số nhớt kế K tính theo thời gian mà chất lỏng có độ nhớt biết sẵn chảy qua nhớt kế K 0 (4) d 0t0 η0, d0, t0 độ nhớt, tỉ trọng thời gian chảy chất lỏng chuẩn Biết K xác định độ nhớt tuyệt đối chất theo hệ thức (3), t thời gian chảy trung bình dung dịch Độ nhớt tương đối (ηtđ) Để xác định phân tử khối người ta không cần biết giá trị độ nhớt tuyệt đối, mà cần biết độ nhớt tương đối dung dịch  tđ   dd (5)  dm Muốn xác định độ nhớt tương đối cần biết thời gian chảy qua mao quản nhớt kế nhiệt độ xác định lượng dung dịch (t) dung môi (t o) Nếu xem tỷ trọng dung dịch dung mơi (khi dung dịch tương đối lỗng) từ (3) rút ra:  tđ  t (6) t0 49 Độ nhớt riêng (ηr) Độ nhớt riêng tỉ số hiệu số độ nhớt dung dịch dung môi độ nhớt dung môi Độ nhớt riêng xác định hệ thức: r  t  t0   tđ  (7) t0 Độ nhớt rút gọn (ηrg) Độ nhớt rút gọn tỉ số độ nhớt riêng với nồng độ (nồng độ dung dịch polime thường biểu diễn số gam polime 100ml dung môi):  rg  r C (8) Độ nhớt đặc trưng ([η]) Độ nhớt đặc trưng giới hạn độ nhớt rút gọn, nồng độ dung dịch tiến tới không: [η] = lim C ηr (9) C Để xác định phân tử khối chất polime người ta sử dụng hệ thức Mark – Houwink biểu diễn phụ thuộc độ nhớt đặc trưng phân tử khối chất polime [η] = KMα (10) K α số phụ thuộc vào chất dung môi nhiệt độ, α thường có giá trị khoảng 0,5 ÷ 0,8 Độ nhớt đặc trưng xác định thực nghiệm sau: Pha loạt dung dịch chất polime có nồng độ phần trăm từ nhỏ đến lớn dần (nồng độ cao không 1g/100 ml dung môi) Sau xác định độ nhớt tương đối dung dịch, tính độ nhớt rút gọn cho dung dịch, xây dựng đồ thị r C  f (C ) hình  Đoạn thẳng mà đường biểu diễn cắt trục tung cho ta độ nhớt đặc trưng Theo r hệ thức (10) ta có: C C (g/100ml) 50 lg[η] = lgK + αlgM (11) Nếu biết giá trị số K α, thực nghiệm xác định [η] ta tính phân tử khối M polime Giá trị K α số hệ polime - dung môi cho sẵn tài liệu tra cứu 3.3 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CẢM QUAN [29] Phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm thực phẩm thực theo Tiêu Chuẩn Việt Nam TCVN 3215-79 Phương pháp sử dụng thang điểm 20 với bậc điểm (từ đến 5) điểm ứng với chất lượng sản phẩm “bị hỏng”, từ điểm đến điểm ứng với mức khuyết tật giảm dần Ở điểm sản phẩm coi khơng có sai lỗi khuyết tật Tổng hệ số trọng lượng (hệ số quan trọng trọng số) tất tiêu đánh giá cho sản phẩm Chất lượng cảm quan surimi xác định tiêu: trạng thái, màu sắc, mùi vị Hệ số quan trọng trình bày bảng 3.7 thang điểm cảm quan trình bày Bảng 3.8 Hội đồng đánh giá gồm thành viên Khi đánh giá chất lượng cảm quan, thành viên đánh giá phải trạng thái không no hay đói, khơng dùng chất kích thích Bảng 3.7 Hệ số quan trọng tiêu cảm quan surimi STT Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Màu 0,8 Mùi 0,8 Vị 0,7 Trạng thái 1,7 Bảng 3.8 Thang điểm đánh giá cảm quan surimi cá Chỉ tiêu Màu sắc Điểm chưa có trọng lượng Cơ sở đánh giá Màu sáng trắng Màu sáng Màu trắng đục Màu trắng đục 51 Mùi Vị Màu trắng ngà Màu trắng ngà Không mùi Tanh nhẹ Tanh nhẹ Mùi cá Mùi đặc trưng cá Mùi đặc trưng nguyên liệu Khi hấp chín có vị đậm đạm, khơng có vị lạ Khi hấp chín có vị đạm, khơng có mùi vị lạ Khi hấp chín có vị đạm, có vị lạ Khi hấp chín có vị đạm kém, có vị lạ Khi hấp chín khơng có vị đạm, vị đặc trưng cá hấp Khi hấp chín có vị đặc trưng cá hấp Trạng thái Bề mặt lát cắt bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi tốt Độ uốn gập: Gập tư không gãy (cả mẫu) Bề mặt lát cắt bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi tốt Độ uốn gập: mẫu có vết nứt gập Bề mặt lát cắt bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi Độ uốn gập: Cả miếng gập đôi nứt nhẹ Bề mặt lát cắt khơng bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi Độ uốn gập: Gập đôi gãy miếng dính Bề mặt lát cắt khơng bóng mịn, độ dẻo dai, đàn hồi Độ uốn gập: Gãy hồn tồn thành miếng gập đơi Bề mặt lát cắt khơng bóng, đàn hồi Độ uốn gập: Bị gãy rời uốn Điểm đánh giá cảm quan chung tổng điểm cảm quan có trọng số tiêu đánh giá Căn vào điểm cảm quan chung để phân cấp chất lượng sản phẩm (theo tiêu chuẩn TCVN 3215-79) Bảng 3.9 Phân mức chất lượng 52 Yêu cầu điểm trung bình chưa có trọng lượng tiêu Mức chất lượng Điểm chất lượng Tốt 18,6 – 20,0 Các tiêu quan trọng từ 4,7 trở lên Khá 15,2 – 18,5 Các tiêu quan trọng từ 3,8 trở lên Trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi tiêu từ 2,8 trở lên Kém 7,2 – 11,1 Mỗi tiêu từ 1,8 trở lên Rất 4,0 – 7,1 Mỗi tiêu từ 1,0 trở lên Hỏng 0,0 – 3,9 3.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN MONOSACCHARIDE Xác định phương pháp sắc ký khí thơng qua phản ứng axetyl hóa sản phẩm thủy phân car theo qui trình Stevenson Furneaux [56] Thủy phân lần 1: cho 100l car (nồng độ 10mg/ml) ống nghiện có nắp chứa 50l MMB (metylmorpholin boran) 80mg/ml 100l TFA (triflo axetic) 6M để đạt nồng độ cuối TFA 2,4M Đun cách thủy 80 0C 30 phút làm lạnh dung dịch đến nhiệt độ phòng Thêm 50l MMB cho bay 50 – 55 0C với dòng khí N2 Thủy phân lần 2: thêm 100l nước cất 100l TFA 4M vào ống nghiệm Phản ứng thực 120 0C 1h Để nguội đến nhiệt độ phòng lại thêm 100 l MMB làm khô mẫu 50 – 55 0C với dòng khí N2 Thêm vào ống 500 l etyl axetat 1,5ml anhydric axetic 50 l HClO4 siêu âm nhiệt độ phòng 10 phút, để yên 15 phút thêm vào 5ml nước cất Chiết dung dịch với 2ml CH2Cl2 phân tích sắc kí khí 3.5 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SUNPHAT (Terho, 1971) Việc xác định hàm lượng nhỏ sunphat có mặt nhánh polysaccharide quan trọng Phương pháp sử dụng phổ biến dựa kết tủa sunphat với benzidin đo benzidin kết tủa sau diazo hóa đo trực tiếp phổ UV Nhưng độ hòa tan benzidin sunphat cao, phương pháp ta xác định lượng sunphat – µg Phương pháp mô tả dựa phản ứng hình thành hợp chất màu Ba2+ với thuốc thử rhodizonate natri Theo giảm cường độ màu dung dịch SO42- vô kết tủa với Ba2+ phức màu ta xác định hàm lượng 53 sunphat có mẫu - Thuốc thử: dung dịch đệm BaCl2: lấy 10 ml acid acetic 2M, 2ml BaCl2 8ml NaHCO3 0,02M vào bình định mức 100ml Thêm ethanol tuyệt đối đến vạch mức - Dung dịch rhodizonate natri: mg (Merck) hòa tan 20 ml nước cất khử ion Thêm 100 mg acid ascobic lắc dung dịch hòa tan hồn tồn Định mức dung dịch bình định mức 100 ml ethanol Dung dịch có màu nâu nhạt Dung địch sử dụng sau 30 phút - Dung dịch sunphat chuẩn: pha đường chuẩn từ – 12 µg sunphat 0,5 ml nước cất loại ion Tiến hành: lấy 0,5 ml mẫu chuẩn, nước cất mẫu Car vào ống nghiệm (10 x 75mm, có tráng teflon) Thêm ml ethanol, có kết tủa cần phải ly tâm Thêm ml dung dịch đệm BaCl 2và 1,5 ml thuốc thử rhodizonate natri Đậy nắp trộn Đặt ống nghiệm tối 10 phút nhiệt độ phòng Đo mật độ quang dung dịch bước sóng 520 nm với cuvet 1cm, màu dung dịch không đổi sau 30 phút Thủy phân polysaccharide: thủy phân thực với HCl loãng (0,5 – 1N), 1000C Dung dịch thủy phân sau chân khơng 60 – 650C khơ Hòa tan phần khơ đến thể tích 50ml với nước cất loại ion Lấy 0,5 ml để xác định sunphat Đường chuẩn xác định sunphat rhodizonate natri tuyến tính khoảng nồng độ lặp lại với sai số trung bình 5% Độ nhạy phép xác định hàm lượng sunphat đạt từ – 12 µg Nếu sử dụng dung dịch BaCl2 đặc đạt 20 µg Chú ý: tính tốn hàm lượng sunphat mẫu cần phải tính bù trừ độ hấp thụ quang mẫu nước cất 3.6 XÁC ĐỊNH ĐỘ NHỚT [33] 3.6.1 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể thiết bị, dụng cụ sau đây: - Cốc có mỏ, dung tích 600 ml - Nồi cách thủy, ổn định nhiệt độ từ 75 0C đến 80 0C - Nhớt kế Brookfield, loại LVF LVT 3.6.2 Cách tiến hành Lấy 7,5 g phần mẫu thử dạng bột, phân tán 450 ml nước khử ion đựng 54 cốc có mỏ dung tích 600 ml, khuấy 10 đến 20 Thêm vào lượng nước cần thiết để đạt khối lượng cuối 500 g, gia nhiệt nồi cách thủy, khuấy, đến nhiệt độ đạt 80 0C (khoảng 20 đến 30 min) Cho thêm nước vào để bù vào lượng nước bay hơi, làm nguội đến 76 0C 77 0C, gia nhiệt nồi cách thủy nhiệt độ không đổi 75 0C Gia nhiệt trước phao phận bảo vệ nhớt kế Brookfield đến khoảng 75 0C nước Sấy phao phận bảo vệ nhớt kế lắp chúng vào nhớt kế trang bị trục quay số (đường kính 19 mm, chiều dài khoảng 65 mm), quay tốc độ 30 r/min Điều chỉnh độ cao phao dung dịch mẫu, bắt đầu quay nhớt kế với tốc độ 30 r/min Đọc kết đo thang đến 100 sau sáu vòng quay nhớt kế Nếu độ nhớt thấp tăng độ xác kết đo cách sử dụng tiếp hợp Brookfield UL tương đương CHÚ THÍCH: Mẫu thử số dạng carrageenan có độ nhớt lớn, vượt khỏi thang đo sử dụng trục quay số Các mẫu đạt yêu cầu kỹ thuật độ nhớt, cần đọc xác độ nhớt sử dụng trục quay số đọc kết đo thang đến 100 thang đến 500 3.6.3 Biểu thị kết Biểu thị kết theo centipoise (cP), theo số đọc nhớt kế nhân với hệ số đưa nhà sản xuất 3.7 XÁC ĐỊNH SỨC ĐÔNG [33] 3.7.1 Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước cất hai lần nước có chất lượng tương đương, trừ có quy định khác 3.7.2 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể thiết bị, dụng cụ sau đây: - Bình thủy tinh, dung tích 100 ml 150 ml - Nồi cách thủy, ổn định nhiệt độ 80 0C - Ống khn, thuỷ tinh thép khơng gỉ, có nút dài 100 mm đến 200 mm, đường kính 30 mm -Thiết bị đo sức đơng - Cân, cân xác đến 0,001 g 55 3.7.3 Cách tiến hành Hòa tan 1,7 g phần mẫu thử vào bình thủy tinh chứa 98,3 ml nước nhiệt độ 80 0C để tạo thành dung dịch carrageenan có nồng độ 1,5 % khối lượng Bổ sung kali clorua vào bình cho nồng độ kali clorua 0,2 % khối lượng, hòa tan dung dịch Đổ dung dịch nóng vào ống khn sau ngâm nước nhiệt độ 20 0C h đến h Mở miệng ống khuôn, cho thạch carrageenan ra, dùng dao cắt thành khoanh có bề dày 15 mm Đặt khoanh thạch carrageenan lên thiết bị đo sức đông, đặt nhẹ nhàng dấu thiết bị lên khoanh thạch Nếu thạch chưa vỡ đặt thêm cốc thủy tinh lên đĩa (đặt phía khoanh thạch), chưa thấy vỡ nhỏ từ từ nước buret thạch vỡ dừng lại Cân ống trụ thiết bị với cốc thủy tinh chứa nước (nếu sử dụng), xác đến 0,001 g Tiến hành ba phép xác định mẫu thử 3.7.4 Biểu thị kết Sức đông carrageenan biểu thị gam xentimet vuông (g/cm2) Kết trung bình cộng ba phép xác định 3.8 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP HEINKEL [5] 3.8.1 Nguyên tắc định nghĩa Nguyên tắc Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa sở xác định mức độ giảm cường độ màu hỗn hợp với dung dịch iod Định nghĩa Đơn vị hoạt động enzyme ( hoạt động) lượng enzyme có khả phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút 30 0C 3.8.2 Hóa chất Dung dịch NaCl 0.1% Dung dịch acid sunfosalisilic 20% Dung dịch iod: hòa tan gam iod vào ml dung dịch có chứa gam kI, thêm nước cất đến 300 ml Khi dùng pha loãng dung dịch đến 150 lần Dung dịch đệm photphat 0.05 M, pH=6.0 Dung dịch tinh bột 1% dung dịch đệm photphat 0.05 M, pH=6.0: cân 56 gam tinh bột trộn với khoảng 10 ml dung dịch đệm, thêm vào 80 ml dung dịch đệm sôi, để nguội, thêm dung dịch đệm cho vào đến 100ml Để bảo quản dung dịch tinh bột thêm gam natri benzoexan Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1%: cân gam tinh bột trộn với khoảng 10ml nước cất, thêm 80 ml nước cất sôi khuấy đều, để nguội cho thêm nước cất đến 100ml Từ dung dịch chuẩn này, chuẩn bị dung dịch có chứa 2, 4, 6, 10mg tinh bột ml cách lấy 2, 4, 6, 10 ml tinh bột 1% thêm nước cất đến 10 ml Lập đồ thị chuẩn: Lấy 0,1 ml dung dịch chuẩn thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 0,1%; 0,2 ml dung dịch đệm; 0,1 ml nước cất; 0,5 ml dung dịch acid sunfosalisilic 20% lắc đều, thêm ml dung dịch iot pha loãng 150 lần, so màu Vẽ đồ thị chuẩn, trục hoành ghi số miligam tinh bột, trục tung ghi số đọc máy tương ứng Chuẩn bị enzyme Lấy 1ml dung dịch enzyme gốc cho vào bình định mức 100ml Cho thêm nước cất vào bình định mức cho đủ 100ml, lắc Lấy 5ml dung dịch enzyme pha lỗng từ bình định mức cho vào bình định mức 50ml, cho thêm nước cất vào bình định mức cho đủ 50ml, lắc Cho vào tủ ủ ấm 300C Cân gam Malt cho vào bình định mức 500ml Cho thêm nước cất vào bình định mức cho đủ 500ml, khuấy máy khuấy từ khoảng 10 phút Sau cho vào tủ ủ ấm 470C 30 phút Lọc, làm lạnh 300C 3.8.3 Cách tiến hành Cho vào ống nghiệm ml NaCl 0,1 % ml dung dịch tinh bột 1% dung dịch đệm phốt phát 0,05 M, pH = 6,0 lắc giữ 30 0C 15÷20 phút để dung địch đạt đến 300C Thêm vào hỗn hợp ml dung dịch enzyme đạt đến 300C Lắc đều, tiếp tục giữ 300C 30 phút Lấy ống nghiệm khỏi tủ ống, cho 5ml dung dịch acid sunfosalisilic 20% để làm ngừng phản ứng, sau vài phút tiến hành lọc Song song với mẫu thí nghiệm, ta làm mẫu kiểm tra tương tự cho dung dịch acid sunfosalisilic vào trước cho dung dịch enzyme Lấy ml dịch lọc mẫu thí nghiệm mẫu kiểm tra cho vào ống nghiệm, thêm ml dung dịch iot pha loãng 150 lần So màu máy so màu (với bước sóng 560 nm) Lấy hiệu số đọc máy mẫu kiểm tra thí nghiệm, đối chiếu đường chuẩn làm tính số miligam tinh bột bị phân giải 3.8.4 Tính kết 57 Từ số miligam tinh bột tra đường chuẩn tức số đơn vị hoạt động enzyme tương ứng số ml dịch enzyme ml dịch pha lỗng cho vào so màu Từ muốn tính đơn vị hoạt động cho ml dịch chế phẩm ban đầu hay số gam chế phẩm dùng chiết dịch enzyme để so sánh đơn vị hoạt động theo ml dung dịch hay gam chế phẩm đề quy phương pháp chiết phương pháp pha loãng thu dịch enzyme khác Bảng 3.10 Kết xác định mối quan hệ hàm lượng tinh bột độ hấp thụ ánh sáng mẫu tinh bột 1% pha với dung dịch đệm acetate pH=6,0 Tinh bột (mg) Độ hấp thụ (560nm:ABS) 0 0,065 0,162 0,234 0,299 10 0,369 0.4 y = 0.037x + 0.001 R² = 0.996 0.35 Độ hấp thụ (Abs) 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Hàm lượng tinh bột (mg/ml) 10 Hình 3.4 Đồ thị đường chuẩn xác định hoạt độ enzyme amylase 58 12 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SỬ DỤNG THÍ NGHIỆM VÀ THỰC HIỆN LUẬN ÁN 4.1 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SỬ DỤNG THÍ NGHIỆM Máy đo lưu biến (Rheometer Sun Scientific – Nhật Bản CR – 500Dx) Kính hiển vi soi (SMZ168TL – MoticXiamen/Trung Quốc) Máy sấy hút chân không (LVO2040 + LVO1003 – Lebtech/Hàn Quốc) Thiết bị đo độ nhớt (LVDV – I /Brookfield/Mỹ) Máy cô quay chân không Máy đo độ nhớt Bếp cách thủy BW – 10G Máy sấy lạnh Máy sấy hồng ngoại Máy ly tâm Máy đông khô Lyobeta35 Máy quang phổ hấp thu nguyên tử ASS Máy FT-IR Bruker Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân Avance 500 Bruker 59 Thiết bị sắc khí lỏng hiệu cao ghép nối khối phổ HPLC-MS Agilen 1100 4.2 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THỰC HIỆN LUẬN ÁN - Qúa trình thu mẫu sản xuất Car 60 - Qúa trình tinh chế oligocar Dung dịch car oligocar thô Kết tủa protein dung dịch oligocar thô ethanol Dung dịch oligocar thô thời điểm vừa cho ethanol vào Dung dịch oligocar thô thời điểm cho ethanol vào sau 60 phút Tủa oligocar thu phương pháp kết tủa với ethanol 61 ... hành Nghiên cứu sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Doty (Doty) phương pháp enzyme ứng dụng chế biến bảo quản surimi Mục tiêu chung Luận án Sản xuất carrageenan oligocarrageenan. .. GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG BÙI HUY CHÍCH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII DOTY (DOTY) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYME VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN... alvarezii Doty (Doty) phương pháp sử dụng enzyme polysaccharase - Sản xuất oligocarrageenan từ rong sụn K alvarezii Doty (Doty) phương pháp sửu dụng enzyme polysaccharase - Đánh giá khả ứng dụng