Khóa luận tốt nghiệp Đinh Thị Nhạn LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp hồn thành phòng Hoạt chất sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Tiến Đạt – Phòng Hoạt chất sinh học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người trực tiếp hướng dẫn em suốt q trình thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Bằng thầy giáo khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ cung cấp cho em kiến thức để em hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn anh, chị cán Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ bảo tận tình để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Khố luận tốt nghiệp khơng tránh khỏi số thiếu sót em mong nhận góp ý, bảo thầy cô bạn sinh viên quan tâm Hà Nội, tháng năm 2013 Sinh viên ĐINH THỊ NHẠN K35C – Khoa Hóa học i Trường Đại học Sư phạm Hà Nội DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT []D Độ quay cực Specific Optical Rotation 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Proton Magnetic Resonance Spectroscopy H-1H COSY H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR CC Sắc ký cột Column Chromatography DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron Electron Impact Mass Spectrometry FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Me Nhóm metyl MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography K35C – Khoa Hóa học ii Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm, tính vị cơng dụng Desmodium stryracifolium 1.1.1 Mô tả .3 1.1.2 Phân bố, sinh thái 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Công dụng 1.2 Lớp chất flavonoit, thành phần hố học có Kim tiền thảo 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Các nhóm flavonoit 1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 12 1.3.1 Đặc điểm chung 12 1.3.2 Cơ sở trình chiết 13 1.3.3 Quá trình chiết thực vật 13 1.4 Các phương pháp sắc ký phân lập hợp chất hữu 18 1.4.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc ký 18 1.4.2 Cơ sở phương pháp sắc ký .18 1.4.3 Phân loại phương pháp sắc ký 19 1.5 Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc hợp chất hữu 22 1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR) 23 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 25 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Mẫu thực vật 28 2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 28 2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) .28 K35C – Khoa Hóa học iii Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế .29 2.2.3 Sắc ký cột (CC) 29 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất 29 2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) 29 2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) .29 2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 29 2.3.4 Độ quay cực []D 29 2.4 Dụng cụ thiết bị 30 2.4.1 Dụng cụ thiết bị tách chiết 30 2.4.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc 30 2.5 Hoá chất 30 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31 3.1 Chiết phân lập hợp chất 31 3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất 31 3.2.1 Hợp chất 31 3.2.2 Hợp chất 32 CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 34 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 34 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 39 4.3 Kết đánh giá hoạt tính quét gốc tự DPPH 42 KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 K35C – Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội K35C – Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU Hình 1.1: Cây Kim tiền thảo Hình1.2: Flavan (2-phenyl chromen)……………………………………… Hình 1.3: Flavon (2-phenyl benzopyron, 2-phenyl cromon) Hình 1.4: Flavonol (3-hidroxi flavon) Hình 1.5: Flavanon Hình 1.6: Flavanon Chalcon Hình 1.7: Flavanonol-3 Hình 1.8: Chalcon Hình 1.9: Auron .9 Hình 1.10: Antoxianidin Hình 1.11: Các dạng chuyển hoá antoxianidin .10 Hình 1.12: Leucoantoxianidin 10 Hình 1.13: (+) Catechin 11 Hình 1.14: (–) Catechin 11 Hình 1.15: 3-phenyl chromen 11 Hình 1.16: 3-phenylchromen-4-one 12 Hình 1.17: Rotenoit 12 Hình 2.1 Ảnh chụp tiêu mẫu Kim tiền thảo 28 Hình 4.1.1 Phổ ESI-MS hợp chất 34 Hình 4.1.2 Phổ 1H-NMR hợp chất 35 Hình 4.1.3 Phổ 13C-NMR hợp chất .36 Hình 4.1.4 Phổ DEPT hợp chất 36 Hình 4.1.5 Cấu trúc hóa học 37 Hình 4.2.1 Phổ ESI-MS hợp chất 39 Hình 4.2.2 Phổ 1H-NMR hợp chất 40 Hình 4.2.3 Phổ 13C-NMR hợp chất .40 Hình 4.2.4 Phổ DEPT hợp chất 41 Hình 4.2.5 Cấu trúc hóa học 41 Hình 4.3: Hoạt tính qt gốc tự DPPH 42 MỞ ĐẦU Nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao Với điều kiện tự nhiên thuận lợi nên hệ thực vật Việt Nam phát triển phong phú đa dạng Khoảng 12000 lồi thực vật khơng kể đến lồi tảo, rêu nấm, có tới 4000 lồi nhân dân ta làm thảo dược với mục đích khác phục vụ sống người Điều thực có ý nghĩa quan trọng phát triển ngành ngành y học, ngành hóa học hợp chất thiên nhiên ngành khác Việc sử dụng cỏ làm thuốc gắn liền với lịch sử tồn phát triển xã hội lồi người Từ xa xưa, cha ơng ta biết dùng thực vật vừa để tự nuôi sống mình, vừa để chữa bệnh chăm sóc sức khoẻ cho thân Thiên nhiên đem lại cho nguồn nguyên liệu phong phú cung cấp hoạt chất quý để tạo biệt dược chất dẫn đường để tổng hợp nhiều loại thuốc Việc sử dụng hợp chất thiên nhiên sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên dược phẩm chữa bệnh ngày thu hút quan tâm nhà khoa học cộng đồng ưu điểm chúng độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển hố thể có khả trị bệnh cao Nhiều công ty dược phẩm nước tập trung hướng nghiên cứu kinh doanh vào sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên Việc nghiên cứu tập trung thúc đẩy hướng nghiên cứu tìm kiếm dược liệu từ thiên nhiên, qua nghiên cứu nhà khoa học tìm nhiều lồi thực vật có ứng dụng cao y dược hao hoa vàng Artemisia annua, nhân sâm - Panax ginseng, đan sâm - Salvia miltiorrhiza… Những kết nghiên cứu giúp cho việc cung cấp hoạt chất quý cho nghiên cứu tạo sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng K35C – Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội K35C – Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Trong số loài thực vật Việt Nam, loài thực vật thuộc họ đậu (Fabaceae) thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới Việt Nam Kim tiền thảo số loại thuộc họ đậu có tác dụng dược lý tốt, có tác dụng nhiệt, lợi thuỷ, tiêu sạn, giải độc, tiêu viêm; lợi thuỷ, thơng lâm, tiêu tích tụ Chủ trị chứng nhiệt lâm, thạch lâm, sỏi mật, hoàng đản, ung nhọt nhiệt độ, trị gan mật kết sỏi, sỏi thận, tiểu buốt, hoàng đản Tuy nhiên chưa có nghiên cứu thức hóa thực vật Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tơi chọn đề tài cho khố luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kim tiền thảo (Desmodium stryracifolium)”” Nhiệm vụ đề tài là: Thu mẫu Kim tiền thảo (Desmodium stryracifolium), xử lý mẫu, tạo dịch chiết Phân lập hợp chất flavonoit Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lâp 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất thu dạng chất bột màu vàng, phổ khối lượng phun mù điện tử có vạch tín hiệu [M+Na]+ m/z 454.9 chứng tỏ có khối lượng phân tử 432 Hình 4.2.1 Phơ ESI-MS hợp chất Các phổ 1H 13C NMR hợp chất tương tự phổ tương ứng cho phép xác định hai hợp chất có cấu trúc tương tự (Bảng 1) Sự khác biệt dễ nhận thấy nằm tín hiệu vòng B với xuất tín hiệu hai cặp proton hệ A2B2, có tương tác vị trí ortho với δC 129.1 (C-2', 6')/δH 7.78 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2, 6) δC 117.2 (C-3', 5')/δH 6.90 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3', 5') Số liệu cho phép xác định hợp chất 4',5,7-trihydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside [17] Hình 4.2.2 Phơ 1H-NMR hợp chất Hình 4.2.3 Phơ 13C-NMR hợp chất Hình 4.2.4 Phơ DEPT hợp chất Hình 4.2.5 Cấu trúc hóa học 4.3 Kết đánh giá hoạt tính quét gốc tự DPPH Kết thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa hợp chất phân lập cho thấy hợp chất có khả quét gốc tự DPPH tương đối mạnh khơng có tác dụng Giá trị SC50 hợp chất 3,71 µg/ml thấp nhiều so với đối chứng dương catechin 15,13 µg/ml (Hình 4.3) Đáng ý hợp chất có số nhóm hydroxy vòng B nhiều so với thể hoạt tính mạnh Điều phù hợp với nghiên cứu trước chứng minh có mặt nhóm hydroxy vòng B có vai trò quan trọng khả chống oxy hóa [18] % scavenging activity 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Hợp chất (ug/ml) 10 15 (+)-Catechin (ug/ml) Hình 4.3: Hoạt tính qt gốc tự DPPH KẾT LUẬN Thực khóa luận tốt nghiệp với Đề tài: “Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kim tiền thảo” bằng phương pháp chiết sắc ký hết hợp sắc ký cột nhồi silica gel pha thường, sắc ký cột nhồi silicagel pha đảo, sắc ký lớp mỏng điều chế, em phân lập hợp chất flavonoit sau: Hợp chất 1: 3',4',5,7-tetrahydroxyflavone-6-C--D-glucopyranoside Hợp chất 2: 4',5,7-trihydroxyflavone-6-C--Dglucopyranoside từ Kim tiền thảo Cấu trúc hợp chất xác định bằng phương pháp phổ đại bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13CNMR, DEPT 135, DEPT 90) phổ khối lượng Các kết nghiên cứu bước đầu đóng góp thêm vào việc làm sáng tỏ thành phần hoá học cây Kim tiền thảo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB y học, Hà Nội, trang 267-268(2000) [2] Võ Văn Chi Từ điển thuốc Việt Nam NXB Y học, Hà Nội, trang 1322(1999) [3] M Xhao, J.A Duan, C.T Che Phytochem 68, 1471-1479 (2007) [4] X Ma, C Zheng, C Hu, K Rahman, L Qin J Ethnopharmacol 138, 314-332 (2011) [5] S Rastogi, M.M Pandey, A Kumar, S Rawat J Ethnopharmacol 136, 183-296 (2011) [6] A Rathi, C.V Rao, B Ravishankar, S De, S Mehrotra J Ethnopharmacol 95, 259-263 (2004) [7] S Dudonne, X Vitrac, P Coutiere, M Woillez, J.M Merillon J Agric Food Chem 57, 1768-1774 (2009) [8] Hayerman A.E., Butler I.G., Assay of condensed tanin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant, Meth, Enz, 234, pp 249 (1994) [9] Ternai B., Markham K.R., C13-NMR of flavonoids-1-Flavones and flavonols, Tetrehedron 32, pp 565 (1976) [10] Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., The syrematic indentification of flavonoids, springer Verlag-Berlin-Heidelberg-New york, (1970) [11] Harborn J.B., The flavonoids advance in research since 1986, Chaprman & Hall, (1994) [12] Agrawal P.K., Carbon-13 NMR of flavonoids, Elsevier Science Pub B.V., (1989) [13] Peter J Houghton and Lu Minh Lian, Triterpenes from Desfontainia spinosa, Phytochemistry, Vol.25(8), pp 1939-1944 (1986) [14] Liang Guang-Yi, Alexander I Gray and Peter G Waterman, Pentacylic triterpenes from the fruits of Rosa sterilis, Journal of Natural Products, Vol.52, pp 162-167 (1989) [15] S Dudonne, X Vitrac, P Coutiere, M Woillez, J.M Merillon J Agric Food Chem 57, 1768-1774 (2009) [16] S Rayyan, T Fossen, S.H Nateland, O.M Andersen Phytochem Anal 16, 334-341 (2005) [17] N Ramarathnam, T Osawa, M Namiki, S Kawakishi J Agric Food Chem 37, 316-319 (1989) [18] J.C Luis, F Valdes, R Martin, A.J Carmona, J.G Diaz DPPH radical scavenging activity of two flavonol glycosides from Aconitum napellus sp lusitanicum Fitoterapia 77, 469-471 (2006) ... nhiên chưa có nghiên cứu thức hóa thực vật Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu thành phần flavonoit từ Kim tiền thảo (Desmodium stryracifolium) ””... trung hướng nghiên cứu kinh doanh vào sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên Việc nghiên cứu tập trung thúc đẩy hướng nghiên cứu tìm kiếm dược liệu từ thiên nhiên, qua nghiên cứu nhà khoa... điểm, tính vị cơng dụng Desmodium stryracifolium 1.1.1 Mô tả [1,2] Tên khoa học: Desmodium styracifolium (Osb.)Merr Tên tiếng Việt: Cây kim tiền thảo gọi đồng tiền lông, kim tiền, mắt trâu, vẩy rồng