Tách dòng thiết kế vector biểu gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Việt Nam Lê Hồng Thu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: PGS TS Võ Thị Thương Lan Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tổng quan G protein; họ tachykinin động vật có vú; thụ thể họ tachykinin thụ thể neurokinin-1; ứng dụng thụ thể neurokinin-1 điều trị bệnh; vector biểu gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Trình bày ngun liệu phương pháp nghiên cứu: Tách RNA tổng số; phản ứng phiên mã ngược; phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction); Tinh DAN phương pháp gel; nối ghép đoạn DNA vào vector; kỹ thuật biến nạp; sàng lọc khuẩn lạc; tách plasmid kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn; ký thuật điện di; phân tích trình tự cDnA cDNA-NK1 Đưa kết thảo luận: Tách dòng gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ phổi người; thiết kế vector biểu gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen mã hóa; Người Việt Nam; Thụ thể neurokinin-1; Cấu trúc protein Content MỞ ĐẦU Thụ thể neurokinin – thuộc nhóm thụ thể xuyên màng liên kết với G protein Khi thụ thể tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi trung ương thần kinh, gây trạng thái lo âu triệu chứng giống trầm cảm, mặt khác chúng có tác dụng gây kích thích co trơn điều hòa phản ứng miễn dịch thể Trên sở nghiên cứu cấu trúc chức thụ thể neurokinin-1, hãng dược phẩm cố gắng tìm chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho bệnh nhân ung thư, … Tuy nhiên, cơng trình nghiên cứu thụ thể người Việt Nam chưa cơng bố Chính vậy, với mục đích phân lập đoạn cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể người Việt Nam biểu chúng hệ thống tế bào động vật để chủ động nguồn gen hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tơi tiến hành đề tài “Tách dòng thiết kế vector biểu gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ngườiViệt Nam” Đề tài thực Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme - Protein Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 1.1.1 G protein G protein lần phát mô tả Alfred Martin hai ông nghiên cứu tác động adrenaline tế bào Với cơng trình này, hai ông giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [4] G protein định vị mặt màng tế bào hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) phân bố bề mặt màng tế bào 1.1.2 Thụ thể liên kết với G protein Họ thụ thể liên kết với G protein phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine) [45], phân thành phân họ khác dựa theo độ tương đồng trình tự acid amine, chức khả liên kết với cấu tử Đến người ta phát 367 thụ thể liên kết với G protein người, có khoảng 150 GPCRs tìm thấy chưa biết chức [52] 1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ Tachykinin họ neuropeptide lớn tìm thấy thể tất lồi động vật Có 40 loại tachykinin phân lập từ nhóm động vật khơng xương có xương sống [15, 45] Trong họ tachykinin, chất P (SP) mô tả lần năm 1931 Euler Gaddum hai ông nghiên cứu dịch chiết não ruột ngựa cồn Dịch chiết có tác dụng kích thích hiệu hoạt động ruột gây giảm huyết áp thỏ [21] Tuy nhiên, nhiều thí nghiệm nhằm phân lập tinh SP có hoạt tính từ mẫu ruột ngựa khơng thành cơng Bốn mươi năm sau (năm 1970), Chang Leeman tinh SP từ vùng đồi bò [14] đến năm 1973, Studer cộng phân lập, tinh SP, đồng thời giải trình tự gene mã hóa cho SP từ ruột ngựa [50] Năm 1983, Kangawa Kimura phân lập thêm hai tachykinin có hoạt tính dược học khác với SP neurokinin A (NKA) neurokinin B (NKB) từ vùng thần kinh trung ương ngoại vi [31, 33] Hiện nay, tachykinin mô động vật có vú xác định gồm có chất P (hay SP), neurokinin A (hay neuromedin L chất K) neurokinin B (hay neuromedin K) Riêng NKA mở rộng thêm dạng neuropeptide K neuropeptide γ 1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1 1.3.1 Giới thiệu chung thụ thể họ tachykinin Thụ thể họ tachykinin (TACR) thuộc lớp A họ thụ thể liên kết với G protein (Hình 1) Tương tự thụ thể rhodopsin, TACR có cấu trúc gồm vùng xuyên màng đặc trưng nối với vòng phía ngồi phía màng sinh chất (exoloop cytoloop) Những vòng phía ngồi màng tế bào thụ thể liên kết với G protein có chức lựa chọn cấu tử gắn đặc hiệu vùng xuyên màng có chức định hoạt tính thụ thể Người ta phân loại TACR dựa vào sai khác trình tự [45] 1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH Từ hiểu biết chức thụ thể neurokinin hứa hẹn đích tác động hiệu cho phương pháp điều trị số bệnh có liên quan Do khơng có ngạc nhiên nhiều hãng dược phẩm lớn tập trung nghiên cứu thụ thể tachykinin nhằm tìm chất đối vận chúng để ứng dụng điều trị bệnh: làm thuốc giảm đau, chống lo âu, trầm cảm, chữa bệnh đường hô hấp,… Sự phát chất đối vận với thụ thể NK1 mắt xích quan trọng việc thay đổi hướng điều trị việc ngăn ngừa chứng buồn nôn nôn mửa tác dụng hóa trị liệu ung thư Tuy đến nghiên cứu chất đối vận với thụ thể tachykinin chưa đạt kết mong đợi gặp nhiều khó khăn, việc sử dụng thụ thể NK1 làm đích tác động thuốc tóan hay khó cho nhiều nhà nghiên cứu Trong nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phân tử khơng có chất peptide có khả thấm xuyên qua màng tế bào thần kinh Trong tương lai, chất hứa hẹn cho phép điều trị bệnh liên quan tới chứng nghiện rượu [13], … 1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein dung hợp vào nhiều hệ vector nhiều dòng tế bào khác Người ta thử biểu chúng tế bào nhân sơ tế bào nhân thực Tuy nhiên, thụ thể liên kết với G protein thường biến đổi sau dịch mã cách gắn thêm carbonhydrate lipid hóa… nên việc biểu hệ thống tế bào nhân sơ thường không cho kết mong muốn Theo nghiên cứu công bố, NK1 biểu vector pCDNA [24], pMAM-neo [24; 28], pVLl393 [32], pAHygCMV1 [49]… chủng tế bào HEK293, COS-7, CHO, … cho kết khả quan Một nghiên cứu gần năm 2006 Farahdiba cộng nghiên cứu truyền tin thụ thể β-arrestin tiến hành dung hợp gen mã hóa cho thụ thể với gen mã hóa cho NK1 biểu chúng hai hệ vector pCDNA3.1 pEGFP-N1 cho kết tốt Đây tiền đề cho lựa chọn thiết kế vector biểu pCDNA3 pEGFP-N1 đề tài pCDNA3 pEGFP-N1 vector biểu tế bào động vật với đặc điểm trình bày phụ lục Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU Mẫu phổi tươi người bị ung thư phổi cung cấp Viện Quân Y 103 (kí hiệu H211 lấy ngày 25/1/2011) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu Mẫu phổi tươi Tách RNA tổng số Tổng hợp cDNA Khuếch đại đoạn 5’-NK1 Khuếch đại đoạn 3’-NK1 Tách dòng đoạn 5’-NK1 Tách dòng đoạn 3’-NK1 Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dòng thiết kế vector biểu cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin – phổi người Việt Nam Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH DỊNG GEN MÃ HĨA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI 3.1.1 Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người RNA tổng số từ mẫu phổi tươi tách chiết kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit (Bioneer) Sau đó, cDNA tổng hợp nhờ phản ứng phiên mã ngược sử dụng RNA tổng số mồi hexamer Thành phần điều kiện phản ứng tổng hợp cDNA trình bày Bảng Bảng 9: Thành phần điều kiện phản ứng tổng hợp cDNA gen neurokinin-1 Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần RNA tổng số 13.0 Mồi hexamer (100 µM) 1.5 dNTPs (10 mM) 2.5 Đệm 5x 5.0 Ủ 70 5’ để biến tính - Gắn mồi: 25 10 phút AMV RTase 3.0 Tổng 25.0 - Kéo dài: 37 90 phút - Bất hoạt enzyme: 85 phút o Sản phẩm cDNA bảo quản C để sử dụng cho thí nghiệm 3.1.2 Khuếch đại đoạn 5’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Đoạn cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 tách dòng thành hai đoạn: đoạn 5’-NK1 đoạn 3’-NK1 Hai đoạn sau nối với để tạo nên cDNA hồn chỉnh sơ đồ Hình NK1 F NK1 R1 76 bp 94 bp NK1 F1 NK1 R Đoạn 5’–NK1 (788 bp) CCCGG Đoạn 3’- NK1 (728 bp) 76 bp 94 bp CCCGG Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ 3’-NK1 gen mã hóa cho neurokinin-1 Để khuếch đại đoạn 5’-NK1, sử dụng cDNA tổng hợp từ phản ứng phiên mã ngược để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NK1 F/ NK1 R1 Thành phần điều kiện phản ứng trình bày Bảng 10 Bảng 10: Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện 10.4 H2O - Thời gian biến tính đầu Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 µM) 0.5 NK1 R1 (2 µM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 +Gắn mồi : 60 C, 30 giây cDNA 1.0 +Tổng hợp: 72 C, 150 giây Tổng 15.0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: o tiên: 94 C, phút - Lặp lại 45 chu kì: +Biến tính: 94 C, 30 giây 0 72 C, 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose Kết điện di cho băng DNA có kích thước xấp xỉ 800 bp (Hình 7) Đây kích thước với tính tốn cho đoạn 5’-NK1 Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Giếng ĐC: đối chứng âm khơng có cDNA; Giếng 5’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY-500 Sản phẩm PCR tinh High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) để chuẩn bị cho phản ứng tách dòng đoạn 5’-NK1 cDNA 3.1.3 Khuếch đại đoạn 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Tương tự đoạn 5’-NK1, sử dụng cDNA làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R để khuếch đại đoạn 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Tuy nhiên, sản phẩm PCR gồm băng DNA không đặc hiệu băng DNA với kích thước 728 bp mong đợi (Hình 8) Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1; Giếng M: thang chuẩn SY500 Lặp lại phản ứng nhiều lần thay đổi điều kiện nồng độ cDNA, nhiệt độ gắn mồi,… không thu băng mong muốn Vì vậy, chúng tơi định thực phản ứng phiên mã ngược với mồi oligoT để tổng hợp lại cDNA từ RNA tổng số Thành phần điều kiện phản ứng phiên mã ngược thực Bảng 11, thay đổi mồi hexamer mồi oligoT Sau đó, cDNA sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 cặp mồi đặc hiệu NK1 F1/ NK1 R Thành phần điều kiện phản ứng trình bày Bảng 11 Bảng 11: Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O 10.4 Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F1 (2 µM) 0.5 NK1 R (2 µM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0 - Thời gian biến tính đầu o tiên: 94 C, phút - Lặp lại 45 chu kì: +Biến tính: 94 C, 30 giây +Gắn mồi : 60 C, 30 giây +Tổng hợp: 72 C, 150 giây - Thời gian tổng hợp sau cùng: 72 C, 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose (Hình 9) Kết cho thấy bên cạnh băng DNA khơng đặc hiệu xuất băng DNA có kích thước lớn 700 bp phù hợp với kích thước đoạn 3’–NK1 Sử dụng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) tinh đoạn 3’-NK1 Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại đoạn 3’-NK1 Giếng 3’: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1, Giếng M: thang chuẩn SY100 3.1.4 Tách dòng đoạn 5’-NK1 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Sau tinh sạch, đoạn 5’-NK1 3’-NK1 đưa vào vector pJET1.2 phản ứng nối sử dụng kit Gene JET TM PCR Cloning Kit (Fermentas) Thành phần phản ứng nối trình bày Bảng 12 Bảng 12: Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 (hoặc 3’-NK1) cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pJET1.2 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện Đoạn 5’-NK1 (hoặc đoạn 3’NK1) Đệm 2x 8.0 10.0 pJET 1.2 (50 ng/µl) 1.0 T4 ligase (5 u/ µl) 1.0 Tổng 20.0 Hỗn hợp nối ủ 16 Cqua đêm Sau đó, hỗn hợp nối biến nạp vào dòng tế bào khả biến E.coli DH5α Với đĩa môi trường thạch chứa kháng sinh để sàng lọc khuẩn lạc nhận plasmid tái tổ hợp, chọn khuẩn lạc để kiểm tra đoạn chèn phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Để kiểm tra đoạn chèn 5’-NK1, sử dụng trực tiếp khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/NK1 R1 Thành phần điều kiện phản ứng PCR trình bày Bảng 13 Bảng 13: Thành phần điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 5’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần 10.0 H2O - Thời gian biến tính đầu Đệm 10x 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 µM) 0.5 NK1 R1 (2 µM) 0.5 Taq DNA polymerase (1 u/µl) 0.5 +Gắn mồi : 60 C, 30 giây Khuôn 1.0 +Tổng hợp: 72 C, 150 giây Tổng 15.0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: o tiên: 94 C, phút - Lặp lại 40 chu kì: +Biến tính: 94 C, 30 giây 0 72 C, 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose (Hình 10) Kết cho thấy khuẩn lạc cho băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 5’-NK1 Như vậy, chúng tơi tách dòng đoạn 5’ –NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Chúng tơi kí hiệu bảy khuẩn lạc từ 5’-NK1-1 đến 5’-NK1-7 788 bp Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1 Giếng 18 khuẩn lạc đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm khn; M: thang chuẩn SY-500 Tương tự sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn 5’–NK1, chọn khuẩn lạc để kiểm tra có mặt đoạn 3’-NK1 phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F1/ NK1 R Thành phần điều kiện phản ứng trình bày Bảng 14 Bảng 14: Thành phần điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần 10.0 H2O - Thời gian biến tính đầu Đệm 10x 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F1 (2 µM) 0.5 NK1 R (2 µM) 0.5 +Biến tính: 94 C, 30 giây Taq DNA polymerase (1 u/µl) 0.5 +Gắn mồi : 60 C, 30 giây DNA khuôn 1.0 +Tổng hợp: 72 C, 150 giây Tổng 15.0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: o tiên: 94 C, phút - Lặp lại 40 chu kì: 0 0 72 C, 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose (Hình 11) Kết cho thấy khuẩn lạc (số 2, 4, 6, 7, 8) cho băng DNA có kích thước phù hợp với đoạn 3’-NK1 Như vậy, chúng tơi tách dòng thành cơng đoạn 3’–NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Chúng tơi kí hiệu năm khuẩn lạc 3’-NK1-1 đến 3’-NK1-5 728 bp Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 cặp mồi NK1 F1/ NK1 R Giếng 1-8 khuẩn lạc đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm khơng có khn; M: thang chuẩn SY-500 3.1.5 Tách dòng đoạn cDNA hồn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 Q trình tách dòng cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 trình bày Hình 12 Hình 12 Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 Đầu tiên chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 3’-NK1-6 để tách chiết plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn tương ứng 5’-NK1 3’-NK1 Plasmid kí hiệu p5’-NK1-2 p3’NK1-6 Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 mồi pJET R vector pJET 1.2 Thành phần điều kiện phản ứng trình bày Bảng 15 Bảng 15: Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại 5’-NK1 vector tái tổ hợp p5’-NK1-2 cặp mồi NK1 R1/ pJET R Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần H2O 10.4 Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 R1 (2 µM) 0.5 pJET R (2 µM) 0.5 +Biến tính: 94 C, 30 giây Pfu polymerase (1 u/µl) 0.1 +Gắn mồi : 60 C, 30 giây p5’-NK1-2 1.0 +Tổng hợp: 72 C, 120 giây Tổng 15.0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: - Thời gian biến tính đầu o tiên: 94 C, phút - Lặp lại 40 chu kì: 0 0 72 C, 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose (Hình 13) Kết cho thấy chúng tơi khuếch đại thành công đoạn 5’-NK1 cặp mồi NK1 R1/pJET R Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 cặp mồi pJET R/ NK1 R Giếng 1: sản phẩm PCR cặp mồi pJET R/NK1 R; ĐC: mẫu đối chứng âm khơng có DNA khn; M: thang chuẩn SY-100 Sản phẩm PCR tinh kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) cắt hai enzyme XbaI/SmaI để chuẩn bị cho việc ghép nối với đoạn 3’-NK1 Tiếp theo, tiến hành cắt vector tái tổ hợp p3’-NK1-6 với hai enzyme XbaI/ SmaI Thành phần phản ứng cắt trình bày Bảng 16 Bảng 16: Thành phần cắt điều kiện cho phản ứng cắt với hai enzyme XbaI/SmaI Thành phần Thể tích (µl) H2O 42.0 Đệm Tango 10x 6.0 p3’-NK1-2 (hoặc sản phẩm PCR đoạn 5’-NK1) 8.0 SmaI 2.0 XbaI 2.0 Điều kiện Ủ 37 C Các sản phẩm cắt với hai enzyme điện di kiểm tra gel polyacrylamide 8% (Hình 14A) Kết cho thấy phản ứng cắt thực hoàn toàn; băng DNA cắt có kích thước theo tính tốn Băng DNA có kích thước 700 bp đoạn 5’-NK1 băng DNA có kích thước 3341 bp gồm plasmid pJET đoạn 3’-NK1 tinh kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) điện di kiểm tra gel polyacrylamide 8% (Hình 14B) Kết cho thấy hai băng DNA tinh đảm bảo cho phản ứng nối 99 Hình 14: Điện di sản phẩm cắt trước sau tinh kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN) A: sản phẩm cắt trước tinh sạch; B: sản phẩm cắt sau tinh sạch; 1: sản phẩm PCR chứa đoạn 5’-NK1 sau cắt; 2: sản phẩm vector p3’-NK1-6 cắt; M: thang chuẩn-100; M1: thang chuẩn kb Đoạn 5’-NK1 vector có chứa đoạn 3’-NK1 nối với theo thành phần trình bày Bảng 17 Bảng 17:Thành phần phản ứng nối đoạn 5’-NK1 vào vector pJET1.2-3’-NK1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện Đệm 2x 10.0 5’-NK1 5.0 p3’-NK1-6 4.0 T4 ligase 1.0 Tổng 20.0 Ủ 16 C qua đêm Sau đó, hỗn hợp nối biến nạp trực tiếp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5α theo phương pháp trình bày mục 2.2.2.6 Kết mơi trường chọn lọc bổ sung kháng sinh có nhiều khuẩn lạc Chúng chọn 13 khuẩn lạc để kiểm tra có mặt đoạn cDNA hồn chỉnh phản ứng PCR với cặp mồi NK1 F/ NK1 R Đây hai mồi bắt cặp với trình tự đầu 5’ đầu 3’ cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 Thành phần điều kiện phản ứng PCR trình bày Bảng 18 Bảng 18: Thành phần điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc chứa đoạn cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Thể tích (µl) Điều kiện Thành phần 10.0 H2O - Thời gian biến tính đầu 1.5 o Đệm 10x (MgCl2 20 mM) tiên: 94 C, phút 1.0 dNTPs (2 mM) - Lặp lại 40 chu kì: 0.5 NK1 F (2 µM) +Biến tính: 94 C, 30 giây 0.5 NK1 R (2 µM) +Gắn mồi : 60 C, 30 giây Taq DNA polymerase (1u/ µl) 0.5 +Tổng hợp: 72 C, 150 giây 1.0 Khuôn - Thời gian tổng hợp sau cùng: 15.0 Tổng 72 C, 10 phút Hình 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1 hoàn chỉnh Giếng1-13 khuẩn lạc đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm khơng có DNA; M: thang chuẩn kb Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy thu 10 số 13 khuẩn lạc mang đoạn chèn có kích thước xấp xỉ 1338 bp mong đợi Các khuẩn lạc kí hiệu NK1-1 đến NK1-10 3.1.6 Giải trình tự cDNA hòan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Chúng chọn khuẩn lạc NK1-3 để tách plasmid tái tổ hợp Plasmid kí hiệu pNK1-3 Plasmid pNK1-3 giải trình tự hai chiều mồi vector pJET 1.2 F/ R Kết trình bày Phụ lục Kết so sánh với trình tự nucleotide cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 tách dòng từ não người Việt Nam, chúng tơi khơng thấy sai khác Cả hai trình tự có nucleotide khác với trình tự ngân hàng liệu (Mã số NCBI: M81797.1) Điều chứng tỏ khác biệt trình tự nucleotide gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Việt Nam với trình tự nucleotide ngân hàng liệu tính đa hình gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Như vậy, từ kết giải trình tự cho thấy chúng tơi tách dòng thành cơng cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi người Việt Nam 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 3.2.1 Thiết kế mồi Để biểu cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người, chúng tơi sử dụng hai vector biểu tế bào động vật pCDNA3 pEGFP-N1 Bước cần chuyển đoạn cDNA tách dòng vector pJET1.2 sang hai hệ thống vector biểu Khi lựa chọn enzyme cắt giới hạn, chúng tơi khơng thấy enzyme vị trí đa điểm vector pEGFP-N1 pCDNA3 thỏa mãn điều kiện cắt văng đoạn cDNA hoàn chỉnh từ vector tái tổ hợp pJET1.2-NK1 Vì vậy, chúng tơi thiết kế mồi NK1 F3/ NK1 R3 để chuyển cDNA-NK1 từ pNK1-3 sang vector biểu Trình tự cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 thiết kế dựa vào trình tự cDNA hồn chỉnh tách dòng từ phổi người Việt Nam Trong đầu 5’ mồi NK1 F3 thiết kế mang trình tự nhận biết cho enzyme cắt giới hạn HindIII mồi NK1 F3 mang trình tự nhận biết cho enzyme BamHI Hình 16 + NK1 F3: 5’- -C3C’ AAGCTT ACCATGG Hind III T AAGCT Trình tự Kozak ACCATGG + NK1 R3: 5’- GGATCC GGATCC T- G3’ Bam HI CCTAGG -5’-CTAGAAGATCGAAATGGATAACGTCCTCC /-/-/ pNK1 /-/-/ -CAATGTGCTCTCCTAGGGATCCTTA-3’-A AAGCTT ACCATGG Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK1-3 Mặt khác, sử dụng mã mở đầu trình tự cDNA NK1 thay mã mở đầu thiết kế sẵn vector biểu nên q trình thiết kế mồi chúng tơi phải chèn thêm trình tự K ozak (ACCATGG) vào để làm tăng khả phiên mã dịch mã gen tế bào nhận Với hai mồi thiết kế mới, khuếch đại cDNA từ pNK1-3 Thành phần điều kiện phản ứng PCR thể Bảng 19 Bảng 19: Thành phần điều kiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA-NK1 từ pNK1-3 cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 Thành phần H2O Thể tích (µl) Điều kiện 10.4 Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 o - Thời gian biến tính đầu tiên: 94 C, phút - Lặp lại chu kì: dNTPs (2 mM) 1.0 +Biến tính: 94 C, 30 giây NK1 F3 (2 µM) 0.5 +Gắn mồi : 50 C, 30 giây NK1 R3 (2 µM) 0.5 +Tổng hợp: 72 C, 150 giây Pfu polymerase 0.1 - Lặp lại 35 chu kỳ pNK1-3 1.0 +Biến tính: 94 C, 30 giây 0 0 +Gắn mồi : 60 C, 30 giây Tổng 15.0 +Tổng hợp: 72 C, 150 giây - Thời gian tổng hợp sau cùng: 72 C, 10 phút Trong phản ứng PCR, trình tự mồi thiết kế có đoạn nucleotide tương đối dài khơng bắt cặp vào khuôn nên chu kỳ đầu tiên, chúng tơi hạ thấp nhiệt độ gắn mồi để nhân đoạn gen mong muốn Ở chu kỳ tiếp theo, tăng nhiệt độ gắn mồi để đảm bảo tính đặc hiệu phản ứng Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy thu băng có kích thước xấp xỉ 1237 bp trình bày Hình 17 Hình 17: di sả n phẩ m PCR với khuôn vector tá i tổ pNK 1-3 hai mồ i NK Điêṇ hơp̣ F3/NK1 R3 Giếng 1: sản phẩm PCR khuếch đại cDNA NK1; M: thang chuẩn SY-500; ĐC: đố i chứ ng âm khơng có khn DNA Như cặp mồi thiết kế cho phép nhân đặc hiệu đoạn cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Đồng thời đoạn DNA nhân có mang vị trí nhận biết cặp enzyme HindIII/ BamHI hai đầu 5’ 3’ Sản phẩm PCR tinh kit High Pure Product purification kit (Roche) kí hiệu eNK1 (expression NK1) 3.2.2 Tách dòng vector biểu mang cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin -1 Chúng tách chiết tinh hai loại plasmid pCDNA3 pEGFP-N1 Hai plasmid đoạn eNK1 cắt với enzyme HindIII Sản phẩm cắt điện di tinh kit High Pure Product purification kit (Roche) Sau đó, sản phẩm tinh tiếp tục cắt với BamHI Thành phần điều kiện phản ứng cắt với enzyme trình bày Bảng 20 Bảng 21 Bảng 20: Thành phần điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen NK1 enzyme HindIII Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O 60.0 Đệm R 10x 15.0 eNK1(hoặc plasmid) 70.0 Hind III 5.0 Tổng 150.0 Ủ 37 Ctrong Bảng 21: Thành phần điều kiện cho phản ứng với enzyme BamHI Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O 33.0 Đệm 10x Bam HI 10.0 Sản phẩm cắt với HindIII 54.0 Bam HI 3.0 Tổng 100.0 Ủ 37 Ctrong Qua bước cắt sản phẩm tinh High Pure Product Purification kit (Roche) điện di kiểm tra Kết quả cuố i cù ng đư ợc thể Hình 18 Hình 18: di san ̉ phẩm cắ t vector pCDNA 3, pEGFP-N1 eNK với hai enzyme Hind III Điêṇ Bam HI Giếng 1, 2, lầ n lươṭ là vector pCDNA 3, pEGFP-N1 eNK1 không cắ t ; 1’, 2’, 3’: lầ n lươṭ là vector pCDNA 3, pEGFP-N1 eNK1 sau cắ t ; M1: marker kb; M2: thang chuẩn SY-500 Sau tinh sạch, eNK1 đưa vào vector pCDNA pEGFP -N1 với thành phần trình bày Bảng 22 Bảng 22: Thành phần điều kiện phản ứng nối cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pCDNA3 pEGFP-N1 Thành phần Thể tích(µl) Thành phần Thể tích (µl) Đệm 10x 2.0 Đệm 10x 2.0 eNK1cắt 8.5 eNK1 cắt 10.0 Plasmid pCDNA3 cắt 8.5 Plasmid pEGFP-N1 cắt 7.0 T4 ligase 1.0 T4 ligase 1.0 Tổng 20.0 Tổng 20.0 Điều kiện: Ủ 16 C qua đêm Hai hỗn hơp̣ nố i đươc̣ biế n nap̣ riêng bi ệt vao ̀ chủ ng vi khuẩn E coli DH5α theo phương pháp s ốc nhiệt (Mục 2.2.2.6) Khuẩn lạc nhận plasmid pCDNA3 mọc mơi trường có kháng sinh ampicillin (50µg/ml) Khuẩn lạc nhận plasmid pEGFP-N1 mọc mơi trường có kháng sinh Kanamycin (50µg/ml) Trên hai loại môi trường, thu nhiều khuẩn lạc Để sàng lọc khuẩn lạc mang cDNA hoàn ch ỉnh mã hóa cho NK1, chúng tơi chọn 14 khuẩn lạc môi trường chứa kháng sinh ampicillin 15 khuẩn lạc môi trường chứa kháng sinh kanamycin làm khuôn cho phản ứng PCR với căp̣ kiện phả n ứ ng đươc̣ thể hiêṇ mồ i NK F3/ NK1 R3 Thành phần ều Bảng 23 Bảng 23: Thành phần điều kiện phản ứng PCR kiểm tra cDNA-NK1 thể biến nạp Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O 10.0 - Thời gian biến tính đầu Đệm 10x 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F3 (10 µM) 0.5 NK1 R3 (10 µM) 0.5 Taq DNA polymerase (1 u/ µl) 0.5 Khn 1.0 Tổng 15.0 o tiên: 94 C, phút - Lặp lại 40 chu kì: +Biến tính: 94 C, 30 giây +Gắn mồi : 60 C, 30 giây +Tổng hợp: 72 C, 135 giây - Thời gian tổng hợp sau cùng: 72 C, 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose (Hình 19 Hình 20) Kết cho thấy với dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pCDNA3, thu 15 khuẩn lạc mang đoạn chèn cDNA-NK1 có kích thước mong muốn (Hình 19).Với dòng chứa vector tái tổ hợp peGFP-N1, thu 13 15 khuẩn lạc chứa đoạn chèn cDNANK1 có kích Hình 19: Điêṇ thước mong muốn (Hình 20) pCDNA 3-NK1 di sả n phẩ m PCR kiể m tra khuẩ n mang vector tá i tổ lac̣ hơp̣ Giếng 1A-14A: khuẩn lạc đánh s ố tương ứng; giếng M: thang chuẩn SY-500 Hình 20: Điêṇ pGFPN di sả n phẩ m PCR kiể m tra khuẩ n mang vector tá i tổ lac̣ hơp̣ Giếng 1E-15E: khuẩn lạc đá nh số tương ứng; giếng M: thang chuẩn SY-500 Như chú ng đã tá ch dò ng đư ợc hai vector tá i tổ hơp̣ 1-NK1 pCDNA 3-NK1 pEGFPN 1- NK1 mang cDNA hoàn chỉnh mã cho NK1 Dựa vào ảnh điện di, lựa chọn hai khuẩn lạc 11A 5E Các vector tái tổ hợp hai khuẩn lạc kí hiệu pCDNA3-NK1-11 pEGFP-N1-NK1-5 Chúng tơi tách chiết hai loại plasmid tái tổ hợp để giải trình tự 3.2.3 Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vector biểu Để khẳng định có mặt cDNA-NK1 vector biểu hiện, hai vector biể u hiêṇ pCDNA3-NK1-11 peGFP -N1-NK1-5 đươc̣ giải trình tư ̣ m ột chiều t đầu 5’ đoạn chèn NK1 bằ ng mồ i củ a vector Kế t quả giả i trin ̀ h tư ̣ cDNA -NK1 hai ̣ thố ng vector biể u t hiêṇ rên đều cho th 750 bp phía đầu 5’ cDNA -NK1 khơng có bấ t kỳ sự sai khá c nà o so vớ i trình tư ̣ cDNA gố c vector tách dòng pNK 1-3 Điề u đó chứ ng tỏ rằ ng chú ng đã thà nh công viêc̣ thiết kế vector bi ểu mang cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Việt Nam KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu đưa kết luận sau: Tách dòng thành cơng cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin – phổi người Việt Nam cDNA-NK1 có kích thước 1338 bp có nucleotide (ở vị trí 184, 333, 370, 641, 996) khơng giống với trình tự cDNA-NK1 ngân hang liệu, chứng tỏ đa hình gen mã cho thụ thể NK1 người Việt Nam Thiết kế thành công vector biểu pCDNA3 pEGFP-N1 mang cDNA mã cho thụ thể NK1 phân lập từ phổi người Việt Nam  ... tơi tách dòng thành cơng cDNA hồn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi người Việt Nam 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 3.2.1 Thiết kế mồi Để biểu cDNA mã. .. tin thụ thể β-arrestin tiến hành dung hợp gen mã hóa cho thụ thể với gen mã hóa cho NK1 biểu chúng hai hệ vector pCDNA3.1 pEGFP-N1 cho kết tốt Đây tiền đề cho lựa chọn thiết kế vector biểu pCDNA3... nucleotide gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Việt Nam với trình tự nucleotide ngân hàng liệu tính đa hình gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Như vậy, từ kết giải trình tự cho thấy