1 Lời cảm ơn Trong trình tìm hiểu, nghiên cứu hồn thành luận văn tốt ngiệp, tơi nhận lời bảo, hướng dẫn tận tình cô giáo: Tiến sĩ Trần Thị Phương Liên Bên cạnh đó, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Trung tâm chuyển giao cơng nghệ, Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình làm việc Cùng với hỗ trợ định từ gia đình, bạn bè đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu đó! Xn Hòa, ngày 26 tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Mạnh Cường Lời cam đoan Tôi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu riêng tơi Những số liệu, kết luận văn trung thực Cơng trình chưa công bố tài liệu Nếu sai, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm! Xuân Hòa, ngày 26 tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Mạnh Cường DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN ĐTD Đái tháo đường HDL –c High density lipoprotein cholesterol (Cholesterol tỉ trọng cao) VLDL –c Very low dentisy lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp LDL –c liên kết cholesterol) Low dentisy lipoprotein cholesterol (Lipoprotein liên kết cholesterol) STZ Streptozotocin TC Total cholesterol (Cholesterol toàn phần) TG Triglyxeride MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt dùng luận văn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tượng phạm vi ngiên cứu nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Đóng góp đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu số hợp chất tự nhiên thực vật 1.2 Bệnh béo phì (Obesity) 1.2.1 Thực trạng béo phì giới Việt Nam 1.2.2 Tác hại nguy bệnh béo phì 1.2.3 Nguyên nhân giải pháp phòng, điều trị béo phì 1.2.4 Rối loạn trao đổi lipid máu 1.3 Bệnh đái tháo đường (Diabetes mellitus) 1.3.1 Khái niệm phân loại 1.3.2 Thực trạng đái tháo đường giới Việt Nam 1.3.3 Tác hại biến chứng… 1.3.4 Phòng điều trị bệnh ĐTĐ 1.3.5 Chuyển hóa glucose điều hòa glucose huyết 1.4 Mối quan hệ béo phì đái tháo đường 1.5 Phương pháp gây đái tháo đường thực nghiệm STZ 1.6 Vài nét chung bí đao 1.6.1 Giới thiêu 1.6.2 Nguồn gốc 1.6.3 Phân loại, mơ tả 1.6.4 Thành phần hóa học 1.6.5 Một số tác dụng sinh – Dược công dụng bí đao Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu 2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học Bí đao 2.2.2.1 Định tính 2.2.2.2 Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau 1 4 4 5 12 13 14 15 16 16 17 18 18 19 20 21 23 23 24 24 24 24 26 26 28 28 28 28 30 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng dịch chiết phân đoạn Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) lên trọng lượng số số hóa sinh máu chuột béo phì thực nghiệm 2.2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD50 2.2.3.2 Xây dựng mơ hình chuột béo phì thực nghiệm 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết phân đoạn dịch chiết Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) mơ hình chuột đái tháo đường mô type2 2.2.5 Một số kĩ thuật phân tích hóa sinh 2.2.6 Xử lý số liệu Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Qui trình tách chiết phân đoạn từ Bí đao 3.2 Kết khảo sát thành phần hợp chất tự nhiên có phân đoạn dịch chiết Bí đao 3.2.1 Định tính số hợp chất tự nhiên có Bí đao 3.2.2 Định lượng polyphenol tổng số phân đoạn dịch chiết 3.3 Kết xác định liều độc cấp 3.4 Kết mơ hình chuột béo phì thực nghiệm 3.5 Tác dụng hạ glucose huyết Bí đao mơ hình chuột đái tháo đường type 3.5.1 Kết tạo mơ hình chuột đái tháo đường type thực nghiệm 3.5.2 Tác dụng phân đoạn dịch chiết từ Bí đao đến nồng độ glucose huyết lúc đói chuột ĐTĐ 3.6 Tác dụng đến chuyển hóa lipid Bí đao mơ hình chuột ĐTĐ type KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU 29 29 30 32 33 35 36 36 37 37 39 41 41 46 46 49 52 55 56 57 Lý chọn đề tài Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn trao đổi chất với biểu chung chứng tăng đường huyết Căn bệnh trở thành mối nguy hại toàn cầu trung bình 10 giây có người tử vong ĐTĐ Hiện tồn giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh đái tháo đường Dự báo đến năm 2030, số tăng lên 366 triệu người Mỗi năm, giới có khoảng 3,2 triệu người chết bệnh Đái tháo đường, tương đương số người chết hàng năm bệnh HIV/AIDS Đáng ý bệnh có xu hướng gia tăng mạnh quốc gia phát triển châu Phi, châu Mỹ La Tinh châu Á, đặc biệt độ tuổi lao động Riêng châu Á, số liệu công bố hội nghị ĐTĐ quốc tế tổ chức vào tháng 12 năm 1997 Singapo cơng bố: năm 1995 có khoảng 62 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, cuối năm 2002 số 89 triệu người Theo đánh giá Hiệp hội ĐTĐ quốc tế (IDF) năm 2005 số người mắc bệnh ĐTĐ châu Á tăng lên 1.7 lần WHO cảnh báo xuất “đại dịch ĐTĐ” châu Á vào kỷ 21 [24], [2], [3] Tính đến nay, Việt Nam có gần triệu người mắc bệnh đái tháo đường Với tỷ lệ tăng từ 8-20% năm, Việt Nam nằm nhóm nước có tỷ lệ bệnh đái tháo đường tăng nhanh giới Thống kê Hội Người giáo dục bệnh ĐTĐ Việt Nam cho thấy, năm 2002, tỷ lệ người mắc ĐTĐ chiếm 2,7% dân số số lên 7,2%, khu vực đô thị, thành phố lớn tập trung nhiều người mắc Đối tượng mắc ĐTĐ thường độ tuổi từ 30 - 65, có bệnh nhân bị ĐTĐ - 10 tuổi, điều phản ánh trẻ hóa bệnh nước ta ĐTĐ khơng có tính chất bệnh mạn tính, ĐTĐ kèm theo nhiều biến chứng nguy hiểm bệnh thận dẫn đến suy thận, bệnh mắt dẫn đến mù lòa, tổn thương hệ thần kinh đặc biệt biến chứng mạch máu (xơ vữa động mạch) dẫn đến tử vong bệnh mạch vành, nhồi máu não, xuất huyết não…[17], [45], [23], [7], [16] Ngày 21 tháng 12 năm 2006, Hội Đồng Liên Hiệp Quốc thông qua nghị thống chung, tuyên bố ĐTĐ vấn đề sức khỏe cộng đồng quốc tế Đây lần bệnh không truyền nhiễm lại xem vấn đề sức khỏe cộng đồng quốc tế ĐTĐ bệnh thứ hai sau AIDS đạt đến tầm quan trọng Trong năm đến, ĐTĐ mối đe dọa sức khỏe cộng đồng tăng lên nước phát triển phát triển Y học ngày có nhiều loại thuốc chữa bệnh ĐTĐ có hiệu insulin, sulfonylurea, biguanid, Tuy nhiên, hầu hết loại thuốc có tác dụng phụ chi phí điều trị đắt đỏ [10], [30], [2], [22] Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành vấn đề lớn cho sức khỏe bệnh có tỷ lệ mắc, chết trầm trọng trình trị liệu lâu dài, đặc biệt ĐTĐ type bệnh phổ biến bệnh ĐTĐ ĐTĐ mang nhiều biến chứng nguy hiểm như: biến chứng võng mạc, suy thận, biến chứng mạch máu lớn, tổn thương bàn chân dẫn đến cụt Vì đại đa số người bệnh có nhu cầu chữa bệnh cách an tồn Mỗi năm nước Mỹ hàng tỉ đô la cho điều trị ĐTĐ thuốc tổ chức an toàn thực phẩm dược phẩm Mỹ phê chuẩn (Food and Drug Aministration - FDA) như: Metformin, Orlistat, Sibutramin, Ephedrin, Fenfluramin Song hầu hết thuốc có nguồn gốc tổng hợp, thường có tác dụng phụ đắt tiền Trước tình hình ủy ban chun gia (WHO) khuyến nghị nên sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược sẵn có, giá thành rẻ độc tính [4], [2] Trong lịch sử Y học từ 1550 năm trước công nguyên, người biết dùng cỏ để chữa ĐTĐ Nhiều loại thảo dược chứng tỏ có tác dụng tốt việc điều trị ĐTĐ như: mướp đắng, sinh địa, hoàng kỳ, huyền sâm, cỏ ngọt, chè xanh, khoai lang,…Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học tác dụng dược lý lồi thuốc có giá trị Việt Nam nhằm đặt sở khoa học cho việc sử dụng chúng cách hợp lý, hiệu có tầm quan trọng đặc biệt Quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) loài thực vật thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) Bí đao gốc Ấn Độ, trồng rộng rãi khắp vùng nhiệt đới nhiệt đới châu miền Ðông châu Ðại Dương Ở nước ta, Bí đao trồng khắp nơi để lấy Nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng chống oxy hố bí đao tế bào mô gan, não, thận Đây sở tác dụng dược lý bí đao cơng bố, là: kháng viêm, kháng dị ứng, hạ đường huyết, phòng chống Alzheimer, béo phì, u xơ, ung thư Nhóm nghiên cứu Chetan Nandecha cộng khẳng định cao chiết hạt bí đao có hoạt tính ức chế 5α-reductase, giúp C Nandecha phòng chống phì đại tiền liệt tuyến mơ hình thực nghiệm Nghiên cứu nhóm tác giả Ấn Độ (T Jayasree, 2011) cho thấy cao chiết nước bí đao làm tăng thể tích nước tiểu, tăng tiết ion natri clor, lại giảm tiết kali Kết khẳng định vai trò bí đao với bệnh nhân phù thũng, cao huyết áp Những kinh nghiệm cổ truyền công bố khoa học đại cho thấy bí đao ăn thuốc hữu hiệu phòng chống bệnh liên quan đến oxy hố, có thừa cân béo phì bệnh tim mạch khác Với lí trên, nhằm góp phần tìm kiếm nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường từ thành phần hóa học Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) chuột nhắt gây bệnh ĐTĐ streptozotocin (STZ), định chọn đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu đặc tính hố sinh dược số phân đoạn dịch chiết từ Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)” Nghiên cứu thực với mục tiêu sau: - Tìm hiểu thành phần hóa học Bí đao - Tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết số phân đoạn dịch chiết Bí đao mơ hình chuột gây ĐTĐ thực nghiệm STZ Mục đích nghiên cứu Đánh giá hoạt tính sinh dược học số phân đoạn dịch chiết từ Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1 Khảo sát sơ thành phần hợp chất tự nhiên có Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) 3.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Ciocalteau 3.3 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết phân đoạn dịch chiết Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) mơ hình chuột ĐTĐ mô type Đối tượng nghiên cứu 4.1 Mẫu thực vật - Quả bí đao (Benincasa hispida Cogn.) - Địa điểm thu mẫu: Phúc Yên – Vĩnh Phúc 4.2 Mẫu động vật vi sinh vật - Chuột nhắt trắng chủng Swiss tuần tuổi (18- 20 g), Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp Phương pháp nghiên cứu 5.1 Phương pháp hoá lý hoá học 5.2 Sử dụng phương pháp hố sinh 5.3 Tạo mơ hình chuột BP, tạo mơ hình chuột ĐTĐ typ II 5.5 Sử dụng phương pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu Đóng góp đề tài Đánh giá khả hạ glucose huyết số phân đoạn dịch chiết lên mô hình chuột ĐTĐ mơ type thơng qua số glucose huyết, số lipit máu chuột sau 21 ngày điều trị NỘI DUNG Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu số hợp chất tự nhiên thực vật 1.1.1 Flavonoid thực vật Trong số polyphenol tự nhiên, flavonoid nhóm chất quan trọng chúng phổ biến hầu hết lồi thực vật có nhiều hoạt tính sinh - dược học có giá trị [9] 1.1.1.1 Cấu tạo hố học phân loại Về cấu tạo hóa học, khung cacbon flavonoid C6 - C3 - C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, hai vòng benzene A B nối với qua dị vòng C, A kết hợp với C tạo khung chroman 2' B 1' C A 3' O 10 6' 4' 5' Flavan (2-phenyl chroman) Tùy theo mức độ oxy hố vòng pyran, có mặt hay khơng có mặt nối đơi C2 C3 nhóm cacbonyl C4 mà phân biệt flavonoid thành nhóm phụ sau: flavon, flavonol, flavanon, chalcon auron, antoxyanidin, leucoantoxyanidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid, neoflavonoid Flavonoid tồn hai dạng: dạng tự gọi aglycon dạng liên kết với đường gọi glycoside Các glycoside bị thuỷ phân acid enzyme giải phóng đường aglycon tương ứng Có dạng glycoside O-glycoside C-glycoside Đối với O-glycoside phân tử đường liên kết với flavonoid thơng qua nhóm hydroxyl rutin; C-glycoside, flavonoid liên kết với đường thông qua nguyên tử cacbon saponin OH HO OH O - Rhamnose - gluco O Rutin 1.1.1.2 Hoạt tính sinh học flavonoid Gluco se OH Saponin O tiêm vậy, đạt hiệu suất gây ĐTĐ 87% chuột có đường huyết ≥ 18mmol/l Lô chuột thường tiêm STZ với liều trên, nồng độ glucose huyết lúc đói có tăng nhẹ sau tiêm (nồng độ glucose lúc đói trước sau 72 tiêm tương ứng 6.56 8.04 mmol/l) Điều chuột ăn chuẩn tự điều chỉnh nồng độ glucose máu nhờ tăng lượng Insulin tiết để điều hòa lượng glucose máu Đối với lơ chuột béo phì tiêm STZ nồng độ glucose sau 72 tiêm tăng cách rõ rệt (từ 7.51mmol/l trước tiêm lên 21.22 mmol/l sau tiêm 72 giờ) 3.5.2 Tác dụng phân đoạn dịch chiết từ Bí đao đến nồng độ glucose huyết lúc đói chuột ĐTĐ Với mơ hình thí nghiệm phần phương pháp nghiên cứu, thu kết thể bảng 3.9 hình 3.6 sau: Bảng 3.9 Kết nồng độ glucose huyết lúc đói lơ chuột sau 21 ngày điều trị Các lô chuột điều trị Chuột ăn chuẩn Chuột ĐTĐ không điều trị Chuột ĐTĐ + Met Nồng độ glucose huyết lúc đói (mmol/l) Trước ngày 10 ngày 15 ngày 21 ngày điều trị điều trị điều trị điều trị điều trị 6.5 6.7* 6.4* 6.8* 6.7* ±0.4 ±0.2 ±0.3 ±0.5 ±0.1 (↑2.2%) (↓1.4%) (↑4.8%) (↑2.5%) 21.8 23.3* 22.5* 24.1* 22.9* ±4.1 ±1.4 ±1.3 ±1 ±1.4 (↑6.6%) (↑3.3%) (↑10.5%) (↑4.8%) 20.5 15.6** 15.1** 11.8*** 9.1*** ±3.7 ±1.4 ±1.6 ±1.5 ±1.6 (↓24.2%) (↓26.5%) (↓42.5%) (↓55.9%) Chuột ĐTĐ 25.7 17.9** 16.8** 14.3** 10.1** + Cao nước ±2.6 ±3.9 ±3.0 ±3.1 ±1.6 Chuột ĐTĐ + CHCl3 Chuột ĐTĐ + EtOAc Chuột ĐTĐ + nHexan Chuột ĐTĐ + EtOH (↓30.6%) (↓34.8%) (↓44.5%) (↓60.7%) 21.6 15.5** 16.1** 13.4** 7.7** ±4.7 ±1.9 ±2.0 ±1.3 ±0.35 (↓28.4%) (↓25.3%) (↓42.4%) (↓64.5%) 22.3 15.5** 14.1** 10.9** 8.4** ±3.9 ±1.9 ±2.5 ±1.3 ±1.6 (↓30.6%) (↓36.7%) (↓51.2%) (↓62.3%) 21.3 14.8** 14.5** 11.6** 10.3*** ±4.4 ±1.9 ±1.6 ±0.9 ±0.6 (↓30.8%) (↓31.7%) (↓45.5%) (↓52.1%) 22.4 16.5** 15** 11.9** 9.3** ±4.7 ±1.3 ±1.8 ±1.8 ±0.8 (↓25.7%) (↓32.8%) (↓46.8%) (↓58.1%) (Ghi chú: Số liệu thể bảng giá trị trung bình chuột/lơ; giá trị p là: *:(p>0.05); **:(p17.15mmol/l) phần lớn chuột béo có khả bị ĐTĐ cao Một số phân đoạn dịch chiết từ Bí đao có khả hạ đường huyết mơ hình chuột ĐTĐ: Hàm lượng glucose huyết lô chuột uống lô chuột uống cao n-Hexan giảm 52.1%; lô chuột uống phân đoạn cao cồn tổng số giảm 58.1%; cao phân đoạn nước giảm 60.7%; lô chuột uống cao phân đoạn ethylacetate nồng độ glucose huyết giảm tới 62.3% giảm mạnh lô chuột uống cao chloroform giảm 64.5% so với lơ bình thường Với liều uống 2000mg/kg thể trọng chuột ĐTĐ cao phân đoạn CHCl3 cao phân đoạn EtOAc, sau 21 ngày điều trị số Cholesterol toàn phần giảm tương ứng 14.18% 16.67%, số triglixerit giảm tương ứng 26.31% 28.8%; số LDL-c giảm mạnh nhất: giảm 339.19% điều trị phân đoạn cao chloroform giảm 42.4% điều trị phân đoạn cao EtOAc Mặt khác số HDL – c lại có xu hướng tăng mạnh: tăng 151% điều trị phân đoạn cao chloroform tăng 154% điều trị phân đoạn cao EtOAc (p