Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu và khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1. (Khóa luận tốt nghiệp)
TRƢỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÀN THỊ NGÂN Tên đề tài: “ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT Thermococcus kodakarensis KOD1” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học : Chính quy : Cơng nghệ Sinh học : CNSH- CNTP : 2012- 2016 Thái Nguyên- Năm 2016 TRƢỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÀN THỊ NGÂN Tên đề tài: “ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT Thermococcus kodakarensis KOD1” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH- CNTP Khóa học : 2012- 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: TS Phạm Bằng Phƣơng Thái Nguyên- Năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Được trí Ban Giám hiệu Nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm thời gian thực đề tài tốt nghiệp em thực đề tài: “ Nghiên cứu khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” Qua sáu tháng thực tập phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên em thu kết thiết thực phục vụ cho việc hoàn thành đề tài tốt nghiệp Để đạt kết em xin chân thành cảm ơn chị Ma Thị Hoàn giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực tập tốt nghiêp Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Bằng Phƣơng, môn Công nghệ Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên tận tình bảo, hướng dẫn em thời gian thực đề tài Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ủng hộ,giúp đỡ động viên em suốt thời gian học tập nghiên cứu Do thời gian thực đề tài có hạn nên khơng thể tránh khỏi sai sót, em mong nhận đóng góp ý kiến thầy bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực Bàn Thị Ngân ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 : Danh mục thiết bị 18 Bảng 3.2 : Thành phần môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 19 Bảng 3.3: Một số thành phần khống sử dụng ni cấy 21 Bảng 3.4: Thành phần số vitamin sử dụng q trình ni cấy 22 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR .28 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 Hình 2.2 : Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus Hình 2.3: Sơ đồ giải trình tự gen vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 Hình 2.4: Cấu tạo hóa học aminopeptidase 12 Hình 2.5 : Kiểm tra so sánh trình tự protein gen Tk 1178 với số trình tự khác ngân hàng liệu NCBI 14 Hình 3.1 : Màu sắc môi trường thay đổi bổ sung thêm lưu huỳnh .20 Hình 3.2 : Môi trường nuôi cấy Thermococcus kodakarensis KOD1 sau bổ sung lưu huỳnh hấp khử trùng dòng ni tơ 20 Hình 3.3 : Trình tự gen tk1178 trang NCBI 25 Hình 3.4 : Bản đồ enzyme cắt giới hạn gen Tk1178 26 Hình 3.5 : Kết kiểm tra trình tự đoạn mồi dựa chương trình Tm Calculator 27 Hình 3.6: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen Tk 1178 29 Hình 4.1: Kết điện di kiểm tra DNA genome 32 Hình 4.2 : Kết so sánh trình tự protein gen TK1178 với số gen thuộc giới Achaea .33 Hình 4.3: Kết khuếch đại đoạn gen Tk1178 điều kiện nhiệt độ tối ưu 34 Hình 4.4: Mức nhiệt độ tương ứng với thứ tự giếng 35 Hình 4.5 : Kết điện điện di sản phẩm PCR đoạn gen Tk1178 mức nhiệt độ khác .35 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Ý nghĩa từ, cụm từ viết tắt Các từ, cụm từ viết tắt Dal Dalton DNA Deoxyribonucleic acide dNTPs Deoxynucleotide trytophate Bp Base pair Kb Kilobase PCR Polymerase chain reaction EDTA Etilenduamin tetraacetic acide TE Tris- EDTA TK Thermococcus kodakarensis IPTG Isopropyl- β- D- Thiogalactopyranosidase SDS Sodium dodecyl sulfate NCBI National center for biotechnology infor mation TAE Tris- acetate- EDTA v MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề .1 1.2.Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.3.Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học .2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 2.1 Tổng quan vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 .4 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc 2.1.1.2 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm chung cho phát triển tồn .6 2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy 2.2 Đặc điểm enzyme aminopeptidase gen Tk1178 tổng hợp .10 2.2.1.Khái niệm enzyme, proteae, ý nghĩa ứng dụng 10 2.2.1.1 Enzyme 10 2.2.1.2 Khái niệm, phân loại đặc tính ứng dụng protease 11 2.2.1.3 Ý nghĩa ứng dụng 12 2.2.2 Protease Tk1178 .13 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1.Đối tượng nghiên cứu 16 3.2.Nội dung nghiên cứu 16 3.2.1.Nội dung 1: Nghiên cứu tách chiết DNA tổng số vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 16 3.2.2 Nội dung 2: So sánh trình tự protein gen Tk1178 với số trình tự protein khác họ 16 vi 3.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu khuếch đại đoạn gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 16 3.2.4 Nội dung 4: Kiểm tra ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến khuếch đại đoạn gen Tk 1178 16 3.3.1.Hóa chất 16 3.3.2.Thiết bị, dụng cụ 16 3.4.Phương pháp 17 3.4.1.Phương pháp nuôi cấy 17 3.4.2.Phương pháp tách chiết DNA genome .21 3.4.3.Phương pháp điện di 22 3.4.4 Phương pháp PCR 23 3.4.4.1.Thiết kế mồi cho gen Tk1178 .23 3.4.4.2.Tiến hành PCR 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 4.1.Kết tách chiết DNA genmome vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 29 4.2.Kết so sánh trình tự protein Tk1178 với số protein gen khác giới Archaea 30 4.3.Kết khuếch đại đoạn gen Tk1178 kỹ thuật PCR 33 4.4.Kết kiểm tra ảnh hưởng nhiệt độ tới khuếch đại gen Tk1178 34 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1.Kết luận .36 5.2.Kiến nghị .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 chủng vi khuẩn thuộc giới vi khuẩn cố Archea đươc nhà khoa học phân lập từ miệng núi lửa gần bờ biển thuộc đảo Kodakara Nhật Bản, có khả sống điều kiện nhiêt độ từ 60100 0C ( tối ưu 85 0C ) khả sống dải pH rộng ( từ 5- 9, tối ưu 5,5 ) [7] Theo phân loại ( Hình 2.2 ) trình tự 16s rRNA quết định phân loại khác loài theo Thermococcales, nghiên cứu cho thấy KOD1 có trình tự 16s RNA thành viên chi Thermococcus, nghiên cứu trình tự 16S DNA ribosome dẫn đến khả phân loại khác bao gồm Thermococcus peptonophilus Thermococcus , kết lai DNA- DNA khác biệt đặc tính phát triển với việc sử dụng chất để phân lập chủng KOD1 từ T peptonophilus T stetteri mức độ loài trình tự KOD1 đại diện cho loài Thermococcus, mà biết đến Thermococcus kodakaraensis KOD1 sp [10] Hệ gen KOD1 có hai nghìn đoạn gen khác ( 2434 gen ) có đoạn gen Tk1178 có khả mã hóa cho enzyme aminopeptidase, nhà khoa học trường đại học Khoa Hóa tổng hợp sinh học Hóa học, Trường Đại Học Kỹ thuật, Đại học Kyoto, Katsura, Nishikyo-ku, Kyoto, Nhật Bản Cục Chất liệu Khoa học đời sống, trường Kỹ thuật, Đại học Osaka, Yamadaoka, Suita, Osaka, Nhật Bản công bố cụ thể trang NCBI [7] Aminopepdidase enzyme xúc tác phân cắt axit amin từ amino protein hay peptide Chúng có mặt động vật thực vật tìm thấy nhiều bào quan tế bào, bào tương, thành phần màng tế bào Một số aminopeptidases monome, khối lượng tương đối cao (50 kDa) giúp tiêu hóa enzyme protein đóng vai trò vơ quan trọng khả bền với nhiệt độ cao khó bị biến tính enzyme khác lại biến tính nhanh thay đổi nhiệt độ lên mức cao, dễ tham gia phản ứng ứng dụng nhiều công nghiệp lĩnh vực nghiên cứu khoa học [6] Chính ứng dụng quan trọng enzyme nên ngày có nhiều cơng trình nghiên cứu enzyme khả tổng hợp enzyme từ sinh vật ( động vật, thực vật vi sinh vật ) [4] Đoạn gen Tk 1178 vi khuẩn Thermococcus korakadensis KOD1 (T korakadensis ) có khả mã hóa enzyme aminopeptidase, ứng dụng nhiều công nghiệp sản xuất thực phẩm ( sản xuất bột giặt, loại bánh mỳ…), y học…Trong suốt q trình thực tập tốt nghiệp tai phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc khoa Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, hướng dẫn TS Phạm Bằng Phƣơng, thực đề tài “ Nghiên cứu khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” với mục tiêu khuếch đại đoạn gen tìm nhiệt độ tối ưu cho phản ứng khuếch đại- phản ứng PCR, phục vụ cho nghiên cứu tạo dòng, tinh kiểm tra hoạt tính enzyme gen Tk1178 mã hóa 1.2.Mục tiêu yêu cầu đề tài - Mục tiêu : + Nghiên cứu đặc điểm protein gen Tk1178 + Khuếch đại đoạn gen TK1178 từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 -Yêu cầu : + Nghiên cứu, nắm bắt đặc điểm vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 gen TK1178 + Khuếch đại đoạn gen TK1178 kỹ thuật PCR + So sánh trình tự TK1178 với trình tự số gen nhóm 1.3.Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Nghiên cứu khuếch đại thành cơng gen TK1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 thuận lợi cho việc nghiên cứu tạo dòng gen sau - Cung cấp tài liệu cho nghiên cứu sinh viên nghiên cứu khuếch đại đoạn gen tương tự nghiên cứu mở rộng việc tạo dòng gen ... cứu khuếch đại gen Tk1178 mã hóa cho enzyme aminopeptidase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1” với mục tiêu khuếch đại đoạn gen tìm nhiệt độ tối ưu cho phản ứng khuếch đại- ...TRƢỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÀN THỊ NGÂN Tên đề tài: “ NGHIÊN CỨU VÀ KHUẾCH ĐẠI GEN TK1178 MÃ HÓA CHO ENZYME AMINOPEPTIDASE TỪ VI KHUẨN CHỊU NHIỆT Thermococcus kodakarensis KOD1” KHÓA... lợi cho vi c nghiên cứu tạo dòng gen sau - Cung cấp tài liệu cho nghiên cứu sinh vi n nghiên cứu khuếch đại đoạn gen tương tự nghiên cứu mở rộng vi c tạo dòng gen Khóa luận đầy đủ file: Khóa luận