BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU ===o0o=== PHÙNG MINH DŨNG NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN LẬP TETRODOTOXIN VÀ MỘT SỐ ĐỘC TỐ THẦN KINH KHÁC TỪ CÁ NÓC CHUYÊN NGÀNH : Dược học cổ truyền MÃ SỐ : 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, 2017 Cơng trình hồn thành tại: - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, - Viện Dược liệu - Công ty CP Dược Mediplantex Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Việt Hùng Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh PGS TS Nguyễn Tiến Vững Viện Pháp Y Quốc gia Phản biện : ………………………………………… ………………………………………… Phản biện : ………………………………………… ………………………………………… Phản biện : ………………………………………… ………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ phiên thức tại: Viện Dược liệu, Bộ Y tế, số 3B Quang Trung, Quận Hoàn Kiếm, Hà Nội Vào hồi ………… giờ……….ngày……….tháng…… năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện : *Thư Viện Quôc gia Viện Nam * Viện Dược liệu, Bộ Y tế * Trang Web Bộ GDĐT MỞ ĐẦU Đại dương với nguồn tài nguyên vô lớn, chiếm tới 70% diện tích bề mặt trái đất Đại dương nơi sinh sống 34 36 ngành sinh vật trái đất với 500.000 loài thực - động vật vi sinh vật (VSV) biết đến Đây nguồn cung cấp vơ số sản phẩm tự nhiên quý giá từ loài sinh vật biển rong biển, chân rết, rêu biển (bryozoan), thân mềm từ loài vi khuẩn biển vi khuẩn lam Trong đó, khu vực Ấn Độ Dương Thái Bình Dương có vùng đa dạng sinh vật biển nhiệt đới lớn giới Nguồn tài nguyên phong phú gần thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học Nghiên cứu, khai thác tài nguyên sinh vật biển, vấn đề cấp bách không nước ta mà toàn giới Với phong phú đa dạng sinh vật, đại dương hứa hẹn nơi phát triển nhiều hợp chất chứa hoạt tính quý báu, giúp ích cho yêu cầu phát triển tìm kiếm loại thuốc mới, hiệu quả, đặc hiệu điều trị bệnh hiểm nghèo ung thư, tim mạch, tiểu đường, HIV/AIDS… Hiện nay, bệnh ung thư nghiện ma tuý gánh nặng cho quốc gia Việc tìm kiếm hoạt chất có tác dụng hỗ trợ bệnh nhân ung thư giúp giảm nghiện ma tuý mong muốn nhiều quốc gia, đặc biệt ngành y tế Tetrodotoxin (TTX) độc tố thần kinh không protein (neurotoxin nonprotein), độc tố tự nhiên có độc tính cao (LD50 = 8-11 µg/kg) với liều gây chết cho người – mg qua đường tiêu hóa [2, 5] Do lực mạnh có tác dụng chẹn kênh natri cách đặc hiệu, dẫn tới làm tê liệt dẫn truyền thần kinh, TTX thể tác dụng giảm đau trung ương mạnh [5] TTX tìm thấy nhiều lồi khác nhau, bao gồm cá nóc, cá bống bóng, sa giơng, cóc (ếch độc) bạch tuộc vòng lam Cá nóc, đặc biệt trứng nó, nguồn TTX biết tới nhiều TTX phân bố khác loài cá khác nhau, phận lồi khác Vì vậy, cần phải có nghiên cứu phân biệt, đánh giá độc tố nhằm hạn chế vụ ngộ độc, định hướng nghiên cứu Gần đây, giới Việt Nam, TTX chất tương tự TTX (TTX analogues) như: 4- epi TTX, 4-epi anhydro TTX… thử nghiệm chất dẫn đường (lead compound) tiềm hướng tới điều trị số bệnh hiểm nghèo bệnh tim mạch, giảm đau ung thư, cai nghiện ma tuý,…[1], [3], [4] Để phục vụ nghiên cứu định hướng ứng dụng y học, đánh giá chất lượng độ an toàn sản phẩm có chứa TTX từ cá cần thiết phải có chất đối chiếu hóa học TTX đủ độ tinh khiết để làm chất chuẩn Vì vậy, việc chiết xuất, phân lập tinh chế TTX từ cá làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm trở nên cần thiết, đặc biệt, việc mua chuẩn TTX từ nước ngồi khó khăn chi phí cao (khoảng 200$/1mg TTX) Mặc dù tetrodotoxin hợp chất biết từ lâu, có nhiều đường, phương pháp điều chế, nhiên, nay, chủ yếu TTX chiết xuất từ cá Trong Việt Nam với tiềm dược liệu biển, trữ lượng cá lớn, việc chiết xuất TTX dẫn chất từ cá có ý nghĩa quan trọng Vì vậy, luận án “Nghiên cứu phát xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin số độc tố thần kinh khác từ cá nóc” thực nhằm mục tiêu: - Sàng lọc phát tetrodotoxin số lồi cá - Phân lập, xác định cấu trúc số độc tố thần kinh khác (tetrodotoxin analogues) từ cá - Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập tinh chế tetrodotoxin có độ tinh khiết phù hợp để làm chất chuẩn bước đầu bào chế bột đông khô định hướng sử dụng y học Những đóng góp luận án (1) - Đưa liệu 10 lồi cá độc Việt Nam, gồm: đặc điểm hình thái, danh pháp, hình ảnh tiêu liệu độc tính, góp phần nhận dạng cá độc định hướng nghiên cứu (2) - Lần đầu tiên, thu hợp chất TTX tinh khiết (>95%) chất chuẩn đối chiếu hóa học TTX thiết lập Việt Nam Chất chuẩn sử dụng kiểm nghiệm độc tố TTX an toàn thực phẩm nghiên cứu ứng dụng TTX làm thuốc Ngoài ra, từ TTX tinh khiết nghiên cứu bào chế thuốc tiêm tạo dẫn xuất khác nhằm giảm độc tính thay đổi lực với kênh Na+ hướng nghiên cứu thực tiếp (3) - Ngoài TTX, lần Việt Nam, phân lập dẫn chất TTX 6-deoxytetrodotoxin từ cá viền đen Arothron immaculatus, 6epitetrodotoxin 5-deoxytetrodotoxin từ cá vằn Takifugu oblongus, 11deoxytetrodotoxin từ cá mỏ chim Lagocephalus inermis 6,11dideoxytetrodotoxin phân lập từ cá tro Lagocephalus lunaris Các hợp chất tương tự TTX (TTX analogues hay TTXs) tiếp tục nghiên cứu hướng phát triển thuốc mới, tìm kiếm chất dẫn đường (lead copounds) tiềm năng, hạn chế nhược điểm TTX, bổ sung thêm cho nghiên cứu tìm hiểu hình thành độc tố sinh vật nghiên cứu liên quan cấu trúc tác dụng nhóm chất này, … vv (4) - Xây dựng quy trình chiết xuất, tinh chế tiêu chuẩn bột TTX thơ >80%, qua phân tích xác định 20% lại chủ yếu chất độc thần kinh TTXs Các analogues qua nghiên cứu cho thấy độc tính chúng thường nhiều lần so với độc tính TTX Từ bột TTX thô luận án bào chế thử nghiệm dạng bột đông khô nồng độ 0,1% Bột đông khô xây dựng tiêu chuẩn sở để kiểm sốt chất lượng, đánh giá độc tính để định hướng ứng dụng làm nguyên liệu bào chế sản phẩm khác, đặc biệt sản phẩm giảm đau, hỗ trợ cai nghiện, … Ngoài ra, từ bột đơng khơ hướng đến nhiều dạng thuốc chứa TTX phục vụ mục đích khác mà nhà khoa học giới tiếp tục nghiên cứu như: + Thuốc gây tê, gây mê dùng phẫu thuật + Thuốc kháng virus HIV + Thuốc kháng số loại ung thư ung thư vú (5) - Thiết kế hệ thống thiết bị xay ngâm chiết TTX từ phủ tạng cá độc Việt Nam (đã đăng ký giải pháp hữu ích), với quy trình cơng nghệ phân lập, tinh chế TTX áp dụng thực quy mơ lớn, cơng nghiệp hóa Đối tượng quy trình cơng nghệ phủ tạng lồi cá độc, tận dụng phế phẩm ngành công nghiệp chế biến cá phủ tạng Điều làm tăng lợi ích kinh tế thặng dư xã hội, góp phần khai thác hợp lý nguồn lợi tự nhiên tương đối lớn biển Việt Nam cá CHƯƠNG I TỔNG QUAN Phần tổng quan tổng hợp tài liệu nghiên cứu nước liên quan đến vấn đề sau: 1.1 CÁ NĨC 1.2 TETRODOTOXIN 1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ TTX 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG TTX 1.5 CHẤT CHUẨN VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Một số lồi cá độc thu mẫu vào tháng 2, 3, năm 2011, 2012 2013 vùng biển tỉnh Khánh Hòa Vũng Tàu, Việt Nam, định danh làm tiêu lấy phần nội tạng (trứng, gan, ruột) làm mẫu nghiên cứu Mẫu bảo quản nhiệt độ -10ºC, Khoa Nghiên cứu Phát triển, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương 2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 2.2.1 Hóa chất thuốc thử Chất chuẩn Tetrodotoxin (TTX) mg/lọ (Sigma Aldrich, 1mg Tetrodotoxin mg đệm citrat pH 4,8/lọ, hàm lượng: 99,0 %, Lot No: 038K1804 Thêm 1ml nước có dung dịch TTX đệm pH 4,8 nồng độ 1mg/ml); Nước khử ion, ethanol; acid acetic khan, acid acetic loãng (1%, 3%, 5%, 10%, tt/tt), dung dịch acid acetic 0,2% (tt/tt) ethanol; amoniac đậm đặc (13,5M), amoniac 10% (tt/tt); natri hydroxyd, natri hydroxyd loãng (0,1 M; M), pyridin, n-butanol, dung dịch đệm acetat (dung dịch nước cất chứa 15 mM amoni acetat 15 mM acid acetic), dung dịch đệm phosphat pH (0,5 g kali dihydrophosphat (TT) 1,1 g dikali hydrophosphat (TT) 900 ml nước Điều chỉnh pH tới 7,0 dung dịch acid phosphoric M (TT) dung dich natri hydroxyd M (TT) thêm nước vừa đủ 1000 ml), dung dịch đệm citrat 100 mM điều chỉnh pH = 4,8; dung dịch acid sulfuric loãng 2%; dung dịch acid citric 2%; methanol dùng cho HPLC, natri heptansulfonat, nước cất siêu tinh khiết; than hoạt tính, nhựa trao đổi cation Amberlit IRC-60 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ Lò vi sóng, máy khuấy trộn siêu tốc, máy đo pH (Metler Toledo), cân phân tích, cân phân tích Mettler MS105 độ nhạy 0,01 mg; Micro pipette Eppendoff 100 µL – 1000 µL; Bản mỏng silica gel GF245 – Merck; Dụng cụ thủy tinh loại (ống đong, cốc có mỏ, bình định mức…); Cột trao đổi cation Bio-Gel-P2 Bio-Rex 70 (Bio Rad), cột thủy tinh dùng cho sắc ký cột với kích thước khác (20 cm x 10 cm, 50 cm x 10 cm, 50 cm x cm, 60 x cm); Cột chiết SPE: Cột C18 (Accubond 500mg, 3mL); cột trao đổi ion Strata SCX (500mg, 3mL); Cột Evidex (200mg, 3mL); Hệ thống cô quay áp suất giảm Buchi; Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR, Bruker Advance, 500MHz), dung môi CF3COOD – D2O (1:99, v/v) CF3COOD – D2O (4:96, v/v); Sắc ký lỏng khối phổ phân giải cao (LC – FT ICR MS, Varian 900 MS); Sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS/MS) Thermo Finigan LCQ Advantage Max, detector PDA MS/MS; Sắc ký lỏng khối phổ LC ESI Orbitrap (Thermo LTQ Orbitrap XL); Sắc ký lỏng khối phổ tandem MS (LC-MS, Thermo Finnigan TSQ Quantum); Sắc ký lỏng bán điều chế Agilent 1060 (Agilent Technologies), detector UV.Thiết bị xay ngâm chiết (có thể xay 20 kg/mẻ) 2.2.3 Đô ̣ng vâ ̣t thí nghiêm ̣ - Chuột nhắ t trắ ng chủng Swiss, cả hai giố ng, cân nă ̣ng từ 18 – 22 g, khỏe ma ̣nh Viê ̣n Vê ̣ sinh dich ̣ tễ Trung ương cung cấ p - Thỏ trắ ng thuầ n chủng, cả hai giố ng, khỏe ma ̣nh, cân nă ̣ng từ đế n 2,5 kg Trung tâm Động vật thí nghiệm G1 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Thu mẫu, định danh, xử lý mẫu, bảo quản, vận chuyển cá từ nơi thu mẫu đến phòng thí nghiệm 2.3.2 Nghiên cứu phát hiện, định tính, định lượng TTX 2.3.2.1 Xác định nhanh độ độc phủ tạng lồi cá 2.3.2.2 Định tính, định lượng tetrodotoxin 2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học, phân lập TTX dẫn chất từ số lồi cá 2.3.3.1 Phát tetrodotoxin chất tương tự từ số lồi cá độc 2.3.3.2 Phân lập tetrodotoxin dẫn chất từ số lồi cá 2.3.4 Chiết xuất tinh chế tetrodotoxin làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 2.3.4.1 Chiết làm giàu mẫu (dịch chiết tồn phần có chứa TTX) 2.3.4.2 Tinh chế kết tinh cho sản phẩm TTX thô 2.3.4.3 Tinh chế TTX thô sắc ký điều chế để thu TTX có độ tinh khiết cao 2.3.5 Thiết lập chất chuẩn tetrodotoxin 2.3.5.1 Nghiên cứu độ ổn định tetrodotoxin số dung môi 2.3.5.2 Quy trình đóng ống chuẩn, 100 µg chất/lọ ml 2.3.5.3 Kiểm tra, đánh giá chất lượng 2.3.6 Bào chế tiêu chuẩn hóa bột đơng khơ TTX 0,1% 2.3.6.1 Bào chế 2.3.6.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng 2.3.6.3 Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU VỀ NGUỒN CÁ NÓC TETRADONTIDAE CÓ CHỨA TETRODOTOXIN Trong khoảng thời gian 08.2011 đến 03.2012, kết hợp với Viện Hải dương học, Viện hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 10 lồi cá độc định hướng thu mẫu vùng biển Khánh Hòa Vũng Tàu, Việt Nam, định danh lưu tiêu bản, gồm có: (1) cá chuột vân bụng (A hispidus) (2) cá viền đen (A immaculatus) (3) cá chuột chấm (A stellatus) (4) cá mỏ chim (L inermis) (5) ) cá tro (L lunaris) (6) cá thu (L sceleratus) (7) cá vàng (L spadiceus) (8) cá vằn (T oblongus) (9) cá vằn mặt (T brevipinnis) Hình Tiêu 10 lồi cá độc (10) cá chấm cam (T gloerfelti) 3.2 NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH Ở MỘT SỐ LỒI CÁ NĨC (TETRAODONTIDAE) 3.2.1 Xác định nhanh độc tố phủ tạng số lồi cá Kết phân tích độc tính số phận (thịt, da, gan, ruột, trứng, tinh sào) 10 loài cá thu theo phương pháp sinh hố chuột Bảng Mức độ độc phủ tạng số loài cá T T 10 Mức độ độc* Thịt Gan Ruột Trứng Tinh sào Cá chuột vân bụng (A hispidus) + + ++ +++ + Cá chuột chấm (A stellatus) + + + +++ ++ Cá viền đen (A immaculatus) ++ + ++ +++ + Cá tro (L lunaris) + ++ ++ +++ ++ Cá thu (L sceleratus) + +++ ++ ++ + Cá vàng (L spadiceus) ++ + + Cá mỏ chim (L inermis) +++ ++ ++ + Cá vằn mặt (T brevipinnis) ++ +++ ++ ++ ++ Cá chấm cam (T gloerfelti) + + + Cá vằn (T oblongus) + + ++ +++ + (*) 0: không độc, I: độc nhẹ, II: độ mạnh, III: cực độc, -: khơng có liệu Tên lồi Từ kết trên, 10 lồi cá thu lồi cá độc Độc tính cá chủ yếu tập trung gan, trứng, tinh sào ruột 3.2.2 Xử lý mẫu, làm qua cột chiết pha rắn 3.2.2.1 Chiết SPE sử dụng cột C18 - Dịch A1.1 thu có màu vàng trong; đến cắn hòa lại 3mL acid acetic 0.5%/methanol dùng để chấm TLC định tính sắc ký lỏng khối phổ - Kết + Sắc ký lớp mỏng: sắc ký đồ dung dịch thử không thấy xuất vết có màu sắc vị trí (Rf) giống với màu sắc vị trí (Rf) vết TTX sắc ký đồ dung dịch chuẩn + Định tính sắc ký lỏng khối phổ, khơng thấy xuất mảnh khối đặc trưng m/z 320 TTX => Kết luận: sau chiết SPE qua cột C18, dịch A1.1 thu khơng chứa TTX 3.2.2.2 Chiết SPE sử dụng cột Evidex - Dịch A1.2 thu suốt, có màu vàng, màu nhạt màu dịch A1.1 Cơ dịch đến cắn, hồ tan lại 3mL acid acetic 0.5%/methanol dùng để chấm TLC định tính sắc ký lỏng khối phổ - Kết + Sắc ký lớp mỏng: sắc ký đồ dung dịch thử khơng thấy xuất vết có màu sắc vị trí (Rf) giống với màu sắc vị trí (Rf) vết TTX sắc ký đồ dung dịch chuẩn + Định tính sắc ký lỏng khối phổ, thấy xuất mảnh khối đặc trưng m/z = 320 TTX, với tín hiệu nhỏ => Kết luận: sau chiết SPE qua cột Evidex, dịch A1.2 thu khơng chứa TTX 3.2.2.3 Chiết SPE sử dụng cột SCX - Dịch A1.3 thu suốt, không màu Cô dịch đến cắn, hoà tan lại 3mL acid acetic 0.5%/methanol dùng để chấm TLC định tính sắc ký lỏng khối phổ - Kết quả: + Sắc ký lớp mỏng: sắc ký đồ dung dịch thử xuất vết có màu sắc vị trí (Rf) giống với màu sắc vị trí (Rf) vết TTX sắc ký đồ dung dịch chuẩn + Định tính sắc ký lỏng khối phổ, xuất mảnh khối đặc trưng m/z = 320 TTX - Định lượng TTX dịch chiết thu sắc ký lỏng khối phổ, tính độ thu hồi qua SPE Tiến hành tạo mẫu spike cách thêm 1,0 ml dung dịch chuẩn (10 g/ml, 25 g/ml, 50 g/ml) vào mẫu phủ tạng cá thu Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình, dịch chiết thu sau chiết qua SPE cắn, thêm xác 10,0 ml hỗn hợp đệm acetat – MeOH (20 – 80), siêu âm 10 phút, lọc dịch hoà tan qua màng lọc 0,45 m Tiêm dung dịch thử, dung dịch spike qua máy sắc ký lỏng khối phổ với chương trình sắc ký khảo sát: Cột: Alltech Apollo C8; 5µm; 250 x 4,6mm, pha động: đệm acetat – MeOH = 30 – 70, tốc độ dòng: 500µL/phút, thể tích tiêm: 10µL,điều kiện khối phổ: Nguồn: ESI, khí: SG: 20, AG: 10, ion hóa: 3200V, nhiệt hóa hơi: 200oC, nhiệt độ mao quản: 360oC, SRM: 320 → 162 với mức lượng CE = 32V Bảng Khảo sát độ thu hồi TTX qua cột chiết SCX Dung dịch chuẩn Sc g/ml 481830 2,5 g/ml 161527 g/ml 1108135 mc thêm (g) 10 10 10 25 25 25 50 50 50 Trung bình RSD St 115562 109863 112257 333544 348641 343039 819412 789027 798620 mTTX thu hồi (g) 7,15 6,80 6,95 17,31 18,09 17,80 36,97 35,60 36,03 % thu hồi 71,54 68,02 69,50 69,22 72,36 71,20 73,95 71,20 72,07 71,01 2,56 Phương pháp chiết SPE qua cột SCX có độ thu hồi 71,01% ổn định (RSD = 2,56) Với độ thu hồi này, đảm bảo giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp định lượng Như vậy, ta sử dụng phương pháp chiết, xử lý mẫu khảo sát để định tính, định lượng TTX cá phủ tạng cá 3.2.3 Định tính TTX sắc ký lớp mỏng 3.2.3.1 Khảo sát thuốc thử màu - Khi phun thuốc thử: KOH 10% - KOH 20% - KOH 30%, NaOH 10%, NaOH 20% với nhiệt độ sấy 900C 1000C, phút lại quan sát lần Tuy nhiên, sau 30 phút, khơng thấy có vệt sáng phát huỳnh quang thời điểm khảo sát Khi sấy nhiệt độ 1100C mỏng bị uốn cong, khơng có vết huỳnh quang phát sáng thời điểm khảo sát - Khi phun thuốc thử NaOH 30%: Với nhiệt độ sấy 900C: bắt đầu xuất vết huỳnh quang sau 15 phút, rõ thời điểm 25 phút, với nhiệt độ sấy 1000C: Vết huỳnh quang TTX rõ thời điểm 10 phút + Khi tăng nhiệt độ sấy lên 1100C vết huỳnh quang xuất thời điểm 10 phút, nhiên mỏng có tượng cháy 3.2.3.2 Khảo sát pha động chạy sắc ký Khảo sát hệ dung môi pha động chạy sắc ký + Pha động A: Hỗn hợp n-butanol, acid acetic khan nước (2:1:1) + Pha động B: Hỗn hợp pyridin, ethyl acetate, acid acetic nước (15:5:3:6) Hai hệ dung môi pha động phát TTX Dung dịch thử dung dịch chuẩn cho vết huỳnh quang phun thuốc thử màu, vị trí vết dung dịch thử dung dịch chuẩn tương ứng Đối với hệ dung môi pha động A, kết Rf ≈ 0,3; với hệ dung mơi pha động B kết Rf ≈ 0,6 – 0,7 Pha động B cho kết tốt hơn, xác giá trị Rf cao hơn; nhiên, pha động B có thành phần chủ đạo pyridin, chất độc, hạn chế sử dụng Vì vậy, sử dụng dung mơi pha động A để hạn chế độc hại Có thể khắc phục nhược điểm hệ pha động A cách tăng chiều dài mỏng kéo dài thời gian chạy sắc ký (A) (B) (C) Hình (A): Sắc ký đồ mỏng hệ pha động A: n-butanol, acid acetic khan nước (2:1:1); (B): Sắc ký đồ mỏng hệ pha động B: pyridin, ethyl acetate, acid acetic nước (15:5:3:6); (C): sắc ký đồ khảo sát LOD theo hệ pha động B Bảng Ký hiệu chất phân lập từ 05 lồi cá độc Loài A hispidus A immaculatus L inermis L lunaris Ký hiệu phân đoạn chất phân lập AHW1 AHW2 AIW1 AIW2 LIW1 LIW2 LLW1 LLW2 T oblongus TOW1 TOW2 TOW3 Kết phân tích NMR MS 11 chất phân lập được, nêu chi tiết mục xác định cấu trúc 3.3.3 Phân tích xác định cấu trúc độc tố phân lập từ loài cá Dữ liệu đo phổ NMR (1H-NMR, 13C-NMR) phổ khố phân giải cao (HR FTICR MS) 11 chất chiết ghi bảng, từ liệu phổ cho thấy có chất có phổ khác nhau, lại chất, có nhóm, nhóm có phổ giống nhóm có phổ giống Như vậy, thực tế thu chất, ký hiệu TTX1, TTX2, TTX3, TTX4, TTX5 TTX6 Bảng Dữ liệu phổ TTX chất phân lập C 4a 8a 10 11 C 4a 8a 10 11 TTX1 (AHW1, AIW1, LLW2,TOW1, LIW2) δH (mult,, J in Hz) δC 154,1 5,40 (1H, d, 9,5) 72,6 2,25 (1H, d, 9,5) 38,1 4,15 (1H, s) 71,3 68,9 3,98 (1H, s) 77,1 4,19 (1H, s) 70,2 57,2 3,85 (1H, s) 68,3 108,3 3,93 (2H, d, 11,0) 63,0 HR-ESI-MS: m/z 320,1087 [M + H]+ (calcd, for C11H18N3O8, 320,1094) TTX3 (TOW3) δH (mult,, J in Hz) 5,22 (1H, d, 9,4) 2,30 (1H, m) 2,01 and 1,25 (each 1H, m) 4,62 (1H, s) 4,43 (1H, s) 4,65 (1H, s) 3,51 (1H, d, 11,0) δC 156,4 77,6 42,5 29,7 77,0 82,6 71,3 61,4 72,7 176,6 67,0 15 TTX2 (AHW2, TOW2) δH (mult,, J in Hz) δC 156,1 5,47 (1H, d, 9,5) 74,8 2,02 (1H, overlap) 40,2 4,32 (1H, s) 74,9 72,3 4,10 (1H, s) 82,1 4,15 (1H, s) 73,1 59,2 4,02 (1H, s) 70,5 110,4 3,75 (2H, d, 11,0) 65,2 HR-ESI-MS: m/z 320,1087 [M + H]+ (calcd, for C11H18N3O8, 320,1094) TTX4 (AIW2) δH (mult,, J in Hz) 5,44 (1H, d, 9,5) 1,97 (1H, d, 9,5) 4,50 (1H, s) 1,88 (1H, m) 4,24 (1H, s) 4,05 (1H, s) 3,92 (1H, s) 3,99 (1H, dd, 11,0, 7,5), δC 156,5 74,9 46,1 71,5 43,2 78,5 76,2 60,6 71,0 110,4 62,0 3,72 (1H, d, 11,0) HR-ESI-MS: m/z 305,1211 [M + H]+ (calcd, for C11H19N3O7, 305,1217) 3,85 (1H, dd, 11,0, 7,0) HR-ESI-MS: m/z 304,1140 [M + H]+ (calcd, for C11H18N3O7, 304,1145) C TTX5 (LIW1) TTX6 (LLW1) 4a 8a 10 11 δH (mult,, J in Hz) δC 156,2 5,48 (1H, d, 9,5) 74,9 2,25 (1H, m) 40,4 4,10 (1H, s) 77,2 69,2 3,96 (1H, s) 83,5 4,27 (1H, s) 72,8 59,6 4,00 (1H, s) 70,6 110,4 1,68 (3H, br s) 25,8 HR-ESI-MS: m/z 304,1140 [M + H]+ (calcd, for C11H18N3O7, 304,1145) δH (mult,, J in Hz) δC 156,4 5,49 (1H, d, 9,5) 75,1 1,93 (1H, m) 45,9 4,25 (1H, s) 75,6 1,82 (1H, m) 35,4 4,12 (1H, s) 82,6 4,04 (1H, s) 76,3 60,0 3,96 (1H, s) 71,2 110,1 1,32 (1H, d, 6,5) 15,5 HR-ESI-MS: m/z 288,1189 [M + H]+ (calcd, for C11H18N3O6, 288,1196) Tiến hành giải phổ NMR thu để định danh chất thu Hợp chất TTX1 (thu từ phân đoạn AHW1, AIW1, LLW2,TOW1, LIW2) Phổ khối lượng phân giải cao HR ESI MS hợp chất TTX1 có pic ion [M + H]+ m/z = 320,1087 cho phép xác định hợp chất có khối lượng phân tử 319 cơng thức phân tử dự đốn C11H17N3O8 Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu doublet δ 2,25 (1H; d; J = 9,5 Hz; H-4a); 3,93 (2H; d; J = 11,0 Hz; H-11); 5,40 (1H; d; J = 9,5 Hz) với singlet δ 3,85 (1H; s; H-9); 3,88 (1H; s; H-7); 4,15 (1H; s; H-5); 4,19 (1H; s; H-8) Trên phổ 13C-NMR DEPT TTX1 cho thấy xuất 11 vạch tín hiệu gồm nhóm CH2 δC 63,0 (C-11); nhóm CH [δC 72,6 (C-4); 38,1 (C4a); 71,3 (C-5); 77,1 (C-7); 70,2 (C-8); 68,3 (C-9)] nhóm C bậc [δC 154,1 (C-1); 68,9 (C-6); 57,2 (C-8a); 108,3 (C-10)] Các phân tích phổ chiều HSQC cho phép gán tín hiệu proton carbon tương ứng (Bảng 3.16) Tương tác dị hạt nhân HMBC cho thấy H-4a (δ 2,25) với C-8a (δ 57,2), C-6 (68,9) C-4 (72,4); H-7 (δ 3,98), H-9 (δ 3,85) H-5 (δ 71,5) với C-10 (δ 108,3) Những kiện phổ cho thấy phù hợp với số liệu phổ công bố hợp chất tetrodotoxin (TTX) cơng bố trước Như hợp chất TTX1 xác định TTX, hợp chất có mặt phổ biến lồi cá độc Hợp chất TTX2 (thu từ phân đoạn chất AHW2 TOW2) Hợp chất TTX2 xác định có khối lượng phân tử 319 công thức phân tử C11H17N3O8 dựa vào phổ khối lượng phân giải cao với pic ion m/z 320,1092 [M + H]+ 16 Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu doublet δ 3,75 (2H, d, J = 11,0 Hz, H-11), 5,47 (1H, d, J = 9,5 Hz) với singlet δ 4,02 (1H, s, H-9), 4,10 (1H, s, H7), 4,32 (1H, s, H-5), 4,15 (1H, s, H-8) Trên phổ 13C-NMR TTX2 cho thấy xuất 11 vạch tín hiệu Các phân tích phổ chiều HSQC cho phép gán tín hiệu proton carbon tương ứng, từ xác định có mặt nhóm CH2 δC 65,2 (C-11), nhóm CH [δC 74,8 (C-4), 38,1 (C-4a), 74,9 (C-5), 82,1 (C-7), 73,1 (C-8), 70,5 (C9)] nhóm C bậc [δC 156,1 (C-1), 72,3 (C-6), 59,2 (C-8a), 110,4 (C10)] Số liệu phổ có tương đồng với số liệu phổ hợp chất TTX ngoại trừ khác biệt lớn vị trí vị trí C-5 đến C-8 cho phép dự đốn có khác cấu hình cấu trúc chất So sánh với số liệu công bố cho thấy số liệu phổ TTX2 hoàn toàn trùng khớp với hợp chất 6-epitetrodotoxin Như vậy, hợp chất TTX2 xác định 6-epitetrodotoxin Hợp chất TTX3 (thu từ phân đoạn chất TOW3) Phổ khối lượng HR ESI MS có pic ion m/z 305.1211 [M + H]+ cho phép xác định hợp chất có khối lượng phân tử 304 cơng thức phân tử C11H17N3O7 Phổ 1H-NMR TTX3 xuất tín hiệu doublet δ 3,51 3,72 (each 1H; d; J = 11,0 Hz; H-11); 5,22 (1H; d; J = 9,4 Hz) với singlet δ 4,65 (1H; s; H-9); 4,62 (1H; s; H-7); 4,43 (1H; s; H-8) Phổ 13C-NMR TTX3 có tín hiệu giống với phổ TTX2 ngoại trừ xuất tín hiệu δ 176,6 29,7 Phổ HSQC cho phép xác định tín hiệu 176,6 nhóm C bậc tín hiệu 29,7 CH2 Phổ HMBC cho thấy tương tác H-5 (δ 2,00 1,25) với C-8a (δ 61,4), C-11 (67,0) C-4 (77,6) chứng tỏ nhóm OH vị trí C-5 bị cấu trúc TTX3 so với TTX1 Như khẳng định hợp chất TTX3 5deoxyTetrodotoxin số liệu phổ thu hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu Yotsu-Yamashita [6] Đây lần hợp chất phân lập từ lồi cá Takifugu oblongus Hợp chất TTX4 (thu từ phân đoạn chất AIW2) Hợp chất TTX4 xác định có khối lượng phân tử 303 cơng thức phân tử C11H17N3O7 dựa vào phổ khối lượng phân giải cao với pic ion m/z 304,1140 [M+H]+ Phổ 1H- 13C-NMR AIW2 có tín hiệu tương đồng với phổ hợp chất TTX1 Trên phổ 1H-NMR xuất tín hiệu doublet δ 5,44 (1H, d, J = 9,5 Hz) với singlet δ 3,92 (1H, s, H-9), 4,05 (1H, s, H-8), 4,24 (1H, s, H-7), 4,50 (1H, s, H-5) Ngồi có tín hiệu vùng trường cao δ 1,88 1,97 Trên phổ 13C-NMR TTX4 cho thấy xuất 11 vạch tín hiệu Các phân tích phổ chiều HSQC cho phép gán tín hiệu proton carbon tương ứng, từ xác định xuất nhóm metin δ 43,2 thay nhóm C 17 bậc δ 68,9 hợp chất TTX4 Phân tích chi tiết phổ HMBC cho thấy có tương tác từ protn H-11 (δ 3,99 3,85) đến vị trí 43,2 Dữ kiện cho phép dự đốn nhóm OH vị trí C-6 bị đi, điều hoàn toàn phù hợp với số liệu phổ khối lượng có chênh lệch 16 đơn vị chất TTX4 TTX1 Như vậy, khẳng định hợp chất TTX4 6-deoxytetrodotoxin Hợp chất TTX5 (thu từ phân đoạn chất LIW1) Hợp chất TTX5 xác định có khối lượng phân tử 303 công thức phân tử C11H17N3O7 dựa vào phổ khối lượng phân giải cao với pic ion m/z 304,1140 [M+H]+ Phổ 1H- 13C-NMR TTX5 có tín hiệu tương đồng với phổ hợp chất TTX1 Trên phổ 1H-NMR xuất tín hiệu doublet δ 5,48 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-4) với singlet δ 3,96 (1H, s, H-7), 4,00 (1H, s, H-9), 4,10 (1H, s, H-5), 4,27 (1H, s, H-8) Ngồi xuất thêm tín hiệu nhóm CH3 δ 1,68 (3H, br s, H-11) Trên phổ 13C-NMR TTX5 cho thấy xuất 11 vạch tín hiệu Các phân tích phổ chiều HSQC cho phép gán tín hiệu proton carbon tương ứng, từ xác định xuất nhóm CH3 δ 25.8 thay nhóm CH2 δ 63.0 hợp chất TTX4 Dữ kiện cho phép dự đốn nhóm OH vị trí C-11 bị để tạo thành nhóm CH3, điều hồn tồn phù hợp với số liệu phổ khối lượng có chênh lệch 16 đơn vị chất TTX5 TTX1 Như kết luận LIW1 hợp chất 11-deoxytetrodotoxin Hợp chất TTX6 (thu từ phân đoạn chất LLW1) Phổ 1H- 13C-NMR TTX6 có tín hiệu đặc trưng lớp chất tetrodotoxin phân lập từ lồi cá Trên phổ 1H-NMR xuất tín hiệu doublet δ 5,48 (1H, d, J = 9,5 Hz) đặc trưng proton H-4, tín hiệu singlet δ 3,95 (1H, s, H-9), 4,04 (1H, s, H-8), 4,12 (1H, s, H-7), 4,25 (1H, s, H-5) Ngoài xuất thêm tín hiệu nhóm CH3 δ 1,32 (3H, br d, J = 6,5 Hz, H-11) Trên phổ 13C-NMR TTX6 cho thấy xuất 11 vạch tín hiệu phù hợp với cấu trúc lớp chất dẫn xuất tetrodotoxin Các phân tích phổ chiều HSQC cho phép gán tín hiệu proton carbon tương ứng, từ xác định xuất nhóm metin δ 35,4 thay nhóm C bậc δ 68,9 hợp chất TTX1 Điều gợi ý hợp chất bị nhóm OH vị trí C-6 giống trường hợp hợp chất 6-deoxytetrodotoxin (TTX4) Ngoài xuất nhóm CH3 δ 15,6 thay nhóm CH2 δ 63,0 hợp chất TTX1 Dữ kiện cho phép dự đốn nhóm OH vị trí C-11 bị để tạo thành nhóm CH3 tương tự trường hợp hợp chất 11-deoxytetrodotoxin (TTX5) Các phân tích phổ hai chiều HMBC khẳng định vị trí nhóm OH C-6 C-11 Những liệu phổ NMR cho thấy hợp chất TTX6 dẫn xuất dideoxy hố tetrodotoxin, điều hồn tồn phù hợp với số liệu phổ khối lượng 18 có chênh lệch 23 đơn vị chất TTX6 tetrodotoxin TTX6 xác định có khối lượng phân tử 287 công thức phân tử C11H18N3O6 dựa vào phổ khối lượng phân giải cao với pic ion m/z 288,1189 [M + H]+ Như vậy, khẳng định hợp chất TTX6 6,11-dideoxyTTX Như vậy, qua giải phổ, từ phân đoạn V2 05 lồi cá độc: (1) Arothron hispidus (cá chuột vân bụng), (2) Arothron immaculatus (cá viền đen), (3) Lagocephalus inermis (cá mỏ chim), (4) Lagocephalus lunaris (cá tro), (5) Takifugu oblongus (cá vằn), phân lập hợp chất Phân tích phổ NMR HR ESI MS xác định hợp chất phân lập tetrodotoxin (TTX) TTXs: 6-epitetrodotoxin, 5-deoxytetrodotoxin, 6deoxytetrodotoxin, 11-deoxytetrodotoxin 6,11-dideoxytetrodo-toxin Bảng Các chất độc tetrodotoxin tương tự tetrodotoxin phân lập từ phủ tạng số lồi cá độc TT TTX1 PĐ chất AHW1 AIW1 LLW2 TOW1 LIW2 Tên chất Công thức, M, Tetrodotoxin C11H17N3O8, M: 319,1 TTX2 AHW2 TOW2 6-epiTTX C11H17N3O8, M: 319,1 TTX3 TOW3 5-deoxyTTX C11H17N3O7, M: 303,1 TTX4 AIW2 6-deoxyTTX C11H17N3O7 M: 303,1 TTX5 LIW1 11deoxyTTX Cấu trúc C11H17N3O7 M: 303,1 19 TTX6 LLW1 6,11dideoxyTTX C11H17N3O6 M: 287,1 3.4 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TTX Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN 3.4.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập TTX thơ Hình Quy trình chiết xuất TTX TTX thơ chiết xuất qua giai đoạn phải có hàm lượng ≥ 80% Nếu sản phẩm không đạt hàm lượng theo yêu cầu, cần phải tiến hành sơ tinh chế 20 Hình Quy trình sơ tinh chế Từ 10 kg phủ tạng cá tươi, với quy trình chiết xuất, thu từ 35 mg đến 55 mg TTX thô (hàm lượng TTX ≥ 80 %) Bảng Lượng TTX thu độ tinh khiết đạt STT 01 02 03 Khối lượng phủ tạng (kg) Mẻ 1: 10,3 Mẻ 2: 10,8 Mẻ 3: 10,6 TB: 10,56 Lượng TTX thu (mg) Mẻ 1: 47,13 Mẻ 2: 35,55 Mẻ 3: 55,17 Tổng Lô NC1: 137,85 mg Hàm lượng TTX (%) Mẻ 1: 83,27 Mẻ 2: 81,19 Mẻ 3: 84,44 Hiệu suất (µg TTX/g phủ tạng tươi) Mẻ 1: 4,6 Mẻ 2: 3,3 Mẻ 3: 5,2 TB: 82,97 TB: 4,36 Do nguyên liệu phủ tạng cá trộn lẫn từ nhiều loại cá, khơng làm đồng mẫu, hàm lượng TTX thay đổi theo cá thể, loài phận (ruột, gan, trứng), nên có khác đáng kể lượng TTX thu qua mẻ khảo sát Đây nghiên cứu bước đầu, không định lượng hàm lượng TTX mẫu trước chiết sấy khô mẫu để tính kết theo lượng mẫu sấy khơ Tuy nhiên, quy mô pilot thực thu lượng TTX đủ lớn có độ tinh khiết xác định cách xác Việt Nam Trong nghiên cứu này, sử dụng hệ thống xay ngâm chiết phủ tạng cá với quy mơ thiết kế tới 20 kg/mẻ, có khả chiết tối đa TTX Quá trình sắc ký 21 trao đổi ion loại tạp than hoạt thu TTX thô với hàm lượng TTX cao (≥ 80 %) 3.4.2 Tinh chế TTX sắc ký lỏng điều chế TTX thô tinh chế sắc ký lỏng điều chế Chương trình sắc ký tinh chế TTX từ sản phẩm TTX thô: Cột sắc ký bán điều chế: ODS (HIQ Sil, 250 x 21,2 mm, 5µm 10 µm); Pha động: Dung dịch natri heptansulfonat 0,01 M; Tốc độ dòng: ml/phút; Thể tích tiêm: 200 µl, Detector UV: bước sóng 201 nm Tiến hành - TTX thơ hòa tan dung dịch acid acetic % nồng độ khoảng 20 mg/ml Tiêm lần 200 µl, thu phân đoạn pic TTX tinh khiết - Gộp tất phân đoạn TTX thu cô quay áp suất giảm Làm lạnh dịch, thêm dung dịch amoiac đậm đặc để kết tinh TTX, lọc tủa kết tinh, rửa tủa kết tinh nước khử ion đến hết phản ứng Na+ (dùng đũa thủy tinh, đốt dịch rửa lửa) - Hòa tan lại tủa TTX dung dịch acid acetic 1%, trung hòa dung dịch dung dịch ammoniac 10 % đến pH kiềm, tiếp tục làm lạnh để kết tinh TTX - Rửa tủa kết tinh nước khử ion vài lần sấy tủa tủ sấy áp suất giảm thu tinh thể TTX tinh khiết Sử dụng sắc ký lỏng điều chế thu 93,49 mg tinh thể TTX Kết phân tích cho thấy TTX sau tinh chế sắc ký điều chế pha đảo cột ODS cho hàm lượng tinh khiết cao Hàm lượng mẫu nguyên liệu TTX sản phẩm đề tài định lượng 98,27 % với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 0,69% Kết định lượng TTX ghi bảng Bảng1 Kết định lượng TTX mẫu sau tinh chế Stt Lượng cân mẫu thử (mg) 2,48 2,49 2,51 Trung bình RSD (%) Diện tích pic 466937 473893 478755 Kết định lượng (%) 97,49 98,55 98,77 98,27 0,69 Sử dụng sắc ký lỏng điều chế thu 93,49 mg tinh thể TTX Phổ NMR chất sau tinh chế phù hợp với liệu phổ TTX nghiên cứu Kết hoàn toàn phù hợp với kết đo phổ khối phân giải cao (HR ESI) hợp chất sau tinh chế, cho mảnh phổ [M+H]+ 320,10926, tương ứng với công thức [C11H17N3O8 + H]+ tetrodotoxin 22 Varian MS File: D:\Quang-2009\VHH\NXCuong-HCTN\2012\Cuong_TTX.trans Base-Peak Amplitude: 55.2220 Total Intensity: 92.557 Scans: Positive Ions 320.10926 100 Elemental Composition Search Report: Target Mass: Target m/z = 320.10926 ± 5.00ppm Charge = +1 Possible Elements: Element: Exact Mass: C 12.000000 H 1.007825 O 15.994915 N 14.003074 80 Min: 0 0 Max: 100 150 100 100 Additional Search Restrictions: Seven Golden Rules Nitrogen Rule DBE Limit Mode = Both Integer and Half-Integer -Minimum DBE = -Maximum DBE = 100 60 Search Results: Number of Hits = m/z 320.10884 320.11018 40 Delta m/z (ppm) 1.30 -2.87 DBE 4.5 9.5 Formula C11H18N3O8+1 C12H14N7O4+1 302.09857 20 160.05517 160 180 200 220 240 260 Mass/Charge 280 300 320 340 Hình Phổ khối phân giải cao (HR ESI MS) hợp chất TTX tinh chế Kết phân tích cho thấy TTX sau tinh chế sắc ký điều chế pha đảo cột ODS cho độ tinh khiết cao Hàm lượng mẫu nguyên liệu TTX định lượng 98,27 % với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 0,69% 3.5 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA NGUYÊN LIỆU TETRODOTOXIN Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở nguyên liệu tetrodotoxin với tiêu: TT Chỉ tiêu Hình thức Định tính Độ khối lượng làm khô Định lượng Yêu cầu Bột kết tinh hay tinh thể màu trắng gần trắng Phải thể phép thử định tính TTX Không 0,5 % Hàm lượng TTX sản phẩm phải khơng 95% 3.6 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN TETRODOTOXIN 3.6.1 Nghiên cứu độ ổn định tetrodotoxin số dung môi TTX hoà tan số dung dịch đệm (methanol, đệm citrat pH 4-5, dung dịch acid acetic loãng 2%, đệm phosphat pH 4-5, đệm acetat pH 4-5) với hàm lượng 0,1 mg/ml, đóng lọ ml, bảo quản điều kiện nhiệt độ -20oC  2oC tủ bảo quản đông Định kỳ đánh giá chất lượng, đánh giá thời 23 - - điểm 0, 3, tháng (tháng 6/2014, tháng 9/2014 tháng 12/2014) Các tiêu theo dõi: Cảm quan: Tất lô, thời điểm khảo sát đạt tiêu cảm quan Các dung dịch suốt, khơng màu Định tính: Tất lô, thời điểm khảo sát thể tốt phép thử định tính Trên sắc ký đồ dung dịch thử phần định lượng cho píc có thời gian lưu, phổ MS giống với thời gian lưu, phổ khối MS píc TTX sắc ký đồ dung dịch chuẩn Định lượng: hàm lượng TTX dung dịch đệm, thời điểm khảo sát khác có biến đổi Bảng Hàm lượng TTX số dung môi theo thời gian TT TTX dung dịch MeOH Đệm citrat pH - Đệm acetat pH - Đệm phosphat pH - Dung dịch acid acetic 2% tháng 100,1 99,9 100,2 100,2 100,2 Hàm lượng TTX (%) tháng 99,5 99,8 98,3 98,7 99,5 tháng 97,4 99,5 97,2 96,9 97,1 Từ kết nghiên cứu tháng, ta thấy TTX dung dịch đệm citrat pH – có giảm nồng độ (0,4%/6 tháng) Như vậy, lựa chọn đệm citrat có pH – làm dung môi pha dung dịch chuẩn TTX 3.6.2 Nghiên cứu quy trình đóng ống chuẩn, 100 µg chất/lọ ml, sử dụng dung mơi thích hợp Xây dựng quy trình đóng ống chuẩn quy định chất độc, sử dụng thiết bị Glove - Box Labonco Thời điểm đóng gói: tháng 12/2014 Điều kiện mơi trường thời điểm đóng gói: nhiệt độ 20oC, độ ẩm tương đối 48% Số lượng nguyên liệu: 10,17 mg Số ống chuẩn đóng được: 100 ống Hàm lượng TTX trung bình ống đánh giá đồng lô: 99,89% 3.6.3 Kiểm tra đánh giá chất lượng ống chuẩn 3.6.3.1 Đánh giá đồng lơ q trình đóng gói u cầu: Lơ sản xuất coi đồng giá trị RSD kết hàm lượng ống kiểm tra ≤ 0,5%  điều kiện đóng gói ổn định Tiến hành: - Lấy ngẫu nhiên 10 ống đề kiểm tra đồng q trình đóng gói tiêu hàm lượng - Áp dụng phương pháp định lượng Tiêu chuẩn ống chuẩn TTX để tiến hành xác định hàm lượng 24 Kết quả: Bảng Kết đánh giá đồng lô Số thứ tự ống HL (%) so với nhãn Trung bình (%) RSD (%) 01 15 26 34 47 55 68 77 88 99 99,67 99,73 99,86 100,12 99,91 99,68 100,09 99,97 99,66 100,03 99,87 0,18 Kết luận: RSD = 0,18% < 0,5 %  Lô bán TP đồng hàm lượng 3.6.3.2 Đánh giá liên phòng thí nghiệm chất chuẩn (2 phòng thí nghiệm) - Áp dụng phương pháp định lượng Tiêu chuẩn chất lượng ống chuẩn TTX - Mỗi PTN nhận chất chuẩn gốc 06 ống chuẩn bán thành phẩm Bảng Kết đánh giá liên phòng Yêu cầu Hàm lượng TTX phải từ 99,5 % đến 100,5% so lượng ghi nhãn 10 TB RSD PTN (HL %) PTN (HL %) 99,67 99,73 99,86 100,12 99,91 99,68 100,09 99,97 99,66 100,03 99,87 0,18 % 99,72 100,08 100,01 99,89 100,04 99,76 99,92 0,15 % Bảng Kết đánh giá theo ANOVA Nhóm Số KQ TĨM TẮT Tổng Trung bình Phương sai PTN 10 998,72 99,87 0,0320 PTN 599,5 99,92 0,0229 ANOVA Bậc tự Bình phương trung bình Ftn F tc 0,0075 0,260 4,600 0,4025 14 0,0287 0,4100 15 Nguồn sai số Tổng số bình phương Giữa nhóm 0,0075 Trong nhóm Tổng cộng Nhận xét: Ftn < Ftc  Kết trung bình phòng thử nghiệm giống nhau, phương pháp phân tích có độ tái lặp độ lặp lại tốt 25 3.6.3.3 Hoàn thiện hồ sơ chuẩn, xác định giá trị ấn định ghi nhãn chứng phân tích Bảng Tập hợp kết hai PTN TT Xi (%) 99,66 99,67 99,68 99,72 99,73 99,76 99,86 99,89 Trung bình RSD TT 10 11 12 13 14 15 16 Xi (%) 99,91 99,97 100,01 100,03 100,04 100,08 100,09 100,12 99,89 0,17 % Nhận xét: Hàm lượng trung bình: 99,9 % so với hàm lượng nhãn, độ không đảm bảo đo mở rộng U = ± 0,09 % với hệ số phủ k= độ tin cậy 95% Tất kết thu PTN nằm khoảng 99,5 % đến 100,5 % so với hàm lượng nhãn kết ghi nhãn chứng là: Chất chuẩn tetrodotoxin SKS: TTX.DTDL.2015 1,0 ml dung dịch chứa 0,1 mg tetrodotoxin (C11H17N3O8) đệm citrate pH 4,8 3.7 BÀO CHẾ BỘT ĐÔNG KHÔ TETRODOTOXIN 0,1 MG/G 3.7.1 Bào chế bột đông khô Công thức bào chế cho lọ bột đông khô TTX thô (hàm lượng TTX ≥ 80 %)……tương ứng với… mg TTX Dung dịch lactose 20% (kl/tt) …………………………… … mL Đệm citrate …………………………………vừa đủ…………10 mL Pha chế TTX thô lô NC02 có hàm lượng 81,19% thu theo quy trình chiết xuất để làm nguyên liệu bào chế bột đông khơ Cân 24,6 mg TTX thơ vào bình định mức 200 ml, thêm dung 50 ml dịch đệm citrat pH 4-5 để hòa tan Thêm xác 100 ml dung dịch lactose 20% (kl/tt), lắc kỹ, thêm dung dịch đệm citrat vừa đủ, lắc Hút 10 ml dung dịch vào 20 lọ thủy tinh nâu dung tích 10 ml, đem đơng khơ Chương trình đơng khơ: - Nhiệt độ đông lạnh -30oC; - Thời gian đông lạnh 90 phút; - Thời gian đông khô 22 giờ; - Nhiệt sấy khô từ: -25oC đến 0oC; - Nhiệt độ condensor – 60oC; - Áp suất 0,1 mbar; - Thời gian sấy khô 19 giờ; - Nhiệt sấy khô từ: 4oC đến 27oC 26 3.7.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở kiểm nghiệm sản phẩm Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho bột đông khô TTX 0,1 % với tiêu Bảng Tóm tắt tiêu chất lượng TCCS bột đông khô 0,1% TT Chỉ tiêu Hình thức Định tính Mất khối lượng làm khô Định lượng Yêu cầu Bột xốp, màu trắng trắng ngà Phải thể phép thử định tính TTX ≤ 1,5 % Hàm lượng TTX chế phẩm phải đạt từ 0,09 đến 0,11% Áp dụng tiêu chuẩn, đánh giá chất lượng lọ bột nồng độ bào chế được: Hàm lượng TTX trung bình đạt 0,103% 3.7.3 Đánh giá độc tính cấp bán trường diễn bột đông khô 0,1% 3.7.3.1 Độc tính cấp LD50 = 344,20 ± 36,01 mg/ kg chuột 3.7.3.2 Độc tính bán trường diễn Sau cho thỏ uống bô ̣t nồ ng đô ̣ liên tục 28 ngày với mức liều 1,5 mg/kg thỏ/ngày 4,5/kg thỏ/ngày, chúng tơi nhận thấy khơng có khác sinh hóa huyết học nhóm chứng nhóm thử Tồn thỏ thí nghiệm nhóm chứng tăng cân đều, nhóm thử khơng tăng trọng lượng so với nhóm chứng khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Quan sát đại thể, không nhận thấy khác hình dạng bên ngồi, màu sắc tổ chức tim, gan, thận, phổi hệ tiêu hóa thỏ nhóm chứng nhóm thử sau thí nghiệm Quan sát vi thể cho thấy mơ gan thận nhóm chứng bình thường, có tổn thương mơ gan hai nhóm thử sau thí nghiệm KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau trình thực hiện, mục tiêu luận án hoàn thành, với kết cụ thể sau: - Sàng lọc phát TTX số lồi cá nóc: + Thu thập, định danh tiêu 10 lồi cá độc, gồm: (1) cá chuột vân bụng (Arothron hispidus), (2) cá chuột chấm (Arothron stellatus), (3) cá tro (Lagocephalus lunaris), (4) cá vằn mặt (Torquigener brevipinnis), (5) cá thu (Lagocephalus sceleratus), (6) cá viền đen (Arothron immaculatus), (7) cá chấm cam (Torquigener gloerfelti), (8) cá vàng (Lagocephalus spadiceus), (9) cá mỏ chim (Lagocephalus inermis) (10) cá vằn (Takifugu oblongus) Tất 10 lồi thuộc họ cá Tetraodontidae + Tiến hành sàng lọc nhanh độc tố số phận (thịt, gan, ruột, trứng, tinh sào) loài cá này, cho thấy 10 loài cá cá độc, độc tố chủ yếu tập trung gan, trứng, tinh sào ruột Trong đó, định lượng xác hàm lượng TTX gan, trứng lồi cá chuột vân bụng 27 (Arothron hispidus), cá tro (Lagocephalus lunaris) cá vằn (Takifugu oblongus) Kết cho thấy hàm lượng TTX loài khác khác nhau, phận chứa hàm lượng TTX nhau, hàm lượng TTXs trứng cao - Chiết xuất phân lập xác định cấu trúc số độc tố thần kinh khác + Phân lập hợp chất tương tự TTX (tetrodotoxin analogues, kí hiệu TTXs): 5-deoxytetrodotoxin, 6-epitetrodotoxin, 6-deoxytetrodotoxin, 11deoxytetrodotoxin 6,11-dideoxytetrodotoxin Các hợp chất lần phân lập từ lồi cá thu Việt Nam, góp phần vào nghiên cứu độc tố TTX + Xây dựng phổ liệu định danh TTX dẫn chất, bao gồm phổ khối, phổ khối phân giải cao phổ cộng hưởng từ hạt nhân - Xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin có độ tinh khiết phù hợp để làm chất chuẩn bước đầu bào chế bột đông khô định hướng sử dụng y học + Đã tinh chế tổng lượng 93,49 mg TTX tinh khiết đạt hàm lượng 98,27% + Làm chủ công nghệ/kỹ thuật chiết xuất tinh chế TTX có độ tinh khiết cao, lần Việt Nam thiết lập chất chuẩn TTX phục vụ kiểm nghiệm nghiên cứu, góp phần cho hướng nghiên cứu ứng dụng TTX y học + Xây dựng phổ liệu định danh TTX gồm phổ khối, phổ khối phân giải cao phổ cộng hưởng từ hạt nhân + Đã đưa định hướng sử dụng y học: * Đã thiết lập 100 lọ chuẩn TTX nồng độ 0,1 mg/ml, đóng lọ thuỷ tinh nâu chứa dung dịch đệm citrat pH 4,8 theo dõi độ ổn định trước đóng lọ * Đã chiết xuất, phân lập bột TTX thơ có hàm lượng > 80%  * Bào chế thử nghiệm bột đơng khơ có chứa 0,1% TTX, xây dựng tiêu chuẩn sở, đánh giá chất lượng, độc tính bột Từ bột ứng dụng tiếp làm nguyên liệu bào chế thuốc chế phẩm có chứa TTX ĐỀ XUẤT - Ứng dựng chất chuẩn TTX thiết lập để phục vụ công tác kiểm nghiệm, kiểm tra đánh giá chế phẩm có chứa TTX hay tiếp tục phục vụ công tác nghiên cứu khác TTX TTXs - Tiếp tục nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu TTX mg/lọ dạng đông khô - Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng bột đông khô TTX 0,1 % hay dạng nguyên liệu bán thành phẩm khác để bào chế thuốc giảm đau hỗ trợ điều trị cai nghiện - Khai thác hợp lý nguồn lợi cá biển Việt Nam 28 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Tran Viet Hung, Phung Minh Dung, Tran Minh Ngoc, Duong Minh Tan, Pham Thanh Binh, Nguyen Hoai Nam, Nguyen Tien Dat (2014) Tetrodotoxin Constituents in the Vietnamese Sea Pufferfish Takifugu oblongus The International Journal of Science & Technoledge Vol (Issue 13, December 2014), page 145 - 147 Trần Việt Hùng, Dương Minh Tân, Phùng Minh Dũng, Nguyễn Tiến Vững (2015) Định lượng nguyên liệu tetrodotoxin phân lập từ lồi họ cá (Tetraodontidae) sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS/MS) Tạp chí Dược học, số 466, tháng năm 2015, trang 57 – 61 TrầnViệt Hùng, Phùng Minh Dũng , Nguyễn Hoài Nam, NguyễnTiến Đạt, Dương Minh Tân, Trần Minh Ngọc, Nguyễn Tiến Vững, Đào Việt Hà (2015) Một số kết nghiên cứu bước đầu thành phần hóa học độc tố tetrodotoxin từ lồi cá vằn (Takifugu oblongus) Việt Nam Tạp chí Dược học, số 467, tháng năm 2015, trang 48 – 54 TrầnViệt Hùng, Dương Minh Tân, Phùng Minh Dũng, Nguyễn Hoài Nam, Nguyễn Tiến Đạt, Trần Minh Ngọc, Nguyễn Tiến Vững Nghiên cứu chiết tinh chế độc tố tetrodotoxin từ phủ tạng số lồi cá độc (Tetraodontidae) vùng biển Việt Nam Tạp chí Dược học, số 468, tháng năm 2015, trang 21 – 27 Chu Thị Như Quỳnh, Dương Minh Tân, Trần Việt Hùng, Phùng Minh Dũng, Nguyễn Tiến Vững, Nguyễn Mạnh Tuyển (2015) Nghiên cứu định tính, định lượng tetrodotoxin bột đơng khô tetrodotoxin 0,1 % phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Tạp chí Dược học, số 475, tháng 11 năm2015, trang 49-53 ... Nghiên cứu phát xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin số độc tố thần kinh khác từ cá nóc thực nhằm mục tiêu: - Sàng lọc phát tetrodotoxin số lồi cá - Phân lập, xác định cấu trúc số độc tố. .. (cá viền đen),  Lagocephalus inermis (cá mỏ chim),  Lagocephalus lunaris (cá tro),  Takifugu oblongus (cá vằn) 3.3.2 Xây dựng quy trình phân lập tetrodotoxin số độc tố thần kinh từ số lồi cá. .. cam (T gloerfelti) 3.2 NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ THẦN KINH Ở MỘT SỐ LỒI CÁ NĨC (TETRAODONTIDAE) 3.2.1 Xác định nhanh độc tố phủ tạng số lồi cá Kết phân tích độc tính số phận (thịt, da, gan,