ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Trần Thị Phƣơng NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI Aspergillus BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Trần Thị Phƣơng NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI Aspergillus BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trần Văn Tuấn TS Trần Đức Long Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn Thạc sĩ mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Trần Văn Tuấn - Bộ mơn Vi sinh vật học, Trƣởng Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, ngƣời tận tình bảo, hƣớng dẫn tạo điều kiện tốt cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Trần Đức Long nhiệt tình góp ý, cố vấn cho em suốt trình học tập làm luận văn tốt nghiệp Em vô biết ơn thầy cô Bộ môn Di truyền học Khoa Sinh học – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình bảo, truyền đạt kiến thức quý báu giúp đỡ em trình học tập Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo thành viên Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất mơi trƣờng làm việc để em hồn thành tốt nghiên cứu Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn tới học viên cao học Đỗ Thị Bình Xuân Lộc nhiệt tình giúp đỡ em q trình thực thí nghiệm Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè em, anh chị Phòng Genomic khích lệ, giúp đỡ em suốt q trình học tập sống Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 08 năm 2017 Học viên Trần Thị Phƣơng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5-FOA - fluoroorotic acid A awamori Aspergillus awamori A nidulans Aspergillus nidulans A niger Aspergillus niger A oryzae Aspergillus oryzae A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATMT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (biến nạp trung gian/nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) bp base pair CD Czapek Dox DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GRAS Generally Recognized As Safe (đƣợc công nhận an tồn) HEPES 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid IM Induction medium (mơi trƣờng cảm ứng) kb kilo base pairs LB Left border (biên trái)/ Luria Bertani (môi trƣờng LB) NST Nhiễm sắc thể OD Optical Density (mật độ quang) ORF Open reading frame (khung đọc mở) PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar PEG Polyethylen Glycol PSM Phytase-screening medium (môi trƣờng sàng lọc sinh phytase) RB Right border (biên phải) SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA T-DNA Transfer DNA Ti plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid cảm ứng tạo khối u) ura Uracil uri Uridine Vir Virulence region (vùng độc lực) WT Wild-type (chủng tự nhiên) MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm sợi 1.1.1 Đặc điểm sinh học 1.1.2 Vai trò nấm sợi 1.1.3 Giới thiệu chung chi nấm sợi Aspergillus .5 1.2 Giới thiệu chung Aspergillus oryzae 1.2.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm sợi A oryzae .6 1.2.2 Đặc điểm di truyền nấm sợi A oryzae 1.2.3 Vai trò nấm sợi A oryzae 1.3 Giới thiệu chung A niger 10 1.3.1 Phân loại đặc điểm sinh học nấm sợi A niger 10 1.3.2 Đặc điểm di truyền nấm sợi A niger 12 1.3.3 Vai trò nấm sợi A niger 12 1.4 Các phƣơng pháp chuyển gen vào nấm sợi 14 1.4.1 Chuyển gen xung điện (electroporation) 14 1.4.2 Chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast) 15 1.4.3 Phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 15 1.5 Hệ thống marker dùng cho chuyển gen nấm sợi 25 1.5.1 Hệ thống marker chọn lọc thể chuyển gen .25 1.5.2 Hệ thống marker thị dùng chuyển gen 28 1.6 Promoter biểu gen nấm sợi 30 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 33 2.1 Nguyên liệu .33 2.1.1 Chủng vi sinh vật 33 2.1.2 Thiết bị hóa chất 34 2.1.3 Các môi trƣờng sử dụng nghiên cứu .36 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 38 2.2.1 Thu bào tử nấm .39 2.2.2 Tách chiết DNAtổng số 39 2.2.3 Thành phần phản ứng PCR 40 2.2.4 Xử lý enzyme giới hạn .41 2.2.5 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 43 2.2.6 Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens .44 2.2.7 Sàng lọc thể chuyển gen 46 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Lựa chọn chủng nấm dùng cho chuyển gen 48 3.1.1 Chủng nấm A niger N402đƣợc lựa chọn để xóa gen .48 3.1.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm A oryzae VS1 RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil 49 3.2 Tạo thành công chủng N402 đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil .50 3.2.1 Tạo cấu trúc xóa gen pyrG .51 3.2.2 Xóa thành cơng gen pyrG A niger N402 52 3.3 Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil 58 3.3.1 Tạo vector pEX2A 58 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ uridine/ uracil đến phục hồi sinh trƣởng chủng xóa gen pyrG 59 3.3.3 Tối ƣu quy trình chuyển gen vào A niger N402 trợ dƣỡng uridine/uracil 61 3.3.4 Đánh giá hiệu chuyển gen huỳnh quang DsRed vào A niger N402 trợ dƣỡng 64 3.4 Biểu gen DsRed A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng vector pEX2A 65 3.4.1 Mức độ tƣơng đồng gen pyrG chi Aspergillus .65 3.4.2 Biểu gen DsRed nấm sợi A oryzae .66 3.5 Biểu gen huỳnh quang DsRed dƣới kiểm soát promoter glaA từ A niger .72 3.5.1 Tạo vector pEX2C 72 3.5.2 Biểu gen DsRed dƣới kiểm sốt promoter glaA thơng qua vector pEX2C .73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 Kết luận 79 Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật vector dùng nghiên cứu 33 Bảng 2.2 Các cặp mồi dùng cho nghiên cứu 35 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái số loài nấm mốc đĩa petri Hình 1.2 Hình thái cấu trúc hiển vi A oryzae Hình 1.3 Hình thái khuẩn lạc cấu trúc hiển vi nấm A niger 11 Hình 1.4 Cấu trúc Ti plasmid 17 Hình 1.5 Mơ hình vi khuẩn A tumefaciens với hệ thống vector nhị thể 20 Hình 1.6 Biểu gen huỳnh quang GFP nấm sợi A oryzae 29 Hình 1.7 Biểu gen DsRed chủng nấm sợi A oryzae AUT1-PlD 30 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm A niger 47 Hình 3.2 Hình thái cấu trúc hiển vi chủng A oryzae VS1 48 RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil Hình 3.3 Tạo cấu trúc xóa gen pyrG nấm Aspergillus niger 51 Hình 3.4 Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc AGL1 biến nạp vector xóa 52 pyrG A1, A2, A3 Hình 3.5 Quy trình xóa gen pyrG nấm sợi A niger sử dụng phƣơng 53 pháp ATMT Hình 3.6 Kết xóa gen môi trƣờng chọn lọc CD bổ sung 0,1% 53 uridine, 0,1% uracil 0,2% 5-FOA Hình 3.7 Kiểm tra khả sinh trƣởng chủng đột biến mơi trƣờng khác 54 hai lồi nấm sợi A niger A oryzae Đây lần đầu tiên, gen DsRed dƣới điều khiển promoter glaA từ A niger đƣợc biểu thành công A oryzae A niger phƣơng pháp ATMT Kết lần chứng minh khả hoạt động promoter glaA loài khác chi Aspergillus Gen thị huỳnh quang đỏ DsRed vector tạo đƣợc nghiên cứu đƣợc thay gen mã hóa cho enzyme protein mong muốn nhằm tăng cƣờng biểu gen dƣới điều khiển promoter glaA Thêm vào kết chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium sử dụng vector pEX2C mang marker pyrG A oryzae cho kết ấn tƣợng với chủng A niger N402 (570 thể chuyển gen/106 bào tử) chủng A oryzae VS1 (70 thể chuyển gen/106 bào tử) Nghiên cứu lần khẳng định khả hoạt động chéo gen pyrG số loài gần gũi chi Aspergillus Việc sử dụng marker pyrG A oryzae làm marker trợ dƣỡng chuyển gen vào nấm sợi A niger vi khuẩn A tumefaciens hoàn toàn khả thi 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã tạo đƣợc chủng A niger trợ dƣỡng uridine/uracil cách xóa gen pyrG để sử dụng cho nghiên cứu chuyển gen vào lồi nấm mà khơng sử dụng gen kháng kháng sinh Đã tạo thành công vector nhị thể chứa marker chọn lọc gen pyrG dùng cho chuyển gen vào chủng A niger A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil gồm: vector xóa gen pyrG, vector biểu gen huỳnh qunag đỏ DsRed với marker gen pyrG A niger, vector biểu gen huỳnh quang đỏ với marker trợ dƣỡng pyrG A oryzae promoter glaA A niger Các vector hoạt động tốt chuyển vào chủng A niger N402, A oryzae VS1 A oryzae RIB40 trợ dƣỡng uridine/uracil Đã xây dựng đƣợc quy trình tối ƣu cho chuyển gen vào nấm sợi A niger sử dụng vi khuẩn A tumefaciens marker trợ dƣỡng pyrG Đã chứng minh đƣợc việc sử dụng chéo gen pyrG A oryzae làm marker trợ dƣỡng cho chuyển gen vào A niger, ngƣợc lại, sử dụng gen pyrG A niger làm marker trợ dƣỡng chuyển gen vào A oryzae thông qua việc biểu thành công gen mã hóa protein huỳnh quang DsRed Đã chứng minh đƣợc đoạn promoter glaA kích thƣớc 600 bp A niger có khả hoạt động tốt A oryzae thông qua việc biểu gen huỳnh quang đỏ DsRed Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu biểu số enzyme/protein tái tổ hợp chủng A niger trợ dƣỡng uridine/uracil sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Xuân Dung, Nguyễn Việt Khoa, Nguyễn Văn Tính, Trần Nguyễn Nhật Khoa, Lâm Thị Kim Chung (2012), "Tối ƣu hóa mơi trƣờng ni cấy Aspergillus niger để tăng hiệu suất sản sinh phytase", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 24: pp 222-232 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), "Vi sinh vật học" Nhà xuất Giáo dục Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phƣơng Liên, Nông Văn Hải (2011), "Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(1): pp 1-18 Nguyễn Đức Thành, Lê Hoàng Đức (2014), "Nhân dòng gen vùng promoter ubiquitin từ ngơ (Zae Mays L)", Tạp chí Sinh học 35(3se): pp 114-121 Nguyễn Văn Thành, Trần Thị Yến Minh (2013), "Ứng dụng vi sinh vật enzymer protease để cải thiện chất lƣợng nƣớc tƣơng lên men truyền thống.", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 26: pp 205-212 Tài liệu tiếng Anh Acharya P., Acharya D., Modi H (2008), "Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate", African Journal of Biotechnology 7(22) Alam J., Cook J L (1990), "Reporter genes: application to the study of mammalian gene transcription", Analytical biochemistry 188(2): pp 245254 Aluko R., McIntosh T (2005), "Limited enzymatic proteolysis increases the level of incorporation of canola proteins into mayonnaise", Innovative Food Science & Emerging Technologies 6(2): pp 195-202 Archer D B., Peberdy J F (1997), "The molecular biology of secreted enzyme production by fungi", Critical Reviews in Biotechnology 17(4): pp 273-306 80 10 Arora D K (1991), Handbook of Applied Mycology: Volume 1: Soil and Plants, CRC Press 11 Baird G S., Zacharias D A., Tsien R Y (2000), "Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral", Proceedings of the National Academy of Sciences 97(22): pp 11984-11989 12 Beijersbergen, Alida Godelieve Maria Bundock, Paul Gouka, Robertus Johannes, De Groot, Marcellus Johannes Augustinus, Hooykaas, Jacob P J., Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus Aspergillus 2001, Google Patents 13 Beijersbergen A G M., Bundock P., Gouka R J., De Groot M J A., Hooykaas P J J., Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus Aspergillus 2001, Google Patents 14 Bennett J W (2010), An overview of the genus Aspergillus, Caiser Academic Press, Portland 15 Bennett J W., Klich M A (1992), Aspergillus: Biology and industrial applications, Butterworth-Heinemann Boston 16 Bos C J (1986), "Induced mutation and somatic recombination as tools for genetic analysis and breeding of imperfect fungi" 17 Breakspear A., Langford K J., Momany M., Assinder S J (2007), "CopA: GFP localizes to putative Golgi equivalents in Aspergillus nidulans", FEMS microbiology letters 277(1): pp 90-97 18 Casselton L., Zolan M (2002), "The art and design of genetic screens: filamentous fungi", Nature Reviews Genetics 3(9): pp 683-697 19 Chakraborty B., Kapoor M (1990), "Transformation of filamentous fungi by electroporation", Nucleic acids research 18(22): pp 6737 20 Chang P.-K., Ehrlich K C (2010), "What does genetic diversity of Aspergillus flavus tell us about Aspergillus oryzae?", International Journal of Food Microbiology 138(3): pp 189-199 81 21 de Boer, Paulo Bronkhof, Jurian Dukiќ, Karolina Kerkman, Richard Touw, Hesselien van den Berg, Marco Offringa, Remko (2013), "Efficient gene targeting in Penicillium chrysogenum using novel Agrobacterium-mediated transformation approaches", Fungal Genetics and Biology 61: pp 9-14 22 De Groot M J., Bundock P., Hooykaas P., Beijersbergen A (1998), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi", Nature Biotechnology 16 23 Deacon J W (2013), Fungal biology, John Wiley & Sons 24 Debets A J., Holub E F., Swart K., Broek H W., Bos C J (1990), "An electrophoretic karyotype of Aspergillus niger", Molecular and General Genetics MGG 224(2): pp 264-268 25 Elleuche S., Pöggeler S (2009), "Visualization of peroxisomes via SKL-tagged DsRed protein in Sordaria macrospora", Bikarbonat-Stoffwechsel bei filamentösen Ascomyceten: pp 26 Fincham J (1989), "Transformation in fungi", Microbiological Reviews 53(1): pp 148-170 27 Finkelstein D B (1987), "Improvement of enzyme production in Aspergillus", Antonie Van Leeuwenhoek 53(5): pp 349-352 28 Fowler T., Berka R M., Ward M (1990), "Regulation of the glaA gene of Aspergillus niger", Current genetics 18(6): pp 537-545 29 Ganzlin M., Rinas U (2008), "In-depth analysis of the Aspergillus niger glucoamylase (glaA) promoter performance using high-throughput screening and controlled bioreactor cultivation techniques", Journal of Biotechnology 135(3): pp 266-271 30 Geiser D., Klich M., Frisvad J C., Peterson S., Varga J., Samson R A (2007), "The current status of species recognition and identification in Aspergillus", Studies in Mycology 59: pp 1-10 82 31 Gelvin S B (2003), "Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “gene-jockeying” tool", Microbiology and molecular biology reviews 67(1): pp 16-37 32 Goosen T., van Engelenburg F., Debets F., Swart K., Bos K., van den Broek H (1989), "Tryptophan auxotrophic mutants in Aspergillus niger: inactivation of the trpC gene by cotransformation mutagenesis", Molecular and General Genetics MGG 219(1-2): pp 282-288 33 Gordon C L., Khalaj V., Ram A F., Archer D B., Brookman J L., Trinci A P., Jeenes D J., Doonan J H., Wells B., Punt P J (2000), "Glucoamylase:: green fluorescent protein fusions to monitor protein secretion in Aspergillus niger", Microbiology 146(2): pp 415-426 34 Gouka R., Punt P., Van Den Hondel C (1997), "Efficient production of secreted proteins by Aspergillus: progress, limitations and prospects", Applied microbiology and biotechnology 47(1): pp 1-11 35 Gow N A., Gadd G M (2007), Growing fungus, Springer Science & Business Media 36 Grant S G., Jessee J., Bloom F R., Hanahan D (1990), "Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylationrestriction mutants", Proceedings of the National Academy of Sciences 87(12): pp 4645-4649 37 Hanif M (2004), "Characterization of small GTPase Cdc42 from the ectomycorrhizal fungus Suillus bovinus and Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of fungi" 38 Hartingsveldt W., Mattern I E., Zeijl C M., Pouwels P H., Hondel C A (1987), "Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene", Molecular and General Genetics MGG 206(1): pp 71-75 39 He L., Feng J., Lu S., Chen Z., Chen C., He Y., Yi X., Xi L (2016), "Genetic Transformation of Fungi", International Journal of Developmental Biology 83 40 Hoekema A., Hirsch P., Hooykaas P., Schilperoort R (1983), "A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid" 41 Hong S.-B., Hong S.-Y., Jo K.-H., Kim Y.-S., Do J.-H., Do J.-Y., Noh S.-B., Yoon H.-H., Chung S.-H (2015), "Taxonomic Characterization and Safety of Nuruk Molds Used Industrially in Korea", The Korean Journal of Mycology 43(3): pp 149-157 42 Houbraken J., Frisvad J C., Samson R A (2011), "Fleming's penicillin producing strain is not Penicillium chrysogenum but P rubens", IMA fungus 2(1): pp 87-95 43 Imanaka H., Tanaka S., Feng B., Imamura K., Nakanishi K (2010), "Cultivation characteristics and gene expression profiles of Aspergillus oryzae by membrane-surface liquid culture, shaking-flask culture, and agar-plate culture", Journal of Bioscience and Bioengineering 109(3): pp 267-273 44 Janus D., Hoff B., Hofmann E., Kück U (2007), "An efficient fungal RNAsilencing system using the DsRed reporter gene", Applied and Environmental Microbiology 73(3): pp 962-970 45 Jørgensen T R., Nielsen K F., Arentshorst M., Park J., van den Hondel C A., Frisvad J C., Ram A F (2011), "Submerged conidiation and product formation by Aspergillus niger at low specific growth rates are affected in aerial developmental mutants", Applied and Environmental Microbiology 77(15): pp 5270-5277 46 Kanamasa S., Yamaoka K., Kawaguchi T., SUMITANI J.-i., ARAI M (2003), "Transformation of Aspergillus aculeatus using the drug resistance gene of Aspergillus oryzae and the pyrG gene of Aspergillus nidulans", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 67(12): pp 2661-2663 47 Kandušer M., Miklavčič D., Electroporation in biological cell and tissue: an overview, in Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials 2009, Springer p 1-37 84 48 Khalaj V., Azizi M., Enayati S., Khorasanizadeh D., Ardakani E M (2012), "NCE102 homologue in Aspergillus fumigatus is required for normal sporulation, not hyphal growth or pathogenesis", FEMS Microbiology letters 329(2): pp 138-145 49 Kitamoto K (2015), "Cell biology of the Koji mold Aspergillus oryzae", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 79(6): pp 863-869 50 Kitamoto K (2002), "Molecular biology of the Koji molds", Advances in applied Microbiology 51: pp 129-154 51 Kochupurakkal B S., Iglehart J D (2013), "Nourseothricin N-acetyl transferase: a positive selection marker for mammalian cells", PloS one 8(7): pp e68509 52 Koo J., Kim Y., Kim J., Yeom M., Lee I C., Nam H G (2007), "A GUS/luciferase fusion reporter for plant gene trapping and for assay of promoter activity with luciferin-dependent control of the reporter protein stability", Plant and cell physiology 48(8): pp 1121-1131 53 Kredics L., Varga J., Antal Z., Samson R A., Kocsubé S., Narendran V., Bhaskar M., Manoharan C., Vágvölgyi C., Manikandan P (2008), "Black aspergilli in tropical infections", Reviews in Medical Microbiology 19(3): pp 65-78 54 Krügel H., Fiedler G., Smith C., Baumberg S (1993), "Sequence and transcriptional analysis of the nourseothricin acetyltransferase-encoding gene nat1 from Streptomyces noursei", Gene 127(1): pp 127-131 55 Lazo G R., Stein P A., Ludwig R A (1991), "A DNA transformation– competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium", Nature Biotechnology 9(10): pp 963-967 56 Leal Jr S M., Cowden S., Hsia Y.-C., Ghannoum M A., Momany M., Pearlman E (2010), "Distinct roles for Dectin-1 and TLR4 in the pathogenesis of Aspergillus fumigatus keratitis", PLoS Pathog 6(7): pp e1000976 85 57 Lee L.-Y., Gelvin S B (2008), "T-DNA binary vectors and systems", Plant Physiology 146(2): pp 325-332 58 Lin K., Wang A (2001), "UV mutagenesis in Escherichia coli K-12: Cell survival and mutation frequency of the chromosomal genes lacZ, rpoB, ompF, and ampA", J Exp Microbiol Immunol 1: pp 32-46 59 Liu Z., Friesen T L (2012), "Polyethylene glycol (PEG)-mediated transformation in filamentous fungal pathogens", Plant Fungal Pathogens: Methods and Protocols: pp 365-375 60 Lorang J., Tuori R., Martinez J., Sawyer T., Redman R., Rollins J., Wolpert T., Johnson K., Rodriguez R., Dickman M (2001), "Green fluorescent protein is lighting up fungal biology", Applied and Environmental Microbiology 67(5): pp 1987-1994 61 Lu X., Sun J., Nimtz M., Wissing J., Zeng A.-P., Rinas U (2010), "The intraand extracellular proteome of Aspergillus niger growing on defined medium with xylose or maltose as carbon substrate", Microbial Cell Factories 9(1): pp 23 62 Machida M., Asai K., Sano M., Tanaka T., Kumagai T., Terai G., Kusumoto K.I., Arima T., Akita O., Kashiwagi Y (2005), "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Nature 438(7071): pp 1157-1161 63 Machida M., Yamada O., Gomi K (2008), "Genomics of Aspergillus oryzae: learning from the history of Koji mold and exploration of its future", DNA research 15(4): pp 173-183 64 Maeda K., Kosaka H., Yagishita K., Umezawa H (1956), "A new antibiotic, phleomycin", The Journal of antibiotics 9(2): pp 82-85 65 Mathur J., Koncz C (1998), "PEG-mediated protoplast transformation with naked DNA", Arabidopsis Protocols: pp 267-276 66 Mattern I E., Unkles S., Kinghorn J R., Pouwels P H., Hondel C A (1987), "Transformation of Aspergillus oryzae using the A niger pyrG gene", Molecular and General Genetics MGG 210(3): pp 460-461 86 67 McClenny N (2005), "Laboratory detection and identification of Aspergillus species by microscopic observation and culture: the traditional approach", Medical Mycology 43(sup1): pp 125-128 68 Michielse C., Ram A., Hooykaas P., Van den Hondel C (2004), "Role of bacterial virulence proteins in Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus awamori", Fungal Genetics and Biology 41(5): pp 571-578 69 Michielse C B., Hooykaas P J., Van Den Hondel C A., Ram A F (2008), "Agrobacterium-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus awamori", Nature protocols 3(10): pp 1671-1678 70 Michielse C B., Hooykaas P J., van den Hondel C A., Ram A F (2005), "Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi", Current Genetics 48(1): pp 1-17 71 Mikkelsen L., Sarrocco S., Lübeck M., Jensen D F (2003), "Expression of the red fluorescent protein DsRed-Express in filamentous ascomycete fungi", FEMS Microbiology Letters 223(1): pp 135-139 72 Mohammadhassan R., Kashefi B., Delcheh K S (2014), "Agrobacterium-based vectors: a review" 73 Moore M M (2009), "Genetic engineering of fungal cells", Biotechnology, Fundamentals in Biotechnology 3: pp 36-66 74 Mullins E D., Chen X., Romaine P., Raina R., Geiser D., Kang S (2001), "Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer", Phytopathology 91(2): pp 173-180 75 Murphy M., Wilson Y M., Butler C., Genetic Marker Mice and Their Use in Understanding Learning and Memory, in Functional Brain Mapping and the Endeavor to Understand the Working Brain 2013, InTech 76 Nahalkova J., Fatehi J (2003), "Red fluorescent protein (DsRed2) as a novel reporter in Fusarium oxysporum f sp lycopersici", FEMS Microbiology letters 225(2): pp 305-309 87 77 Nguyen K T., Ho Q N., Do L T B X., Mai L T D., Pham D.-N., Tran H T T., Le D H., Nguyen H Q., Tran V.-T (2017), "A new and efficient approach for construction of uridine/uracil auxotrophic mutants in the filamentous fungus Aspergillus oryzae using Agrobacterium tumefaciensmediated transformation", World Journal of Microbiology and Biotechnology 33(6): pp 107 78 Nguyen K T., Ho Q N., Pham T H., Phan T.-N., Tran V.-T (2016), "The construction and use of versatile binary vectors carrying pyrG auxotrophic marker and fluorescent reporter genes for Agrobacterium-mediated transformation of Aspergillus oryzae", World Journal of Microbiology and Biotechnology 32(12): pp 204 79 Nielsen M L., De Jongh W A., Meijer S L., Nielsen J., Mortensen U H (2007), "Transient marker system for iterative gene targeting of a prototrophic fungus", Applied and environmental microbiology 73(22): pp 7240-7245 80 Nyilasi I., Ács K., Papp T., Nagy E., Vágvölgyi C (2005), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Mucor circinelloides", Folia microbiologica 50(5): pp 415-420 81 Özyiğit İ İ., Agrobacterium tumefaciens and its use in plant Biotechnology, in Crop Production for Agricultural Improvement 2012, Springer p 317-361 82 Pel H J., de Winde J H., Archer D B., Dyer P S., Hofmann G., Schaap P J., Turner G., de Vries R P., Albang R., Albermann K (2007), "Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88", Nature Biotechnology 25(2): pp 221-231 83 PlTTENGBR R., WOLFE E., Hoehn M., MARKS P N., Daily W., McGuire J (1953), "Hygromycin I Preliminary studies on the production and biologic activity of a new antibiotic", Antibiotics & Chemotherapy 3(12): pp 126878 84 Polaina J., MacCabe A P (2007), Industrial enzymes, Springer 88 85 Prendergast F G., Mann K G (1978), "Chemical and physical properties of aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea", Biochemistry 17(17): pp 3448-3453 86 Punt P J., van den Hondel C A (1992), " Transformation of filamentous fungi based on hygromycin b and phleomycin resistance markers", Methods in enzymology 216: pp 447-457 87 Rokas A., Payne G., Fedorova N., Baker S., Machida M., Yu J., Georgianna D R., Dean R A., Bhatnagar D., Cleveland T (2007), "What can comparative genomics tell us about species concepts in the genus Aspergillus?", Studies in Mycology 59: pp 11-17 88 Ruijter G., Kubicek C., Visser J., Production of organic acids by fungi, in Industrial Applications 2002, Springer p 213-230 89 Ruiter-Jacobs Y M., Broekhuijsen M., Unkles S E., Campbell E I., Kinghorn J R., Contreras R., Pouwels P H., Hondell C A (1989), "A gene transfer system based on the homologous pyrG gene and efficient expression of bacterial genes in Aspergillus oryzae", Current Genetics 16(3): pp 159-163 90 Ruiz‐Díez B (2002), "Strategies for the transformation of filamentous fungi", Journal of applied Microbiology 92(2): pp 189-195 91 Sambrook J., Fritsch E F., Maniatis T (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, Cold spring harbor laboratory press 92 Samson R A., Hong S., Peterson S., Frisvad J C., Varga J (2007), "Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Fumigati and its teleomorph Neosartorya", Studies in Mycology 59: pp 147-203 93 Schuster E., Dunn-Coleman N., Frisvad J., Van Dijck P (2002), "On the safety of Aspergillus niger–a review", Applied Microbiology and Biotechnology 59(4-5): pp 426-435 94 Sharan R (2007), "Analysis of Biological Networks: Transcriptional NetworksPromoter Sequence Analysis", Lecture 11: pp 1-15 89 95 Siedenberg D., Mestric S., Ganzlin M., Schmidt M., Punt P J., van den Hondel C A., Rinas U (1999), "GlaA Promoter Controlled Production of a Mutant Green Fluorescent Protein (S65T) by Recombinant Aspergillus niger during Growth on Defined Medium in Batch and Fed‐Batch Cultures", Biotechnology progress 15(1): pp 43-50 96 Sugui J A., Chang Y C., Kwon-Chung K (2005), "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Aspergillus fumigatus: an efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption", Applied and Environmental Microbiology 71(4): pp 1798-1802 97 Suzuki S., Tada S., Fukuoka M., Taketani H., Tsukakoshi Y., Matsushita M., Oda K., Kusumoto K.-I., Kashiwagi Y., Sugiyama M (2009), "A novel transformation system using a bleomycin resistance marker with chemosensitizers for Aspergillus oryzae", Biochemical and biophysical research communications 383(1): pp 42-47 98 Te Biesebeke R., Record E., Van Biezen N., Heerikhuisen M., Franken A., Punt P., Van Den Hondel C (2005), "Branching mutants of Aspergillus oryzae with improved amylase and protease production on solid substrates", Applied Microbiology and Biotechnology 69(1): pp 44 99 Utermark J., Karlovsky P., Genetic transformation of filamentous fungi by Agrobacterium tumefaciens Protocol Exchange 2008 100 Varga J., Frisvad J C., Samson R (2011), "Two new aflatoxin producing species, and an overview of Aspergillus section Flavi", Studies in Mycology 69: pp 57-80 101 Wasylnka J A., Moore M M (2002), "Uptake of Aspergillus fumigatus conidia by phagocytic and nonphagocytic cells in vitro: quantitation using strains expressing green fluorescent protein", Infection and Immunity 70(6): pp 3156-3163 102 Wyss M., Pasamontes L., Rémy R., Kohler J., Kusznir E., Gadient M., Müller F., van Loon A P (1998), "Comparison of the Thermostability Properties of 90 Three Acid Phosphatases from Molds: Aspergillus fumigatusPhytase, A niger Phytase, and A nigerpH 2.5 Acid Phosphatase", Applied and environmental microbiology 64(11): pp 4446-4451 103 Xu C., Zhang X., Qian Y., Chen X., Liu R., Zeng G., Zhao H., Fang W (2014), "A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii", PloS one 9(9): pp e107657 104 Xu Y (1990), "Advances in the soy sauce industry in China", Journal of fermentation and Bioengineering 70(6): pp 434-439 105 Zhong Y., Yu H., Wang X., Lu Y., Wang T (2011), "Towards a novel efficient T-DNA-based mutagenesis and screening system using green fluorescent protein as a vital reporter in the industrially important fungus Trichoderma reesei", Molecular Biology reports 38(6): pp 4145-4151 106 Zhu L., Maruyama J.-i., Kitamoto K (2013), "Further enhanced production of heterologous proteins by double-gene disruption (ΔAosedD ΔAovps10) in a hyper-producing mutant of Aspergillus oryzae", Applied Microbiology and Biotechnology 97(14): pp 6347-6357 107 Zupan J., Muth T R., Draper O., Zambryski P (2000), "The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights", The Plant Journal 23(1): pp 11-28 91 PHỤ LỤC Các cơng trình cơng bố có liên quan đến luận văn Hồ Ngọc Quỳnh, Nguyễn Thị Khuyến, Trần Thị Phƣơng, Trần Văn Tuấn, 2017, "Biểu gen mã hóa protein huỳnh quang GFP DsRed chủng nấm sợi Aspergillus oryzae VS1 sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens" Tạp chí Sinh học, 31(2), pp 212-222 92 ... Trần Thị Phƣơng NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ VECTOR NHỊ THỂ DÙNG CHO CHUYỂN GENE Ở NẤM SỢI Aspergillus BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN... dụng vi khuẩn A tumefaciens marker trợ dƣỡng, thực đề tài: Nghiên cứu tạo số vector nhị thể dùng cho chuyển gene nấm sợi Aspergillus vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với nội dung nhƣ sau: - Tạo. .. giới hạn .41 2.2.5 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 43 2.2.6 Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens .44 2.2.7 Sàng lọc thể chuyển gen 46 Chƣơng KẾT QUẢ