BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI CỒ THỊ OANH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME QUERCETIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI CỒ THỊ OANH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME QUERCETIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Thu Giang NCS Nguyễn Hồng Trang HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu Giang NCS Nguyễn Hồng Trang hết lòng bảo, giúp đỡ trực tiếp hƣớng dẫn thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ toàn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Bào chế, thầy giáo trƣờng, phòng ban, thƣ viện - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian thực đề tài Mặc dù có nhiều cố gắng nhƣng hạn chế thời gian, kiến thức nhƣ tài liệu tham khảo nên luận văn tránh khỏi sai sót, khiếm khuyết nội dung hình thức, tơi mong nhận đƣợc góp ý thầy để luận văn đƣợc hồn thiện Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ động viên suốt trình học tập nghiên cứu vừa qua Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2017 Học viên Cồ Thị Oanh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan quercetin 1.1.1 Công thức cấu tạo Quercetin 1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.3 Tác dụng dƣợc lý 1.1.4 Dƣợc động học 1.1.5 Tác dụng 1.1.6 Tác dụng không mong muốn 1.1.7 Liều dùng 1.1.8 Một số chế phẩm chứa quercetin thị trƣờng 1.2 Phytosome 1.2.1 Khái niệm phytosome 1.2.2 Thành phần cấu tạo phytosome 1.2.3 Độ ổn định phytosome 1.2.4 Ƣu nhƣợc điểm 1.2.5 Phƣơng pháp bào chế phytosome 1.2.6 Đánh giá số đặc tính phytosome 1.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa 12 1.3.1 Hoạt tính trung hòa gốc tự DPPH 12 1.3.2 Xác định khả ức chế peroxid hóa lipid 13 1.4 Một số nghiên cứu phytosome 14 1.4.1 Nghiên cứu giới 14 1.4.2 Nghiên cứu Việt Nam 15 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung mơi, thiết bị 19 2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi 19 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Bào chế phytosome phƣơng pháp kết tủa dung môi 20 2.3.2 Định lƣợng quercetin 21 2.3.3 Xác định hệ số phân bố dầu nƣớc (log P) 21 2.3.4 Đánh giá số đặc tính phytosome 22 2.3.5 Đánh giá hiệu suất phytosome hóa 23 2.3.6 Nghiên cứu độ ổn định 24 2.3.7 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 24 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Nghiên cứu cải thiện độ ổn định vật lý hỗn dịch phytosome quercetin 28 3.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng thông số kỹ thuật bào chế phytosome quercetin đến đặc tính vật lý phytosome 28 3.1.2 Khảo sát ảnh hƣởng thành phần cơng thức đến đặc tính phytosome 30 3.1.3 Đánh giá phytosome quercetin bào chế 33 3.2 Nâng qui mô bào chế 38 3.3 Quy trình bào chế 42 3.4 Nghiên cứu độ ổn định phytosome quercetin 44 3.5 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa 49 3.5.1 Hoạt tính trung hòa gốc tự DPPH 49 3.5.2 Khả ức chế peroxy hoá lipid 50 Chƣơng BÀN LUẬN 52 4.1 Về xây dựng công thức quy trình bào chế phytosome quercetin 52 4.1.1 Về công thức bào chế 52 4.1.2 Về dung môi kết tủa 52 4.1.3 Về quy trình bào chế 52 4.2 Về phƣơng pháp chứng minh phức hợp 52 4.2.1 Phƣơng pháp chụp ảnh qua kính hiển vi điện tử 53 4.2.2 Phƣơng pháp phổ IR 53 4.2.4 Phƣơng pháp phân tích nhiệt vi sai DSC 53 4.2.5 Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR 53 4.3 Về hệ số phân bố dầu nƣớc 54 4.4 Về nâng cấp quy mô bào chế 54 4.5 Về độ ổn định hỗn dịch phytosome quercetin 54 4.6 Về bƣớc đầu đánh giá hiệu chống oxy hóa phytosome quercetin 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu HC Hoạt chất DSC Phân tích nhiệt quét vi sai 13 H-NMR Từ/cụm từ Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hydro đồng vị 1H C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hydro đồng vị 13C HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HSPC PC NaCMC Natri carboxylmethyl cellulose HPMC Hydroxy propyl methyl cellulose 10 EE Hiệu suất phytosome hóa (entrapment efficiency) 11 IR Phổ hồng ngoại 12 KTTP 13 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 14 SEM Kính hiển vi điện tử quét 15 TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua 16 XRD Phổ nhiễu xạ tia X 17 DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 18 DĐVN Dƣợc điển Việt Nam 19 NSX 20 tt Thể tích 21 kl Khối lƣợng Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen (Hydrogenated Soy Phosphatidylcholin) Phosphatidyl cholin Kích thƣớc tiểu phân Nhà sản xuất hóa DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU STT Bảng 2.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Tên bảng Nguyên liệu Đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với tỉ lệ thể tích pha ethanol/pha nƣớc khác Đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với phƣơng pháp phối hợp pha ethanol vào pha nƣớc khác Trang 19 28 29 Đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với tốc độ khuấy trộn pha nƣớc khác Hiệu suất phytosome hóa đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với tỉ lệ mol CH/HSPC khác 30 31 Độ ổn định hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với tỉ lệ mol CH/HSPC khác 31 Đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với số chất ổn định khác 32 Bảng 3.7 Đặc tính hỗn dịch hiệu suất phytosome hóa 34 Bảng 3.8 Log P quercetin với thời gian khuấy trộn pha khác 34 Bảng 3.9 Log P quercetin phytosome quercetin 35 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Số sóng nhóm -OH quercetin, cholesterol; nhóm (RO)2PO2-N+(CH3)3 HSPC Đặc tính hỗn dịch hiệu suất phytosome hóa Đánh giá ảnh hƣởng thể tích mơi trƣờng kết tủa đến đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin Đánh giá ảnh hƣởng tốc độ khuấy trộn đến đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin Đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế với thời gian siêu âm khác Hiệu suất phytosome hóa đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin bào chế theo quy trình 3.9 36 39 39 41 42 44 Bảng 3.16 Hiệu suất phytosome hóa đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin 45 Bảng 3.17 Khả trung hòa gốc tự DPPH 49 Bảng 3.18 Khả ức chế peroxy hóa lipid 50 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị STT Trang Hình 1.1 Cơng thức hóa học Quercetin Hình 1.2 Cấu trúc phytosome Hình 1.3 Cấu trúc phân tử phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Phổ IR (A) phospholipid, (B) Quercetin, (C) Quercetinphospolipid Phổ DSC a) phospholipid, b)silybin, c)phức hợp silybin-PC, c) hỗn hợp silybin-PC Phổ nhiễu xạ tia X: A) Quercetin, B)phức hợp quercetinphospholipid, C) phospolipid 11 12 Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo dạng chuyển hóa DPPH 25 Hình 2.2 Cơ chế tạo màu MDA 26 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình ảnh chụp SEM quercetin phytosome quercetin kết tủa dung dịch NaCMC Kết phổ IR quercetin, HSPC, hỗn hợp vật lý phytosome 33 36 Hình 3.3 Phổ 1H-NMR đoạn từ 8–13ppm quercetin phức hợp 37 Hình 3.4 Phổ nhiễu xạ tia X quercetin phytosome quercetin 37 Hình 3.5 Hình 3.6 Phổ phân tích nhiệt quét vi sai quercetin, HSPC, cholesterol, phytosome Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tốc độ khuấy trộn lên đặc tính hỗn dịch phytosome quercetin 38 40 Hình PL 1.5: phổ IR phytosome quercetin Hình PL 2.1: Phổ 1H-NMR phytosome quercetin Hình PL 2.2: Phổ 1H-NMR quercetin Hình PL 3: Phổ nhiễu xạ tia X phần cắn đáy phần phía sau ly tâm hỗn dịch phytosome quercetin Hình PL 4.1: Sắc ký đồ quercetin pha dầu Hình PL 4.2: Sắc ký đồcủa quercetin pha nước Phụ lục 5.1: Thẩm định phƣơng pháp trung hòa gốc tự DPPH Lựa chọn tiêu cần thẩm định, yêu cầu phƣơng pháp đánh giá Các tiêu cần thẩm định bao gồm: Độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, khoảng xác định, độ đúng, độ lặp lại Chỉ tiêu thẩm định Độ thích hợp hệ thống Cách xác định/ đánh giá Giới hạn chấp nhận Giá trị RSD độ hấp thụ dung RSDA ≤ 2,0% (n = 6) dịch chuẩn DPPH Dựa vào phổ hấp thụ UV độ Mẫu thử không cho độ hấp thụ Độ đặc hiệu Độ tuyến tính Khoảng xác định hấp thụ mẫu thử, mẫu bƣớc sóng 517 nm Nếu có chuẩn DPPH ảnh hƣởng phải ≤ 1,0% Hệ số tƣơng quan r ≥ 0,995 Hệ số góc đƣờng hồi quy Kết thực nghiệm Hệ số chắn (intercept) Kết thực nghiệm Dựa vào kết thử độ Kết thực nghiệm Xác định tỷ lệ lƣợng DPPH tìm lại Độ (tỷ lệ thu hồi/hồi phục) đƣợc so với lƣợng thêm vào biết mẫu thử Xác định độ mức nồng độ khác 94,4% – 99,40% RSD ≤ 2,0% Độ lặp lại Xác định giá trị RSD kết định lƣợng RSD ≤ 2,0% (n = 6) Báo cáo kết thẩm định 2.1 Nguyên liệu: Quercetin dihydrat, Phytosome quercetin, Ascorbic acid (China), DPPH (Sigma, USA), Methanol (Merk) * Thiết bị phân tích: - Cân phân tích Mettler AB 204 - Máy quang phổ Shimadzu UV-2600 2.2 Kết thẩm định 2.2.1 Độ đặc hiệu Thực nghiệm: - Mẫu thử: Phytosome quercetin, quercetin, vitamin C Tiến hành pha lỗng mẫu để thu đƣợc mẫu có nồng độ 100 µg/ml - Mẫu chuẩn: Cân 10 mg DPPH chuẩn vào bình định mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ thể tích đƣợc dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 100 µg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc tiến hành pha lỗng thành dung dịch DPPH có nồng độ từ đến 60 µg/ml nhƣ phần độ tuyến tính - Mẫu trắng nƣớc khử ion - Đo độ hấp thụ dung dịch thử dung dịch chuẩn Kết quả: Bảng 1: Kết mức độ ảnh hƣởng mẫu thử Mẫu Phytosome quercetin Quercetin Vitamin C STT Độ hấp thụ mẫu thử Độ hấp thụ mẫu chuẩn nồng độ 50 µg/ml 0,0008 0,0009 0,0010 0,0009 0,0009 0,0008 0,0012 0,0010 0,0015 0,7367 Nhƣ mẫu phytosome quercetin, quercetin, vitamin C nồng độ cao phép thử (100 µg/ml) cho độ hấp thụ khơng đáng kể bƣớc sóng 517 nm Do khơng ảnh hƣởng đến phép thử Kết luận: Phƣơng pháp đạt yêu cầu độ đặc hiệu 2.2.2 Độ thích hợp hệ thống * Thực nghiệm: Đo độ hấp thụ 06 lần mẫu chuẩn nồng độ 50 µg/ml Ghi lại độ hấp thụ lần đo * Kết quả: Bảng 2: Độ hấp thụ mẫu chuẩn TT TB RSD (%) Độ hấp thụ 0,7367 0,7366 0,7368 0,7368 0,7367 0,7367 0,7367 0,01 (< 2,0%) 2.2.3 Độ tuyến tính * Thực nghiệm: Pha dãy dung dịch chuẩn DPPH có nồng độ từ – 60 µg/ml Hệ số tƣơng quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,998 * Kết quả: Khảo sát tƣơng quan y (độ hấp thụ) x (nồng độ) phƣơng pháp bình phƣơng cực tiểu, kết cho thấy: Hệ số r2 = 0,9981 (→ r = 0,9990), chứng tỏ có tuyến tính nồng độ độ hấp thụ (Bảng 3, hình 1) Bảng 3: Sự tƣơng quan nồng độ độ hấp thụ DPPH STT Mẫu Lƣợng cân chuẩn (mg) µg/ml 10 µg/ml 20 µg/ml 10,12 30 µg/ml 40 µg/ml 50 µg/ml 60 µg/ml Hệ số tƣơng quan: 0,9990 Hệ số góc: 0,0142 Hệ số chắn (intercept): 0,0027 % Y: 0,63 (< 2,0%) Độ pha lo ng 100×100/5 100×50/5 100×25/5 100×50/15 100×25/10 100×50/25 100×25/15 Nồng độ DPPH (µg/ml) 5,06 10,12 20,24 30,36 40,48 50,60 60,72 Độ hấp thụ (Abs) 0,0762 0,1456 0,2842 0,4235 0,5634 0,7394 0,8425 0.9 y = 0,0142x + 0,0027 R² = 0,9981 0.8 Độ hấp thụ 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 60 70 nồng độ DPPH (g/ml) Hình 1: Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ độ hấp thụ DPPH 2.2.4 Độ lặp lại * Thực nghiệm: Tiến hành mẫu phytosome quercetin nồng độ 100 µg/ml - Mẫu thử: Pha loãng mẫu thử để đƣợc dung dịch có nồng độ mg/ml Hút xác 2,0 ml dung dịch thử có nồng độ mg/ml vào bình định mức 20 ml (tƣơng ứng với mẫu thử có nồng độ 100 µg/ml), thêm 10,0 ml dung dịch DPPH 100 µg/ml Thêm nƣớc khử ion vừa đủ thể tích Đem ủ nhiệt độ phòng 30 phút Đem ly tâm, lấy dịch lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành đo quang Tiến hành mẫu thử * Kết quả: Bảng 4: Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp STT Độ hấp thụ ( bs) Hàm lượng DPPH (µg/ml) 0,1723 0,1726 0,1762 0,1709 0,1743 0,1729 TB 11,94 11,97 12,22 11,85 12,09 11,99 12,00 RSD (%) 1,07 * Kết luận: RSD < 2,0% chứng tỏ phƣơng pháp đạt yêu cầu độ lặp lại 2.2.5 Độ Thực cách thêm chuẩn vào phép thử với mẫu phytosome quercetin nồng độ 100 µg/ml Hút xác 11,0 ml; 15,0 ml; 18,0 ml bình định mức 20 ml có sẵn 2,0 ml dung dịch phytosome quercetin 1mg/ml, thêm nƣớc khử ion vừa đủ thể tích Các mẫu thử đƣợc ủ nhiệt độ phòng thời gian 30 phút Sau ly tâm, lọc qua màng lọc 0,45 µm, đo mật độ quang mẫu bƣớc sóng 517 nm Mỗi mức nồng độ làm mẫu So với quy trình thử, lƣợng DPPH cho thêm lần lƣợt 1,0 ml; 5,0 ml; 8,0 ml tƣơng ứng với nồng độ DPPH tăng thêm 5; 25; 40 µg/ml Kết quả: Bảng Kết khảo sát độ phƣơng pháp Mẫu Nồng độ Độ hấp Nồng độ Nồng độ DPPH tăng thụ DPPH DPPH thu hồi thêm (µg/ml) (Abs) mẫu (µg/ml) (µg/ml) 0,2401 16,72 4,72 94,4 0,2416 16,82 4,82 96,4 0,2425 16,89 4,89 97,8 25 0,5181 36,30 24,30 97,2 25 0,5258 36,84 24,84 99,4 25 0,5179 36,28 24,28 97,1 40 0,7311 51,30 39,30 98,3 40 0,7286 51,12 39,12 97,8 40 0,7257 50,92 38,92 99,2 STT % Thu hồi TB 98,0 RSD 1,70 * Kết luận: Tỷ lệ % thu hồi nằm khoảng 94,4% – 99,40% RSD < 2,0% chứng tỏ phƣơng pháp đạt yêu cầu độ 2.2.6 Khoảng xác định Từ kết độ độ tuyến tính suy khoảng xác định phƣơng pháp khoảng từ đến 60 µg/ml DPPH Kết luận Qui trình thử đánh giá hoạt tính trung hòa gốc tự đáp ứng u cầu độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, khoảng xác định, độ lặp lại, thích hợp để đánh giá hoạt tính trung hòa gốc tự DPPH Phụ lục 5.2: Thẩm định phƣơng pháp xác định khả ức chế peroxy hóa lipid Lựa chọn tiêu cần thẩm định, yêu cầu phƣơng pháp đánh giá Các tiêu cần thẩm định bao gồm: độ thích hợp hệ thống, độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại Cách xác định/ đánh giá Chỉ tiêu Độ thích hợp Giá trị RSD độ hấp thụ MDA hệ thống dung dịch chuẩn Đánh giá ảnh hƣởng mẫu (dịch đồng thể não chuột) Giới hạn chấp nhận RSD ≤ 2,0% (n = 6) Phép thử dịch đồng thể não chuột khơng cho tác nhân peroxid hóa (hệ fenton) không cho độ hấp thụ Độ chọn lọc bƣớc sóng 532 nm Độ Xác định tỷ lệ lƣợng MDA tìm lại đƣợc so với lƣợng thêm vào mức nồng 90,0% – 100,0% độ khác Độ lặp lại Xác định hàm lƣợng MDA có mẫu thử Kết thực nghiệm Xác định giá trị RSD kết định lƣợng RSD ≤ 2,0% (n = 6) Hệ số tƣơng quan Độ tuyến tính Hệ số góc đƣờng hồi quy Kết thực nghiệm Hệ số intercept (chắn) đƣờng hồi quy Kết thực nghiệm 2.1 Nguyên, vật liệu: * Nguyên liệu: - r ≥ 0,998 Malonyl dialdehyd (MDA) (Merck, Germany) Đệm phosphat pH 7,4 Acid tricloacetic (TCA) Acid thiobarbituric (TBA) Dung dịch dimethylsulfoside(DMSO) ( Merck) Vitamin E Dịch đồng thể não chuột 2.2 Kết 2.2.1 Độ chọn lọc: * Thực nghiệm: - Nền mẫu: Cho vào ống ly tâm 2,0 ml dịch đồng thể não chuột, 2,0 ml đệm phosphate pH 7,4 Ủ 37oC 15 phút, thêm ml dung dịch TCA 10% Ly tâm 12000 vòng/phút phút Lấy xác 2,0 ml dịch cho phản ứng với 1,0 ml acid thiobarbitutic 0,8 % Ủ nhiệt độ 100oC 15 phút Làm lạnh tiến hành đo quang bƣớc sóng 532 nm - Chuẩn bị mẫu chuẩn: Sử dụng dung dịch chuẩn nồng độ 0,05 µg/ml - Chuẩn bị mẫu thử: Phytosome quercetin đƣợc hòa tan DMSO để đƣợc dung dịch có nồng độ 10 mg/ml Pha loãng dung dịch gốc để đƣợc dung dịch có nồng độ 2000 µg/ml Cho vào ống ly tâm 2,0 ml dịch đồng thể não chuột, 0,2 ml dung dịch phytosome nồng độ 2000 µg/ml, 1,6 ml đệm phosphate pH 7,4, 0,2 ml hệ Fenton Ủ hỗn hợp 37oC 15 phút, thêm ml dung dịch TCA 10% Ly tâm 12000 vòng/phút phút Hút xác 2,0 ml dịch 1,0 ml dung dịch acid thiobarbitutic 0,8 % cho vào ống nghiệm Các ống nghiệm ủ nhiệt độ 100oC 15 phút Làm lạnh tiến hành đo quang bƣớc sóng 532 nm * Kết quả: - Dung dịch thử cho phổ hấp thụ giống với phổ hấp thụ dung dịch chuẩn có cực đại hấp thụ bƣớc sóng 532 nm - Độ hấp thụ mẫu bƣớc sóng 532 nm khơng đáng kể (A = 0,0018) 2.2.2 Độ thích hợp hệ thống * Thực nghiệm: - Đo lần dung dịch chuẩn MDA ghi lại độ hấp thụ - Chuẩn bị mẫu chuẩn: Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1 g/ml * Kết quả: Độ thích hợp hệ thống đƣợc trình bày bảng Bảng 1: Độ hấp thụ mẫu chuẩn STT Độ hấp thụ 0,2160 0,2148 0,2156 0,2147 0,2153 0,2161 TB 0,2154 RSD (%) 0,28 2.2.3 Độ tuyến tính * Thực nghiệm: - Chuẩn bị mẫu chuẩn: pha dung dịch chuẩn MDA có nồng độ 0,03 0,3 µg/ml * Kết quả: Khảo sát tƣơng quan y (độ hấp thụ) x (nồng độ MDA) phƣơng pháp bình phƣơng cực tiểu, kết cho thấy hệ số r2 = 0,9995 (→ r = 0,9998) chứng tỏ có tuyến tính nồng độ độ hấp thụ (bảng 2, hình 1) Bảng 2: Sự tương quan độ hấp thụ nồng độ MDA Lượng cân Bình định (µg/mL) chuẩn (mg) mức (ml) 0,03 10,0 100 10000/3 0,03 0,0653 0,05 10,0 100 10000/5 0,05 0,1086 0,1 10,0 100 10000/10 0,1 0,2165 0,2 10,0 100 10000/20 0,2 0,4345 0,3 10,0 100 10000/30 0,3 0,6318 STT Chuẩn Hệ số tƣơng quan: 0,9998 Hệ số góc: 2,1086 Hệ số chắn (intercept): 0,0046 Độ pha loãng Nồng độ MDA (µg/mL) Độ hấp thụ 0.7 y = 2.1086x + 0.0046 R² = 0.9995 Độ hấp thụ (Abs) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 nồng độ MDA (µg/ml) Hình 1: Đường tuyến tính MDA 2.2.4 Độ lặp lại * Thực nghiệm: Tiến hành mẫu phytosome quercetin nồng độ 100 µg/ml - Mẫu thử: Sử dụng mẫu thử phần độ chọn lọc - Dung dịch chuẩn: Dùng chuẩn nồng độ 0,05 µg/ml phần độ tuyến tính * Kết quả: - Độ hấp thụ mẫu chuẩn: Ac = 0,1086 (Abs) - Cơng thức tính kết quả: STT m MDA  A T  Cc  f A C Bảng Kết độ lặp lại Độ hấp thụ mẫu thử (Abs) Lượng MDA (µg) 0,1651 0,0797 0,0809 0,1676 0,0812 0,1682 0,0792 0,1641 0,0798 0,1653 0,0819 0,1697 TB 0,1667 RSD (%) 1,29 * Kết luận: RSD < 2,0% chứng tỏ phƣơng pháp đạt yêu cầu độ lặp lại 2.2.5 Độ * Thực nghiệm: Thực cách thêm chuẩn vào phép thử với mẫu phytosome quercetin nồng độ 100 µg/ml - Chuẩn bị mẫu chuẩn: Sử dụng dung dịch chuẩn phần thử độ lặp lại - Chuẩn bị mẫu thử: Hút xác 50 µl dung dịch chuẩn MDA 1µg/ml, 25 µl dung dịch chuẩn MDA 10 µg/ml 90 µl dung dịch chuẩn MDA 10 µg/ml vào ống ly tâm có sẵn 2,0 ml dịch đồng thể não chuột, 0,2 ml dung dịch phytosome nồng độ 2000 µg/ml, 0,2 ml hệ Fenton, thêm đệm phosphate pH 7,4 vừa đủ thể tích ml Ủ hỗn hợp 37oC 15 phút, thêm ml dung dịch TCA 10% Ly tâm 12000 vòng/phút phút Hút xác 2,0 ml dịch 1,0 ml dung dịch acid thiobarbitutic 0,8 % cho vào ống nghiệm Các ống nghiệm ủ nhiệt độ 100oC 15 phút Làm lạnh tiến hành đo quang bƣớc sóng 532 nm Mỗi mức nồng độ làm 03 mẫu * Kết quả: Bảng 4: Khả tìm lại MDA Mẫu STT Lượng MDA thêm vào (µg) Độ hấp thụ mẫu thử Lượng MDA tìm lại (µg) % Hồi phục 0,05 0,1031 0,0469 93,85 0,05 0,1037 0,0482 96,34 0,05 0,1024 0,0455 90,95 0,25 0,1985 0,2446 97,83 0,25 0,1976 0,2427 97,09 0,25 0,1968 0,2411 96,42 0,90 0,5028 0,8750 97,23 0,90 0,5016 0,8725 96,95 0,90 0,5035 0,8765 97,39 TB 96,0 RSD (%) 2,3 Độ hấp thụ mẫu chuẩn: 0,1086 (Abs) Tỷ lệ % thu hồi nằm khoảng 90,0% – 100,0% chứng tỏ phƣơng pháp đạt yêu cầu độ 2.2.6 Khoảng xác định: Từ kết độ độ tuyến tính suy khoảng xác định phƣơng pháp khoảng từ 0,03 đến 0,3 µg/ml MDA Kết luận: Định lƣợng MDA phƣơng pháp xác định khả ức chế peroxy hóa lipid đặc hiệu, có độ lặp lại, độ tuyến tính độ thu hồi tốt ... tính phytosome 30 3.1.3 Đánh giá phytosome quercetin bào chế 33 3.2 Nâng qui mô bào chế 38 3.3 Quy trình bào chế 42 3.4 Nghiên cứu độ ổn định phytosome quercetin. .. thực nghiên cứu bào chế phytosome quercetin theo hai phƣơng pháp khác [12],[13] Để ứng dụng thành thu đƣợc tiếp tục phát triển hƣớng nghiên cứu Chúng định thực đề tài Nghiên cứu bào chế phytosome. .. dịch phytosome quercetin bào chế đƣợc bảo quản điều kiện khác ban đầu sau tháng Hình ảnh SEM mẫu hỗn dịch phytosome quercetin bào chế ban đầu Hình ảnh SEM mẫu hỗn dịch phytosome quercetin bào chế