Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CĨ KHẢ NĂNG PHÂN HỦ Y LƠNG GIA SÚC - LÔNG GIA CẦM TỪ CÁC LÒ MỔ GIA SÚC Ở BA HUYỆN TAM BÌ NH, LONG HỒ VÀ VŨ NG LIÊM TỈ NH VĨNH LONG Quách Thi ̣Thanh Tâm1 Bùi Thi ̣Minh Diê ̣u2 Trường Cao đẳng Cộng đồng Vĩnh Long Viê ̣n Nghiên cứu & Phá t triển Công nghê ̣ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chung: Ngày nhận: 08/05/2015 Ngày chấp nhận: 21/12/2015 Title: Isolation and selection of animal fur and feather degrading bacteria from animal slaughter-house in Vinh Long Từ khóa: Azokeratin, Bacillus flexus, Bacillus megaterium, keratin Keywords: Azokeratin, Bacillus flexus, Bacillus megaterium, keratin ABSTRACT Every year, there are thousands of tons of livestock and poultry hair waste that have not been processed in Vietnam The keratin is the main structural component of animal hair quite hard to decompose in nature The aim of this study was to isolate and screen keratin degrading bacteria from waste samples collected from animal slaughter-house These samples were serially diluted and plated on pig-haircontaining medium for isolating and screening of efficient hair-degrading bacteria The forty seven isolates showed their animal-hair-degrading ability with most of them presented white color colonies were selected All isolates got keratinase with azokeratin substrate reaction at 50oC for 15 minutes Strain Kr42 had the highest keratinase activity with 114.3 U/ml The isolates designated as Kr11, and Kr45 revealed significant differences among differentials with the highest rates as 37.66% and 29.41%, respectively in animal-hair-degrading ability In feather-containing medium, Kr45 was the best with 72.79% of degrading rates Bergey’s method and the modern method of 16S rRNA gene sequences indicated that the isolate Kr11 was closely related to Bacillus flexus and the isolate Kr45 was closely correlated to Bacillus megaterium TÓM TẮT Hàng năm, Việt Nam có hàng ngàn lông gia súc, lông gia cầm thả i môi trường mà chưa xử lý Keratin thành phần cấu tạo lơng gia súc, gia cầm hợp chất khó bị phân hủy tự nhiên Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn có khả phân hủy mạnh loại chất chứa keratin từ mẫu đất, mẫu lông nước thải thu lò giết mổ gia sú c thuộc tın ̉ h Vıñ h Long Các mẫu vật pha lỗng ni cấy mơi trường chứa bột lơng heo nguồn carbon nitơ để phân lập vi khuẩn Kết phân lập 47 dòng vi khuẩn có khả phân hủy lơng heo với đa số dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng đục Tấ t cả dòng vi khuẩn phân lập cho hoạt tính keratinase với chất azokeratin 50C sau 15 phút phản ứng Dòng Kr42 có hoạt độ keratinase cao là 114,3U/ml khác biệt có ý nghĩa so với dòng vi khuẩn lại Bên cạnh đó, dòng Kr11 và Kr45 cho kết phân hủy lông heo tốt khác biệt có ý nghĩa so với dòng lại với tỷ lệ phân hủy 37,66% 29,41% Dò ng Kr45 có khả phân hủy lông gia cầm tố t nhấ t với tỷ lệ 72,79% Kế t hợp giữa phương phá p ̣nh danh củ a Bergey (John et al, 1994) và phương phá p ̣nh danh hiện đại dựa và o trình tự đoạn gen 16S rRNA đã cho kế t luận dòng vi khuẩn Kr11 có quan hệ gầ n với loà i Bacillus flexus dò ng vi khuẩn Kr45 có tương quan gầ n với loà i Bacillus megaterium Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập vi khuẩn có khả phân giải keratin môi trường bột lông heo: ĐẶT VẤN ĐỀ Lông gia súc lông gia cầm có thành phần keratin khó phân hủy và chiếm tỉ lệ lớn nguồn rác thải từ lò giết mổ trở thành nguồn ô nhiễm nghiêm trọng (Gupta Ramnani, 2006) Đã có nhiều phương pháp áp dụng để xử lý lông chôn, đốt bỏ làm thức ăn gia súc (Tapia Contiero, 2008) Tuy nhiên, chi phí cho phương pháp đốt chơn cao gây nhiễm cho mơi trường đất, nước khơng khí; việc sử dụng bột lông xay nhuyễn làm thức ăn gia súc cho tỉ lệ tiêu hóa thấp (Joshi et al., 2007) Các nghiên cứu nước vi sinh vật có khả phân giải keratin đạt thành cơng số lượng nghiên cứu tập trung phía Bắc-vùng khí hậu khác biệt với Đồ ng bằ ng sông Cửu Long Do đó, việc phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả phân huỷ lơng gia súc và lơng gia cầ m từ các lò giế t mổ gia súc tı̉nh Vıñ h Long là nghiên cứu cầ n thiế t nhằ m tìm kiếm dòng vi khuẩn phân huỷ lông gia súc, lông gia cầ m mạnh để phục vụ cho sản xuất chế phẩm sinh học giúp chế biến nguồn chất thải thành phân hữu sinh ho ̣c hoă ̣c sản phẩm bổ sung protein với độ hấp thu cao làm thức ăn cho cá, gia súc, gia cầm; đồng thời giúp giảm thiểu nhiễm mơi trường từ ngành chăn ni Ngồi ra, tương lai phát triển để sản xuất keratinase với nhiều ứng dụng cho ngành công nghiệp nhẹ khác Đấ t đươ ̣c đào sâu khoảng 20 cm sở giết mổ gia súc để thu khoảng 10 g mẫu đấ t Mẫu lông đươ ̣c thu khoảng 10 g mẫu lông phân huỷ đấ t ở sở giế t mổ gia súc Mẫu nước đươ ̣c tiế n hành thu nơi trực tiếp thải nguồn nước (nơi nước tĩnh, đọng lại) thu khoảng 50 ml nước Các mẫu cho vào túi nilon sạch, loại dùng lần, ghi nhãn đem phòng thí nghiệm giữ nơi mát đến tiến hành phân lập Chuẩn bị chất chứa keratin, đố i với bột lông heo: lơng heo thu lò giết mổ tỉnh Vĩnh long, rửa tạp chất, sấy khô, loại bỏ da tạp chất lại, sau cắt nhuyễn khoảng 1,5 mm; đớ i với bột lông gia cầm: lông gà lông vịt thu lò giết mổ gia cầm tỉnh Vĩnh Long, rửa loại bỏ tạp chất, sấy khô, xay nhuyễn, trộn với tỷ lệ 1: Cân g mẫu đất, lông hút 10 ml mẫu nước cho vào bình tam giác 250 ml chứa 99 ml (90 ml mẫu nước) môi trường lỏng có bổ sung bột lơng heo ủ 30C máy lắc (120 vòng/phút) vòng 24 nhằm tăng sinh khối vi khuẩn mẫu Thu lấy dịch chứa vi khuẩn, bỏ phần cặn lắng Dịch mơi trường pha lỗng từ nồng độ 100 đến nồng độ 10-10, trải lên mơi trường khống có bổ sung bột lơng, ủ 30C vòng ngày Các khuẩn lạc mọc to, rõ rệt chọn để cấy chuyển môi trường bột lông heo ròng Các mẫu ròng sau trữ ống mơi trường thạch nghiêng có thành phần 4C (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010) 2.2.2 Đánh giá khả phân hủy bột lông heo dòng vi khuẩn: Trong nghiên cứu này, mẫu đất, nước lông hoai mục thu thập lò giết mổ gia súc ở huyê ̣n Tam Bı̀nh, Long Hồ và Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long Các dòng vi khuẩn có khả phân giải keratin phân lập môi trường bột lông chọn lọc dựa vào hoạt tính keratinase, khả phân hủy lơng gia cầm lơng heo Các dòng vi khuẩn tuyển chọn định danh dựa vào đặc điểm hình thái, đặc tính sinh hóa trình tự đoạn gen 16S rDNA Đối với dòng vi khuẩn, chuẩn bị bình thủy tinh 75 ml chứa 25 ml mơi trường bột lông heo với thành phần môi trường phân lập khử trùng 121C 10 phút Lần lượt chủng vào bình thủy tinh 1,15 ml dịch ni vi khuẩn dòng vi khuẩn phân lập được, ủ 30C máy lắc (120 vòng/phút) Một bình thủy tinh với thể tích mơi trường không chủng vi khuẩn mà thay 1,15 ml nước cất vô trùng sử dụng làm mẫu đối chứng Sau VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Tiế n hành lấ y mẫu ở lò giế t mổ gia súc ta ̣i ba huyện Tam Bın ̀ h, Long Hồ và Vũng Liêm tỉnh Vĩnh Long, Mỗi lò giế t mổ gia súc thu mẫu nước, mẫu lông và mẫu đấ t Cơ chất chứa keratin: bột lông heo, bột lông gia cầm Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 ngày nuôi lắc, tiến hành lọc rửa môi trường qua vải lọc khử trùng và cân khối lượng trước đó, cân lượng bột lơng lại sau lọc sấy khô 60C đến khối lượng không đổi để tính khối lượng bột lơng bị phân hủy q trình ni cấy (Nguyễn Huy Hồng et al., 2010) pH 7,5 Azokeratin rửa lần với nước làm khô qua đêm chân không 500C Trữ lạnh azokeratin (4-100C) để sử dụng thời gian dài (Areeb et al., 2012) Đo hoạt tính keratinase dòng vi khuẩn chất Azo-keratin Khả phân hủy bột lông heo vi khuẩn tính theo cơng thức sau: (Nguyễn Huy Hồng et al., 2010) Cho mg azokeratin vào ố ng nghiê ̣m eppendorf 1,5 ml với 0,8 ml dung dịch đệm potassium phosphate 50 mM, pH = 7,5 Đảo hỗn hợp azokeratin tan hoàn toàn Thêm 0,2 ml dịch keratinase thô vào dung dịch azokeratin, trộn ủ lắc 15 phút 50oC Kết thúc phản ứng cách thêm vào ố ng nghiê ̣m eppendorf 0,2 ml acid trichloroacetic 10% Hỗn hợp lọc phân tích cách đo bước sóng 450 nm với máy hấp thụ quang phổ Thermo Spectronic genesys 10 UV Mẫu đối chứng chuẩn bị cách thêm 0,2 ml acid trichloroacetic 10% trước cho dịch keratinase thô Đơn vị hoạt động keratinase xác định số lần tăng độ hấp thụ bước sóng 450 nm sau 15 phút phản ứng so với 0,01 (Areeb et al., 2012) 2.2.5 Đi ̣nh danh dòng vi khuẩn tuyển chọn A (%) = (mBĐ - mC) x 100 / mBĐ Trong đó: A (%) tỉ lệ bột lông heo bị phân hủy vi khuẩn; mBĐ: khối lượng bột lông ban đầu; mC : khối lượng bột lơng lại sau bị phân hủy 2.2.3 Đánh giá khả phân hủy bột lơng gia cầm dòng vi khuẩn Thí nghiệm khảo sát khả phân hủy bột lơng gia cầm dòng vi khuẩn phân lập tiến hành tương tự khảo sát khả phân hủy bột lông heo, với chất bột lơng gia cầm 2.2.4 Đánh giá hoạt tính keratinase dòng vi khuẩn Một dòng vi khuẩn thể khả phân hủy bột lông gia súc dòng vi khuẩn phân hủy bột lơng gia cầm mạnh tuyển chọn giải trình tự đoạn gen 16S rRNA, đối chiếu với liệu GenBank công cu ̣ BLAST để xác định mức độ tương đồng trình tự đoạn gen với dòng vi khuẩn cơng bố Qui trình thực sau: ly trích DNA vi khuẩn; kiểm tra độ tinh DNA trích phương pháp đo quang phổ hấp thụ OD (Optical density); thực phản ứng PCR với cặp mồi phổ biến (8F – 1391R) dùng để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA vi khuẩn (Baker et al., 2003) có trình tự sau: Tạo Azo-keratin Phương pháp thực tương tự bước quy trình tạo azoalbumin: Bột lơng gia cầm nghiền thật mịn, cho g vào bình tam giác 100 ml; Cho vào 20 ml nước khử ion, dùng khuấy từ trộn hỗn hợp; Cho tiếp vào hỗn hợp ml NaHCO3 10% (w/v), khuấy Dùng ống nghiệm 10 ml, cho vào 174 mg sulfanilic acid hòa tan ml NaOH 0.2 N Tiếp tục cho 69 mg NaNO2 hòa tan vào dung dịch Thêm vào 0,4 ml HCl 5N Lắc phút, sau trung hòa 0,4 ml NaOH 5N Mồi xi 8F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ Mồi ngược 1391R: 5′-GACGGGCGGTGWGTRCA -3′ Cho tất phần dung dịch ống nghiệm 10 ml vào bình tam giác 100 ml có bột lơng gia cầm chuẩn bị trên, trộn 10 phút Lọc hỗn hợp phản ứng giấy lọc Whatman – số 1, phần azokeratin khơng tan rửa hồn tồn với nước khử ion Azokeratin hòa lơ lửng nước, lắc 50 0C lọc lại lần Chu kỳ rửa lặp lại pH dịch rửa 6,0 – 7,0 hấp thụ quang phổ dung dịch bước sóng 450 nm nhỏ 0,01 Cuối cùng, chu trình rửa lặp lại hai lần sử dụng dung dịch đệm potassium phosphate 50 mM Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR phương pháp điện di gel agarose 1,5% có nhuộm Ethidium bromide hiệu điện 80V 50 phút, với thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas, USA) Sản phẩm từ phản ứng PCR giải trình tự phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ So sánh trình Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 tự rRNA thu với liệu GenBank trang web (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Dựa vào tỉ lệ tương đồng trình tự đoạn gen 16S rRNA, kết hợp với đặc tính hình thái sinh hóa (theo hệ thớ ng phân loa ̣i Bergey) để xác định lồi hai dòng vi khuẩn tuyển chọn 2.2.6 Khảo sát khả phân hủy sợi lơng gà cá c dòng vi khuẩn phân lập Kr21 Chọn lông gà loại có khối lượng tương đương (khoảng 10g), sấy khơ 50oC vòng ngày Cho lơng vào ống nghiệm chứa 20 ml môi trường gồm NaCl 0,5g/l, KH2PO4 0,4 g/l, K2HPO4 0,3 g/l, NH4Cl 0,5 g/l, cho tồn lơng bị ngập mơi trường, khử trùng 121oC 10 phút Mỗi ống nghiệm chủng vào ml dịch huyền phù vi khuẩn, ủ 120rpm mức nhiệt độ 37oC khảo sát Quan sát ghi nhận thời gian làm gãy rụng lơng dòng vi khuẩn tủ n cho ̣n 10 tuầ n 2.2.7 Phân tích kết xử lý thống kê Hın ̀ h 1: Hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn Kr21 Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn hiếu khí phân lập Đặc điểm Màu sắ c Các kết trung bình lần lặp lại vẽ biểu đồ phần mềm Microsoft Excel 2010 Số liê ̣u đươ ̣c xử lý bằ ng phầ n mề m thố ng kê Minitab version 16.2.1 bằ ng phép thử DUNCAN và LSD ở mức đô ̣ 5% Hình dạng Kiểu bìa KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập vi khuẩn Độ Từ 21 mẫu (7 mẫu đất, mẫu nước, mẫu lơng) thu lò giết mổ gia súc huyê ̣n Tam Bın ̀ h, Long Hồ, Vũng Liêm tỉnh Vĩnh Long phân lập 47 dòng vi khuẩn điều kiện hiếu khí Tất dòng có khả phát triển mơi trường khống có bổ sung bột lơng heo nguồn carbon nitơ nhất, chứng tỏ chúng có khả sử dụng bột lơng heo cho phát triển (Daniel et al., 2009) Sau phân lập ròng, dòng vi khuẩn cấy mơi trường đặc có thành phần để quan sát hình thái khuẩn lạc Thời gian trung bình để tế bào vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc môi trường phân lập từ 24 – 48 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn mơ tả Bảng Hình thái Hồng nhạt Trắng đục Trắng Vàng Tròn Ngun Răng cưa Mơ Lài Phẳ ng Số lươ ̣ng khuẩ n la ̣c 33 47 19 28 30 12 % 2,13 70,21 19,15 8,51 100,00 40,43 59,57 63,83 25,53 10,64 3.2 Kết kiểm tra hoạt tính keratinase chất azokeratin Sau ngày lắc ủ (đã đồng mật số vi khuẩn), enzyme thô lọc ly tâm để thực phản ứng với chất azokeratin Kết tính hoạt độ enzyme keratinase dòng vi khuẩn thể Hình Kết cho thấy tất dòng vi khuẩn cho phản ứng với chất azokeratin Trong đó, dòng Kr42 cho hoạt tính cao với 114,33U/ml, khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 5% so với tất dòng vi khuẩn lại Các dòng Kr37, Kr30, Kr24 thuộc nhóm có hoạt độ keratinase thấp nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 5% thấp khoảng 68 – 114 lần so với dòng cho hoạt tính cao Kr42 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 Hoạt đô ̣ keratinase (U/ml) Hình 2: Hoạt tính keratinase dòng vi khuẩn Ghi chú: - Số liệu thống kê hình giá trị trung bình lần lặp lại - Các giá trị trung bình có mẫu tự theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức độ 5%.(theo phé p thử Duncan) Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 keratinase thu đươ ̣c có thấ p so với nghiên cứu của Savitha et al (2010), nhiên enzyme từ dòng B licheniformis KI8102 nghiên cứu keratinase tinh (hoạt tính 500 U/ml) 3.3 Khả phân hủy bột lơng heo dòng vi khuẩn phân lập Hoạt tính keratinase dòng Kr42 cao so với hoạt tính keratinase thơ nghiên cứu Mozammel et al (2005) với mức 58,1U/ml dòng Baccilus subtilis MZK-7 39U/ml dòng Bacillus licheniformis ATCC 9945, hay 33,9U/ml Bacillus licheniformis MZK-3 Kế t quả hoa ̣t tıń h Hın ̀ h 3: Khả phân hủy bột lơng heo dòng vi khuẩn Ghi chú: - ĐC: Mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn - Số liệu thống kê hình giá trị trung bình lần lặp lại - Các giá trị trung bình có mẫu tự theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức độ 5% theo phé p thử Duncan Kết khảo sát (hıǹ h 3) cho thấy dòng vi khuẩn phân lập có khả phân hủy lông heo sau ngày nuôi cấy với mật số vi khuẩn chủng vào lúc đầu x 1011 (CFU/ml) Dòng Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 Kr11 cho kết phân hủy bột lông heo cao 37,66%, kế t quả phân hủy này cao gấp khoảng 34,24 lần so với kế t quả phân hủy bô ̣t lông heo ở mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn; dòng Kr45 với tỷ lệ phân hủy bô ̣t lông heo 29,4% cao gấp 26,73 lần so với tỷ lê ̣ phân hủy bô ̣t lông heo ở mẫu đối chứng Đồng thời, kết phân tích thống kê cho thấy khả phân hủy lơng heo hai dòng khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 5% theo phép thử Duncan so với mẫu đối chứng với tất dòng lại 3.4 Khả phân hủy bột lơng gia cầm dòng vi khuẩn phân lập Tỷ lê ̣ phân hủy (%) Hình 4: Khả phân hủy bột lơng gia cầm các dòng vi khuẩn Ghi chú: - ĐC: Mẫu đối chứng, không chủng vi khuẩn - Số liệu thống kê hình giá trị trung bình lần lặp lại - Các giá trị trung bình có mẫu tự theo sau giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 5% theo phé p thử Duncan Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 phân hủy lông heo dòng vi khuẩn khác biệt cấu trúc keratin lông gia súc (-keratin) lông gia cầm (-keratin) hàm lượng sulfur (cầu nối disulfide) hai loại chất (Akhtar Edwards, 1997) 3.5 Khả phân hủy sợi lơng gà ngun 47 dòng vi khuẩn ống nghiệm Hình thể hiê ̣n khả phân hủy lơng gia cầm 47 dòng vi khuẩn phân lâ ̣p đươ ̣c Kết khảo sát sau ngày ni cấy cho thấy 47 dòng vi khuẩn có khả phân hủy lơng gia cầm Dòng vi khuẩn Kr45 có khả phân hủy lơng gia cầm mạnh nhấ t với tỷ lệ 72,79% khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 5% so với mẫu đối chứng với dòng lại Kết theo dõi làm rụng lơng sợi lơng gà ngun 47 dòng vi khuẩn sau 10 ngày nuôi lắc cho thấy tất dòng vi khuẩn có khả làm gãy rụng lơng sợi lơng gà ngun Trong đó, dòng Kr45 và dòng Kr11 bắt đầu làm rụng lơng từ ngày thứ ba sau chủng làm rụng tồn lơng sau 10 ngày (chỉ lại lơng ống) và làm tan rã tồn sợi lơng gà sau 10 t̀ n (Hình và Hıǹ h 6) Các dòng lại cho thấy khả làm rụng lông từ ngày thứ tư chưa đến 50% số lông sau 10 ngày chủng Kế t quả thu đươ ̣c thể hiê ̣n khả phân hủy lông gia cầm cao hẳn so với khả phân hủy lông gia súc tất dòng vi khuẩn tương ứng (Hình và Hı̀nh 4), chúng phân lập từ lò giết mổ gia súc Điều cho thấy khả phân hủy chất chứa keratin không phụ thuộc vào dòng vi khuẩn hoạt độ enzyme keratinase chúng tạo ra, mà phụ thuộc vào cấu trúc keratin, không bị ảnh hưởng nhiều từ nguồn phân lập Sự khác biệt khả phân hủy lông gia cầ m và khả Kr45 ĐC Kr11 Hình 5: Sơ ̣i lơng gà đã phân hủy sau 10 tuầ n đươ ̣c chủng dòng Kr45 so với đố i chứng Ghi chú : ĐC Hình 6: Sơ ̣i lơng gà đã phân hủy sau 10 tuầ n đươ ̣c chủng dòng Kr11 so với đố i chứng ĐC- đố i chứng : không chủ ng vi khuẩn bằ ng cách kế t hơ ̣p phương pháp truyề n thố ng theo ̣ thố ng phân loa ̣i Bergey và phương pháp hiê ̣n đa ̣i dựa vào trıǹ h tự gen 16S rRNA 3.6 Kết định danh dòng vi khuẩn tuyển chọn Dòng vi khuẩ n Kr11(đươ ̣c phân lâ ̣p từ mẫu đấ t ở lò giế t mổ bò ở huyê ̣n Tam Bı̀nh) phân huỷ lông gia súc ma ̣nh nhấ t và Kr45 (đươ ̣c phân lâ ̣p từ mẫu lông ở lò giế t mổ bò ở huyê ̣n Tam Bı̀nh) phân hủy lông gia cầ m ma ̣nh nhấ t đươ ̣c cho ̣n để đinh ̣ danh Đă ̣c điể m sinh hoá của hai dòng vi khuẩn tuyể n cho ̣n đươ ̣c khảo sát để đinh ̣ danh theo phương pháp truyề n thố ng với ̣ thố ng phân loa ̣i Bergey Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 Bảng 2: Kế t quả khảo sát đă ̣c diể m hai dòng vi khuẩn hiế u khı́ đươ ̣c tuyể n cho ̣n Dòng Khả Hình dạng Bào tử Catalase Gram Kı́ch thước vi khuẩ n (m) vi khuẩn di động tế bào Chiề u dài Chiề u rô ̣ng Kr11 Có Que Có + + 3,2 1,0 Kr45 Có Que Có + + 4,1 1,5 thường xuyên) Như vâ ̣y, 35 nhóm vi khuẩ n theo ̣ thố ng phân loa ̣i Bergey (John et al., 1994), có Vı̀ hai dòng VK đươ ̣c tuyể n cho ̣n là nhóm vi nhóm cho kế t quả phù hơ ̣p nhấ t là nhóm 18 khuẩ n gram dương có bào tử (Bảng 2), nên chúng (nhóm vi khuẩ n gram dương hıǹ h cầ u hoă ̣c hıǹ h thuô ̣c nhóm 18 Dựa vào đặc tính các nhóm vi que hı̀nh thành bào tử); nhóm 19 (nhóm vi khuẩ n khuẩ n hình que, có khả chủ n ̣ng Bảng gram dương hı̀nh que không hı̀nh thành bào tử, (trı́ch từ John et al., 1994) nhâ ̣n dòng thường xuyên) và nhóm 20 (nhóm vi khuẩ n gram VK này không thuô ̣c nhóm Sporesarcina và nhóm dương hı̀nh que không hı̀nh thành bào tử, không Sulfidobacillus STT Ghi chú : + : dò ng dương tı́ nh ; - : dò ng âm tı́ nh ; + + - + + - + + Syntrophospora + + ND Sulfidobacillus + + - Sporesarcina + + - Sporolactobacillus + + + Sprohalobacter Desulfotomaculum + + - Oscillospira Clostridium Hıǹ h que Khả chuyể n đô ̣ng Catalase Bacillus Đă ̣c tı́nh Amphibacillus Bảng 3: Phân biêṭ các đă ̣c tı́nh khác giữa các nhóm vi khuẩ n có bào tử + ND + ND ND ND: không xá c ̣nh trıǹ h tự gen 16S rRNA: DNA chúng đươ ̣c ly trıć h đoạn gen 16S rRNA khuyế ch đa ̣i bằ ng kỹ thuâ ̣t PCR sử du ̣ng că ̣p mồ i 8F và 1391R Thực hiê ̣n thử nghiê ̣m catalase với hai dòng vi khuẩ n đươ ̣c tuyể n cho ̣n đề u cho kế t quả dương tı́nh với H2O2 và nhóm Bacillus đươ ̣c xem là nhóm phù hơ ̣p nhấ t về các đă ̣c tıń h sinh hoá của hai dòng vi khuẩ n Kr11 và Kr45 Kế t quả khảo sát đă ̣c điể m của dòng vi khuẩ n ở Bảng càng cho thấ y rõ nhóm Bacillus là nhóm vi khuẩ n phù hơ ̣p nhấ t về các đă ̣c tıń h sinh hoá của hai dòng vi khuẩ n Kr11 và Kr45 Trı̀nh tự đoạn gen 16S rDNA hai dòng vi khuẩ n xác định phương pháp Sinh học Phân tử DNA chúng đươ ̣c ly trıć h đoạn gen 16S rRNA khuyế ch đa ̣i bằ ng kỹ thuâ ̣t PCR sử du ̣ng că ̣p mồ i 8F và 1391R Hın ̀ h 7: Bo ̣t khı́ sinh khảo sát hoa ̣t tı́nh catalase của dòng vi khuẩ n Kr11 và Kr45 Kế t hơ ̣p với phương pháp nhâ ̣n diê ̣n dựa vào Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 1400bp Giế ng 1: Thang chuẩn 1kp Giếng 2: mẫu Kr11 Giếng 3: mẫu Kr45 Giếng 4: Đối chứng âm Hình 8: Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose của hai dòng vi khuẩ n đươ ̣c tuyể n cho ̣n (Ngà y 12/12/2014) Bảng 4: Kết mối tương quan di truyền dòng vi khuẩn phân giải keratin phân lập với dòng vi khuẩn có ngân hàng gen (NCBI) Các dòng vi khuẩn phân lập Đại diện lồi có quan hệ gần gũi Mã số Tỉ lệ tương đồng (%) Kr11 Bacillus flexus RB85 KJ623600 96 Kr45 Bacillus megaterium strain AIMST HQ670528 97 lông gà nguyên hoàn toàn sau 10 tuầ n có tiềm Kế t hơ ̣p giữa phương pháp đinh ̣ danh truyề n đưa vào thử nghiệm ứng dụng phân hủy lông gia thố ng Bergey và phương pháp đinh ̣ danh hiê ̣n đa ̣i cầm điều kiện môi trường tự nhiên để làm thức dựa vào trình tự đoạn gen 16S rDNA hai dòng ăn chăn ni vi khuẩn tuyển chọn với trình tự dòng vi khuẩn khác GenBank cho thấy chúng LỜI CẢM TẠ thuộc chi Bacillus, dòng Kr11 có quan ̣ gầ n gũi Tác giả xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên với Bacillus flexus RB85, dòng Kr45 tương quan cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường gầ n với dòng Bacillus megaterium AIMST Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thực nghiên cứu Như vậy, hai dòng vi khuẩn tuyển chọn từ nghiên cứu thuộc chi Bacillus Kết TÀI LIỆU THAM KHẢO phù hợp với kết luận Ghosh et al (2007) phần lớn dòng vi khuẩn có hoạt tính phân hủy Akhtar W and H.G.M Edwards, 1997 keratin cao phân lập thuộc chi Bacillus Fourier-transform Raman spectroscopy of Dòng Bacillus megaterium F7-1 Geun mammalian and avian keratotic Tea Park Hong – Joo Son nghiên cứu cho biopolymers Spectrochim Acta 53: 81-90 thấy khả phân hủy đến 26% lượng bột lông gà Barker G.C., J.J.Smith and D.A Cowan, 2003 sau 24 chủng 30°C Review and reanalysis of domain specific 16S primers Journal of Microbiological KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Method 55: 541-555 Từ chất thải lò giết mổ gia súc phân lập Daniel J.D., Ana P.F.C and Brandelli A, 2009 vi khuẩn có khả phân hủy lơng gia súc Keratinolytic potential of a novel Bacillus sp (lông heo) lông gia cầ m Khả phân hủy P45 isolated from the Amazon basin fish chất chứa keratin không phụ thuộc vào hoạt Piaractus mesopotamicus International tính keratinase mà phụ thuộc vào yếu tố Biodeterioration & Biodegradation 63: 358–363 khác (có thể tế bào vi khuẩn kiểu cấu trúc Edward H.Burtt, Jr and Jann M.Ichida, 2001 keratin, Edward et al., 2001) Trong thı́ nghiê ̣m, hai Bacteria useful for degrading keratin dòng vi khuẩn có khả phân hủy lơng heo United States Patent ma ̣nh (Bacillus flexus Kr11) lông gia cầm mạnh (Bacillus megaterium Kr45) thuộc chi Bacillus, Ghosh A., Maity B., Chakrabarti K and kỳ vọng ứng dụng để xử lí rác thải chứa keratin Chattopadhyay D, 2007 Bacterial diversity Dòng vi khuẩn Kr45 liên quan gần với loài of east Calcutta wet land area: Possible Bacillus megaterium với khả phân hủy co ̣ng identification of potential bacterial 10 Tạp chı́ Khoa học Trường Đại học Cầ n Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ Sinh học: 41 (2015): 1-11 degradation, International Journal of Engineering in Life Sciences, Volume 10, Issue 4, pages 361–367 John G Holt, Peter H.S and Nobel R.K., 1994 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, ninth edition Lippincott Williams and Wilkins, United States, 9-754 pp Joshi S.G., Tejashwini M.M., Revati N., Sridevi R and Roma D.,2007 Isolation, identification and characterazation of a feather degrading bacterium International Journal of Poultry Science 6(9): 689-693 Park Geun.Tea and Hong-Joo Son, 2009 Keratinolyticactivity of Bacillus megaterium F7-1, a featherdegradingmesophilicbacterium Microbiological Research, 164: 478-485 Tapia D.M.T and J.Contiero, 2008 Production and partial characterization of keratinase produced by a microorganism isolated from poultry processing plant wastewater African Journal of Biotechnology 7(3): 296-300 population for different biotechnological uses Microbial Ecology 54: 452-459 Gupta, R and P Ramnani, 2006 Microbial keratinases and their prospective applications: an overview Appl Microbiol Biotechnol, 70:21–33 Mohammad, S H., K A Abul, S M Abu Sayem, M Golam and H.Mozammel, 2007 Production and Partial characterization of feather-degrading keratinolytic serine protease from Bacillus licheniformis MZK3 J.Biological Sciences, (4):599-606 Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Quỳnh Mai Nguyễn Ngọc Dũng 2010 Phân lập chủng vi khuẩn có khả phân giải lơng vũ tạo nguồn thức ăn cho ni trồng thủy sản Tồn văn Hội nghị thủy sản 2010 Savitha S Desai, Swati Hegde, Preeti Inamdar, Nagaraj Sake and M S Aravind, 2010 Isolation of keratinase from bacterial isolates of poultry soil for waste 11 ... khả phân hủy bột lơng gia cầm dòng vi khuẩn Thí nghiệm khảo sát khả phân hủy bột lông gia cầm dòng vi khuẩn phân lập tiến hành tương tự khảo sát khả phân hủy bột lông heo, với chất bột lông gia. .. mục thu thập lò giết mổ gia súc ở huyê ̣n Tam Bı̀nh, Long Hờ và Vũng Liêm, tỉnh Vĩnh Long Các dòng vi khuẩn có khả phân giải keratin phân lập môi trường bột lông chọn lọc dựa vào hoạt tính... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập vi khuẩn Độ Từ 21 mẫu (7 mẫu đất, mẫu nước, mẫu lông) thu lò giết mổ gia súc huyê ̣n Tam Bın ̀ h, Long Hồ, Vũng Liêm tỉnh Vĩnh Long phân lập 47 dòng vi khuẩn