Độ nhạy với bệnh loét có múi gây vi khuẩn Xanthomonas axonopodis pv citri phụ thuộc vào gen nhân chủ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.1 vật liệu * Nguyên liệu thực vật - Cây lai tạo thuộc lồi có múi tạo thành kết hợp tế bào trần có nguồn gốc từ phơi tâm cam MARC unshiu cv Juman tế bào thịt cam C sinensis Osbeck cv Washington navel orange (Yamamoto Kobayashi 1995) - Hình thái lai tạo tương tự C sinensis Đặc điểm hoa lai tạo giống hệt với C sinensis trừ số nhị hoa (Yamamoto et al 2001) - Cây lai tạo bao gồm gen nhân C sinensis gen tế bào chất C unshiu Các chồi giống lai tạo bố mẹ sử dụng cho tiêm truyền thử nghiệm ghép vào chậu có gốc ghép năm tuổi cam ba Poncirus trifoliata Raf - Bệnh đánh giá ba trồng từ năm trước vườn ăn Citrus Kuchinotsu thuộc Trạm nghiên cứu * Dòng vi khuẩn - Chủng vi khuẩn KC21 - Xanthomonas axonopodis pv citri đột biến phát sinh tạo thành KC21T14 (gen sinh bệnh pthA-KC21 bị gián đoạn chèn thêm đoạn Tn5) (Shiotani et al, 2007) - Các vi khuẩn nuôi cấy 27oC mơi trường men (YP) peptone, 1,5% agar, có bổ sung kháng sinh kanamycin với nồng độ 50 µg/1ml (KC21T14 kháng kháng sinh) - Gen pthA KC21 gửi vào GenBank với số đăng nhập AB206388 1.2 Phương pháp * Tiêm truyền thử nghiệm - Độ nhạy lai tạo bố mẹ với X axonopodis pv citri đánh giá sau tiêm truyền chủng vi khuẩn vào (Shiotani et al.2000) - Vi khuẩn bị đình hoạt động 0,85% NaCl nồng độ 108 tế bào / ml, bị đình trưởng thành - Đưa vi khuẩn bị đình hoạt động vào vòi chích trùng (đường kính 0,5 mm) - Sau đó, đem tiêm vi khuẩn trồng nhà kính - Đo đường kính vòng tròn tổn thương lá, bao gồm mơ bần phần mép xung quanh sũng nước - Quan sát phát triển vi khuẩn tổn thương 0, 1, 2, 3, 4, 8, 16, 32 ngày - Sau đó, loại bỏ tổn thương Đem ngâm mô cắt môi trường XCSM bán chọn lọc (Shiotani et al.2000) có NaCl 0,85%, vi khuẩn bị đình hoạt động * Quá trình phát triển bệnh - Quá trình phát triển bệnh điều tra Tháng năm 2003 20 chồi non lựa chọn theo thứ tự từ mức độ tổn thương nhiều đến ít, với số sau: : khơng có tổn thương; : 1-3 tổn thương, 3: 4-10 tổn thương, 5: 11-20 tổn thương; 7: 20 tổn thương - Mức độ nghiêm trọng bệnh (DS) tính tốn từ tổng số (SI) sau: DS= SI / (20 x 7) x 100 2 Kết thảo luận Độ nhạy với bệnh loét có múi phụ thuộc vào gen nhân chủ Độ nhạy lai tạo bố mẹ đánh giá sau tiêm vi khuẩn KC21 vào chúng Vết tổn thương lan tất vòng ngày sau tiêm Sau đó, mủ sinh từ tổn thương (cây C unshiu xuất mủ so với lai tạo C Sinensis) Hình 1: Triệu chứng loét bề mặt Citrus sinensis, C unshiu, lai tạo Các triệu chứng phát triển 40 ngày sau tiêm vi khuẩn KC21 bị đột biến khơng hồn tồn (KC21T14) chứa gen sinh bệnh pthAKC21 Bảng 1: Mức độ nghiêm trọng bệnh loét lồi có múi lai tạo Trong tất thử nghiệm, mật độ cư trú vi khuẩn KC21 tăng ngày sau tiêm khoảng 3.4 x 105 CFU thương tổn (Hình a) Sau ngày, tỷ lệ vi khuẩn nhân lên C unshiu khác so với lai tạo C sinensis Sau 16 ngày, số lượng vi khuẩn C unshiu giảm, lai tạo C sinensis khơng giảm Số lượng vi khuẩn quan sát lai tạo C sinensis giống suốt thí nghiệm Những kết cho thấy độ nhạy với bệnh loét mô lai tạo tương đương với C.sinensis, phụ thuộc vào gen nhân loài Mức độ nghiêm trọng bệnh lai tạo tương tự C sinensis Giống có múi lồi có kích thước lớn phát triển mạnh, thời gian sống ngắn dễ bị loét giống trồng phát triển chậm có trưởng thành nhanh (Gottwald et al 1993) Tế bào chất có khả kháng bệnh (Mazouz et 2002 al; Ohtani et al 2002), nhiên, mức độ đề kháng bệnh loét C.unshiu độc lập với gen tế bào chất Có khác tỷ lệ tăng tổn thương lai tạo C Sinensis (Bảng 2) Quan sát cho thấy khác biệt không phụ thuộc vào gen nhân chúng mà phụ thuộc gen tế bào chất Tuy nhiên, khác biệt khơng có nghĩa độ nhạy với bệnh lt khác nhau; vi khuẩn tăng trưởng hai tương tự 32 ngày sau tiêm (Hình 2) Hình 2: Thời gian phát triển vi khuẩn có múi Lá Citrus sinensis, C unshiu, lai tiêm chủng hoang dại KC21 (a) chủng bị đột biến KC21T14 (b), gen gây bệnh pthAKC21 bị gián đoạn chèn đoạn Tn5 Lấy mẫu để 32 ngày sau tiêm Bảng 2: Đường kính tổn thương thí nghiệm sau tiêm hai chủng hoang dại KC21 chủng đột biến KC21T14 Khả gây bệnh gen PthA không liên quan đến khác biệt độ nhạy C unshiu C Sinensis Gen sinh bệnh - pthA gây bệnh loét có múi, tạo khả làm vỡ lớp biểu bì gây vết lt có múi Vì vậy, PthA liên quan đến khác biệt phát triển mủ C sinensis C unshiu, gen nhân có ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy với bệnh loét có múi Để xác định tham gia gen pthA trình phát triển mủ C sinensis C unshiu khác nhau, tạo gen KC21T14 đột biến, có nguồn gốc từ chủng KC21 thuộc lồi X axonopodis pv citri, gen sinh bệnh pthA-KC21 bị gián đoạn chèn thêm đoạn Tn5, sử dụng để chích vào C unshiu C sinensis Quan sát suốt thí nghiệm cho thấy chủng KC21T14 tạo vết thối tổn thương lá, khơng có mụn mủ Ngồi ra, sau ngày tiêm chủng KC21T14, số lượng vi khuẩn phát triển vết thương tổn hai lồi Citrus đáng kể so với tiêm chủng hoang dại KC21 (Hình 2b) Vết tổn thương thí nghiệm lan rộng mức độ khác sau tiêm chủng hoang dại KC21, chủng KC21T14 chứa gen pthA-KC21 gây tổn thương nhỏ có kích thước tương đương (Bảng 2) Điều cho thấy gen pthA-KC21 liên quan tới lan rộng vết thương tổn Những kết gen sinh bệnh pthA-KC21 vi khuẩn KC21T14 không liên quan tới khác biệt độ nhạy với vi khuẩn lồi Citrus, gen góp phần tạo triệu chứng loét (Brunings Gabriel 2003) Ngoài ra, sau tiêm KC21T14, lai tạo C sinensis có lan rộng tổn thương lớn giống nhau; C Unshiu tổn thương Những kết cho thấy gen nhân C sinensis có độ nhạy lớn vi khuẩn X axonopodis pv citri Ý nghĩa Từ kết nghiên cứu cho thấy, độ nhạy bệnh loét có múi phụ thuộc vào gen nhân chủ; từ đó, đưa hướng nghiên cứu gen nhân chủ để tìm cách phòng trị bệnh tốt cho lồi có múi * Những nghiên cứu, ứng dụng Việt Nam: Ở Việt Nam, lồi có múi thường xuất bệnh loét làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất phẩm chất trái Bệnh xuất cành, non trái, dễ thấy trái Bệnh loét thể hai mặt gây hại vỏ trái làm giảm giá trị thương phẩm, phần thịt múi trái bị chai, điều kiện ẩm độ cao trái bệnh bị nứt chảy nhựa cuối trái vàng rụng Cành non thường bị nhiễm nặng, đốm sần sùi đóng dày đặc làm khơ chết cành Hiện nay, nước ta chưa có nhiều nghiên cứu bệnh loét có múi vi khuẩn X axonopodis pv Citri gây Các nghiên cứu bệnh loét chủ yếu tập trung vào việc phòng trừ khả gây bệnh hướng điều trị mắc bệnh cách phun loại thuốc Kasumin, Starner, Physan… ... kính 0,5 mm) - Sau đó, đem tiêm vi khuẩn trồng nhà kính - Đo đường kính vòng tròn tổn thương lá, bao gồm mô bần phần mép xung quanh sũng nước - Quan sát phát triển vi khuẩn tổn thương 0, 1, 2,