Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số – 2010 PHÂN LOẠI VÀ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI THÍCH HỢP CHO SINH TRƢỞNG VÀ TỔNG HỢP COQ10 Ở CHỦNG NẤM MEN PL5-2 Trần Thị Lệ Quyên, Đào Thị Lƣơng Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội I ĐẶT VẤN ĐỀ Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), hợp chất giống vitamin ưa béo nằm hệ thống vận chuyển điện tử bám màng prokaryote eukaryote, cấu tạo vòng benzoquinone chuỗi polyisoprene kị nước CoQ10 sử dụng hiệu điều trị bệnh tim mạch, đồng thời liệu pháp hỗ trợ điều trị statin (Folkers et al., 1990), bệnh liên quan đến chuỗi hô hấp ti thể (Geromel et al., 2002) Nhờ hoạt tính chống oxi hóa hay chức tăng cường miễn dịch CoQ10 mà nhà y dược học quan tâm đến tác dụng kháng ung thư đầy tiềm (Lockwood, Moesgaard, Forkers, 1994) [3] Ngồi ra, CoQ10 ứng dụng rộng rãi ngành cơng nghiệp mỹ phẩm, sử dụng chất chống oxy hóa, chống lão hóa để giúp thể trẻ hóa [1] CoQ10 sản xuất từ ba phương pháp: lên men (tổng hợp sinh học), tổng hợp hóa học tách chiết từ mô động vật Tổng hợp sinh học CoQ10 sử dụng nhiều so với tổng hợp hóa học tách chiết từ mơ động vật [3, 9] Có nhiều vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn (Agrobacterium, Rhodobacter, Paracoccus ) nấm men (Candida, Rhodotorula, Saitoella, Schizosaccharomyces ) công bố sinh vật sản xuất CoQ10 Đặc biệt, nghiên cứu chọn lọc chủng dại sinh CoQ10 cao tìm chủng Agrobacterium tumefaciens ATCC 4452 (1,9 mg CoQ10/g sinh khối khô), Rhodobacter sphaeroides FERM-P4675 (2,7 mg CoQ10/g sinh khối khô) Paracoccus denitrificans ATCC 19367 (0,86 mg CoQ10/g sinh khối khô) Để tăng cao hiệu sản xuất CoQ10, phương pháp đột biến áp dụng Chủng đột biến A tumefaciens AU-55 sản sinh 180 mg CoQ10/l dịch lên men 58 h với hàm lượng CoQ10 4,5 mg/g sinh khối khô Chủng đột biến R sphaeroides Co-22-11 sản xuất CoQ10 346,8 mg/l với hàm lượng 8,7 mg/g sinh khối khơ điều kiện thơng khí giới hạn Theo Yoshida cs (1998), điều kiện ôxi thấp, cấu trúc nhiều lớp màng chứa CoQ10 phát triển mạnh mẽ [4, 5] Trong nghiên cứu trước, tiến hành sàng lọc chủng vi sinh vật có khả sinh CoQ10 ghi nhận chủng nấm men PL5-2 sinh hàm lượng CoQ10 cao (2,2 mg/g sinh khối khô) [1] Chủng nấm men phân lập thu từ vườn Quốc gia Phong Nha-Kẻ Bàng Trong nghiên cứu này, tiến hành phân loại chủng nấm men PL5-2 nghiên cứu điều kiện ni thích hợp cho sinh trưởng tổng hợp CoQ10 Đồng thời, so sánh đánh giá phương pháp tách chiết CoQ10 hiệu II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu Chủng nấm men PL 5.2 lưu giữ Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật [1] 2.2 Phƣơng pháp 2.2.1 Phân loại nấm men - Quan sát hình thái khuẩn lạc tế bào nấm men theo phương pháp Yarrow (1998) - Phân loại nấm men sinh học phân tử: DNA tổng số chủng PL5-2 tách chiết theo Manitis [11] Phản ứng PCR nhân đoạn gen D1/D2 sử dụng cặp mồi NL1/NL4 tiến hành theo Kurtzman Robnnet (1998) [10] Trình tự rDNA 26S đoạn D1/D2 xác định theo phương pháp Kurtman Robnett (1997), sử dụng phần mềm CLUSTAL X Thompson cộng (1997) Các trình tự tham khảo dùng nghiên cứu phát sinh chủng loại lấy từ liệu GenBank Cây phát sinh xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp J Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Saitou Nei (1987); phân tích bootstrap (Felsenstein, 1985) thực từ 1000 lần lặp lại ngẫu nhiên [1] 2.2.2 Nuôi cấy nấm men Chủng PL 5.2 lên men dịch thể môi trường YM (g/l): glucose - 10; pepton - 5; cao nấm men - 3; cao malt - 3; pH-6,5) thu sinh khối dùng cho thí nghiệm tách chiết CoQ10 2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng nấm men sinh tổng hợp CoQ10của chủng PL5.2 - Độ thơng khí: ni lắc 200 vòng/phút hiếu khí kị khí khơng nghiêm ngặt [7, 14] - Chiếu sáng: ni hiếu khí có chiếu sáng không chiếu sáng [7, 14] - Các tiền tố tự nhiên: thí nghiệm tiến hành theo phương pháp Bule Singhal (2009) với hai đối chứng nước ép cà chua, cà rốt nguyên chất môi trường YM [3] 2.2.4 Tách chiết phân tích CoQ10 Để tìm phương pháp tách chiết CoQ10 hiệu nhất, phương pháp tách chiết CoQ10 khảo sát: phương pháp tiến hành theo Seo J H (2008) [8]; phương pháp thực theo Bule Singhal (2009) [3]; phương pháp theo Seo J H cộng (2005) với số thay đổi [12]; phương pháp theo Yen H W Shih T Y (2009) [15]; phương pháp thực theo Zhong W cộng (2009) [17]; a Số – 2010 phương pháp tiến hành theo Lê Thành Phước (2005) [2]; phương pháp theo Kim cộng (2010) [13] phương pháp thực theo Zhang cộng (2007) [16] Phân tích CoQ10 phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) theo Matsumura cộng (1983) Takahashi cs cộng (2003) [7, 8] Dịch chiết CoQ10 phân tích HPLC (Aligent 1200, USA) cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 mm x 4,6 mm) sử dụng ethanol làm pha động với tốc độ dòng chảy ml/phút, nhiệt độ cột 35°C CoQ10 định lượng dựa vào phương trình tuyến tính diện tích đỉnh hấp phụ CoQ10 bước sóng 275 nm hàm lượng CoQ10 chuẩn Hàm lượng CoQ10 nội bào tính đơn vị mg/g sinh khối tế bào khơ (mg/DW) Thí nghiệm lặp lại lần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vị trí phân loại chủng nấm men PL5.2 - Quan sát hình thái: khuẩn lạc chủng nấm men PL 5.2 có dạng tròn, kích thước 12 mm, màu cam đỏ, bề mặt khuẩn lạc nhẵn, bóng, lồi đều, khơng tiết sắc tố vào môi trường sau ngày nuôi thạch YM Tế bào có dạng trứng que ngn, kớch thc 1,0-1,5 ì 1,6 - 2,8 àm, sinh sản nảy chồi b Hình Hình thái khuẩn lạc (a) tế bào (b) chủng nấm men PL 5.2 J Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học - Phân tích trình tự đoạn D1/D2 ADNr 26S: ADN tổng số chủng nấm men PL52 tách chiết dùng làm khuôn để khuếch đại đoạn D1/D2 ADNr 26S phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi NL1 NL4 Trình tự 600 bp xác định Chương trình Blast sử dụng để so sánh độ tương đồng với trình tự lồi có quan hệ họ hàng gần GenBank Cây phả hệ xây dựng dựa trình tự đoạn D1/D2 ADNr 26S chủng nghiên cứu với 12 lồi có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Rhodosporidium, Rhodotorula Sporobolomyces Occultifur externus Số – 2010 sử dụng làm nhóm ngồi Quan sát phân loại cho thấy chủng nghiên cứu nằm vị trí với Rhodosporidium paludigenum với độ lặp lại 100% phả hệ (Hình 2) Trình tự DNAr 26S đoạn D1/D2 chủng nấm men PL5.2 có mức độ tương đồng 100% (600/600 bp) so với chủng chuẩn loài Rhodosporidium paludigenum Kết hợp đặc điểm hình thái trình tự DNAr, khẳng định chủng PL5.2 thuộc lồi Rhodosporidium paludigenum 75 Rhodotorula glutinis var glutinis_ AF070430 93 Rhodotorula graminis_AF070431 100 Rhodosporidium babjevae_ AF070420 67 Rhodosporidium diobovatum_ AF070421 Rhodotorula araucariae_ AF070427 78 90 Rhodosporidium kratochvilovae_ AF071436 100 Rhodosporidium paludigenum_ AF070424 71 0.02 PL5.2 100 Rhodosporidium sphaerocarpum_ AF070425 Rhodotorula glutinis var dairenensis_AF070429 82 Sporobolomyces alborubescens_ AF207886 100 Rhodotorula mucilaginosa_ AF070432 Rhodosporidium toruloides_ AF070426 Occultifur externus_AF189909 Hình Cây phát sinh chủng loại chủng PL5.2 với lồi có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự D1/D2 DNAr 26S 3.2 Ảnh hƣởng độ thơng khí ánh sáng đến sinh trƣởng nấm men tổng hợp CoQ10 Trong chiến lược khai thác sản phẩm sinh học quy mô công nghiệp thường bao gồm bước: tìm kiếm nguồn khai thác, cải biến di truyền tăng xuất tối ưu điều kiện sản xuất [5] Tuy nhiên, số nghiên cứu, bước cải biến di truyền khơng sử dụng, thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng yếu tố ni cấy đến khả sinh hợp chất sinh học chủng dại tiến hành sau sàng lọc[3] Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng số yếu tố môi trường đến sinh trưởng tổng hợp CoQ10 khảo sát chủng dại PL 5-2 Chủng nấm men PL 5-2 thu sinh khối phân tích CoQ10 sau ngày ni cấy hiếu khí kị khí tùy tiện mơi trường YM dịch thể, kết cho thấy điều kiện ơxi, chủng nghiên cứu sinh trưởng chậm (sinh khối giảm 2/3) cho hàm lượng CoQ10 1,2 mg/g DW (giảm 1/2) so với lên men hiếu khí 2,3 mg/g DW Trong đó, khác biệt sinh trưởng tổng hợp CoQ10 ni hiếu khí chủng nấm men PL 5-2 có chiếu sáng khơng chiếu sáng không ghi nhận Ha cộng (2007) sản xuất CoQ10 chủng đột biến Agrobacterium tumefaciens KCCM 10413 đạt 9,05 mg/g DW[6], Kiên cộng (2010) thu CoQ10 với hàm lượng 6,34 mg/g DW chủng đột biến Rhodobacter sphaeroides KACC 91339P ni cấy điều kiện lên men hiếu khí, khơng chiếu sáng[9] Trong đó, lồi vi khuẩn chủng dại Rhodobacter sphaeroides BCRC 13100, Yen Shih (2009) nghiên cứu J Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Sinh khối (g/100 ml), CoQ10 (mg/DW) điều kiện chiếu sáng thơng khí để đạt hàm lượng CoQ10 cao 3,5 mg/g DW, ½ so với chủng độ biến[15] Như vậy, chủng dại PL 5-2 có hàm lượng CoQ10 Số – 2010 đạt 2,3 mg/g DW, sử dụng đột biến chủng dại mang đến hy vọng tạo chủng cho hàm lượng CoQ10 cao 3,5 2,5 Kị khí Hiếu khí 1,5 0,5 Sinh khối CoQ10 Hình Ảnh hưởng độ thơng khí đến sinh trưởng sinh tổng hợp CoQ10 chủng nấm men PL5-2 biến đổi trực tiếp thành carotenoid, để tạo CoQ10 cần góp mặt sáu phân tử IPP Vào năm 1981, Natori Nagasaki phát tiền tố quan trọng polyprenyl pyrophosphate có carot cà chua [3] 3.3 Ảnh hƣởng tiền tố tự nhiên đến sinh trƣởng nấm men sinh tổng hợp CoQ10 Con đường sản xuất carotenoid CoQ10 có chung chất trung gian geranylgeranyl diphosphate, sau chất Sinh khối (g/100ml), CoQ10 (mg/DW) 2,5 Sinh khối 1,5 CoQ10 0,5 M Y 25 C R 50 C R 10 C R C R 25 C C 50 C C 10 C C C C Mơi trường Hình Ảnh hưởng môi trường nước chiết cà chua cà rốt đến sinh trưởng tổng hợp CoQ10 tế bào nấm men CC-cà chua 100%; CC25- cà chua 25%+YM; CR50- cà rốt 50%+YM; CC100-cà chua 100%+YM; CR-cà rốt 100%; CR25- cà rốt 25%+YM CC50- cà chua 50%+YM; CR100-cà rốt 100%+YM; YM- môi trường YM J Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 10 Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Chủng PL5-2 nuôi cấy môi trường nước chiết cà chua cà rốt, sau ngày thu sinh khối tách CoQ10, kết hình cho thấy: loại nước chiết có ảnh hưởng tích cực đến hàm lượng CoQ10, nồng độ nước chiết cà chua 50% nước chiết cà rốt 50-100% (có bổ sung khống YM) làm tăng hàm lượng CoQ10 lên gần 5% (2,4 mg/g DW) 10-15% (2,52,6 mg/g DW), tương ứng Trong đó, với nồng độ đậm đặc nước ép cà chua (100%), chủng PL5-2 sinh trưởng (2,1mg/gDW) so với đối chứng YM (2,3 mg/g DW) Đối với môi trường có nước ép ngun chất khơng bổ sung thành phần YM cho hàm lượng CoQ10 ngang với mơi trường YM Kết thí ngiệm phù hợp với công bố Bule Singhal (2009), báo cáo tiền tố tự nhiên polyprenyl pyrophosphate có cà chua cà rốt làm tăng 56-87% Số – 2010 CoQ10 Pseudomonas diminuta đơn vị nuôi cấy so với môi trường tối ưu không bổ sung tiền tố [3] 3.4 Tách chiết phân tích CoQ10 Sau lên men mơi trường cà rốt 100%( bổ sung khoáng YM), tế bào nấm men thu, rửa môi trường tách chiết phương pháp khác nhau, kết cho thấy so với phương pháp dùng để tách chiết CoQ10 suốt trình nghiên cứu (đạt 2,6 mg/g DW), hiệu suất phương pháp 1, tăng tương ứng 4% (2,7 mg/g DW), 10% (2,9 mg/g DW) 20% (3,1 mg/g DW); phương pháp còm lại (phương pháp 3, 4, 7, 9) cho hiệu tách chiết thấp từ 827% (1,9-2,4 mg/g DW) Phương pháp có thời gian thí nghiệm ngắn, hóa chất phổ biến sẵn có nên lựa chọn làm phương pháp tách chiết CoQ10 3,5 Hàm lượng CoQ10 (mg/g DW) 2,5 1,5 0,5 PP1 PP2 PP3 PP4 PP5 PP6 PP7 PP8 Các phương pháp tách CoQ10 Hình Tách chiết CoQ10 từ tế bào nấm men PL5-2 phương pháp tách CoQ10 khác IV KẾT LUẬN Chủng nấm men PL5-2 có ubiquinone chủ yếu CoQ10, định tên Rhodosporidium paludigenum dựa vào hình thái tế bào, khuẩn lạc phân tích trình tự đoạn gen D1/D2 ADNr 26S Sinh trưởng sinh tổng hợp CoQ10 chủng nấm men PL5-2 đạt cao nuôi hiếu khí Điều kiện chiếu sáng khơng có tác động rõ rệt lên khả tổng hợp CoQ10 Khi bổ sung tiền tố tự nhiên CoQ10 có cà chua cà rốt vào môi trường nuôi cấy làm tăng hàm lượng sinh tổng hợp CoQ10 tương ứng lên 3-5% 10-15% Trong số phương pháp tách chiết CoQ10 khảo sát, phương pháp 1, 5, cho hiệu tách tốt Phương pháp có thời gian thực nhanh, hóa chất thơng dụng sẵn có nên lựa chọn để tách chiết CoQ10 J Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 11 Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đào Thị Lương, Trần Thị Lệ Quyên (2009), “Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm phân loại chủng nấm men sinh CoQ10, phân lập Việt Nam”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Chuyên san Công nghệ Sinh học, số 5, trang 8-14 Lê Thành Phước (2005), Gốc tự chất chống oxy hóa Y – Dược, Đại Học Dược Hà Nội Tiếng Anh Bule M.V., Singhal R.S (2009), “Use of carrot juice and tomato juice as natural precursors for enhanced production of ubiquinone-10 by Pseudomonas diminuta NCIM 2865”, Food chemistry, 116: pp 302-305 Cheng B., Yuan Q.P., Sun X.X., Li W.J (2010), “Enhanced production of Coenzyme Q10 by overexpressin HMGCoA reductase and induction with arachidonic acid in Schizosaccharomyces pombe”, Appl Biochem Biotechnol, 160: pp 523-531 Choi J.H., Ryu Y.W., Seo J.H (2005), “Biotechnological production and applications of coenzyme Q10”, Appl Microbiol Biotechnol 68: pp 9-15 Ha S.J., Kim S.Y., Seo J.H., Oh D.K., Lee J.K (2007) Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for coenzyme Q10 production by Agrobacterium tumefaciens Appl Microbiol Biotechnol 74:974-980 Jeong K.S., Dao T.N.V, Kien N and Kim J.K (2008), “Effects of pH and light irradiation on coenzyme Q10 production using Rhodobacter sphaeroides”, J Fish Sci Technol 11(4): pp 219-223 Jeong S.K., Ahn S.C., Kong I.S and Kim J.K (2008), “Isolation and identification of a photosynthesis bacterium containing a high content of coenzyme Q10”, J Fish Sci Technol 11(3): pp 172-176 Kien N.B., Kong I.S., Lee M.G, Kim J.K (2010) “Coenzyme Q10 production in a 150 l reactor by a mutant strain of Số – 2010 Rhodobacter sphaeroides”, J Fish Sci Technol, 37: pp 521–529 10 Kurtzman C.P and Robnnet C.J (1998), “Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences”, Antonie van Leeuwenhoek 67: pp 151-171 11 Manitis T., Fritsch E.F., Sambrook J (1982), “Molecular cloning: a laboratory manual Cold Spring Harbor laboratory: Cold Spring Harbor”, New York U.S.A pp 187-209 12 Park Y.C., Kim S.J., Choi J.H., Lee W.H., Park K.M., Kawamukai M., Ryu Y.W., Seo J.H (2005), „Batch and fedbatch production of coenzyme Q10 in recombinant Escherichia coli containing the decaprenyl diphosphate synthase gene from Gluconobacter suboxydans”, Appl Microbiol Biotechnol 67: pp 192–196 13 Seo, M J and Kim S.O (2010), “Effect of Limited Oxygen Supply on Coenzyme Q10 Production and Its Relation to Limited Electron Transfer and Oxidative Stress in Rhizobium radiobacter T6102”, J Microbiol Biotechnol, 20(2): pp 346–349 14 Yen H.W., Chiu C.H (2007), “The inluences of aerobic-dark and anaerobiclight cultivation on CoQ10 production by Rhodobacter sphaeroides in the submerged fermenter”, Enzyme and Technology 41: pp 600-604 15 Yen H.W and Shih T.Y., (2009), “Coenzyme Q10 production by Rhodobacter sphaeroides in stirred tank and in airlift bioreactor”, Bioprocess Biosyst Eng, 32: pp 711-716 16 Zhang D., Shrestha B., Li Z., Tan T., (2007), “Ubiquinone-10 production using Agrobacterium tumefaciens dps gene in Escherichia coli by coexpression system”, Mol Biotechnol, 35(1): pp.1-14 17 Zhong W., Fang J., Liu H., Wang X., (2009), Enhanced production of CoQ10 by newly isolated Sphingomonas sp ZUTEO3 with a coupled fermentation– extraction process, J Ind Microbiol Biotechnol, 36: pp 687–693 J Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 12 Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số – 2010 SUMMARY TAXONOMIC STUDY OF YEAST STRAIN PL5-2 AND OPTIMIZATION OF CULTURAL CONDITIONS FOR GROWTH AND COQ10 PRODUCTION Tran Thi Le Quyen, Dao Thi Luong Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi Coenzyme Q10 (CoQ10) functions in the mitochondrial respiratory chain and serves as a lipophilic antioxidant There is an increasing interest in the use of CoQ10 as a nutritional supplement and cosmetic ingredient It is known that CoQ10 is produced in a wide variety of organisms, from microorganisms such as bacteria and yeasts, to higher animals and plants In previous study, yeast strain PL 5-2 isolated from leaf in Phongnha-Kebang national park produced the highest amount of CoQ10 Colony and cell morphologies as well as and D1/D2 26S rDNA sequence analysis idenified the strain PL 5-2 as Rhodosporidium paludigenum Optimization of cultural conditions such as oxygen supply, light irradiation and natural precursors was performed in order to improve the production of CoQ10 The results showed that additional aeration condition was improved the yeast growth and CoQ10 production but not for light irradiation CoQ10 production of the yeast was considerably increase of 10-15% and 3-5% by adding natural precursors of CoQ10 from carrot and tomato juices, respectively Of methods selected for CoQ10 extraction, the methods 1, and demonstrated highly effective protocols for extracting CoQ10 from the yeast *Cơng trình hỗ trợ kinh phí từ đề tài: “Tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm men sinh Coenzym Q10 nhằm ứng dụng lĩnh vực y học mỹ phẩm”- QG09-47 * Người thẩm định: GS.TS Phạm Văn Ty J Genetics and Applications – Special Issue: Biotechnology Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National University, Hanoi 13 ... 5; cao nấm men - 3; cao malt - 3; pH-6,5) thu sinh khối dùng cho thí nghiệm tách chiết CoQ10 2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng nấm men sinh tổng hợp CoQ10của chủng. .. 1,5 0,5 Sinh khối CoQ10 Hình Ảnh hưởng độ thơng khí đến sinh trưởng sinh tổng hợp CoQ10 chủng nấm men PL5-2 biến đổi trực tiếp thành carotenoid, để tạo CoQ10 cần góp mặt sáu phân tử IPP Vào năm... lạc phân tích trình tự đoạn gen D1/D2 ADNr 26S Sinh trưởng sinh tổng hợp CoQ10 chủng nấm men PL5-2 đạt cao nuôi hiếu khí Điều kiện chiếu sáng khơng có tác động rõ rệt lên khả tổng hợp CoQ10 Khi