PHÂN TÍCH MỘT SỐ ẢNH HƯỞNG CỦA ARSENATE LÊN RỄ CÂY LÚA ORYZA SATIVA L Ở MỨC ĐỘ SINH HÓA VÀ PHIÊN MÃ Nguyễn Thị Thúy Quỳnh1*, Hoang Tsai-Lien 2 Khoa Sư phạm, Trường Đại học Giáo dục, Đại học Quốc gia Hà nội Khoa Khoa học sống, Trường Đại học Quốc gia Cheng Kung, Taiwan, ROC TĨM TẮT Sự nhiễm Arsenate (AsV) nguồn nước ngầm ảnh hưởng nguy hại đến sức khỏe người Bên cạnh đó, AsV gây ức chế chức nội bào, phá hủy trình trao đổi chất làm giảm phát triển thực vật trồng vùng nhiễm AsV Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành phân tích biến đổi sớm hệ rễ lúa 24h đáp ứng với AsV nồng độ thấp (10 μM) Kết hoạt tính số enzyme chống oxy hóa catalase, peroxidase hàm lượng glutathione thay đổi sau 12h 24h xử lý với AsV Bằng kỹ thuật microarray, số lượng lớn gen thay đổi mức độ biểu phát Phần lớn gen có mức độ biểu tăng thuộc nhóm gen giữ vai trò quan trọng q trình trao đổi chất chức phân tử tế bào thực vật Các gen có mức độ biểu giảm liên quan đến q trình chuyển hóa lipid hợp chất thực vật thứ sinh Nhiều gen tham gia vào q trình khử độc thực vật có mức độ biểu tăng cytochrome P450 (CYP), glutathione-S-transferase (GST) UDP-glycotranferase (UGT) Một số gen thuộc nhóm gen kiểm tra kỹ thuật PCR cho kết hồn tồn tương thích với kết phân tích liệu microarray Kết báo cáo cung cấp sở phân tử cho nghiên cứu sâu chức gen liên quan đến chống chịu AsV lúa nói riêng thực vật nói chung TỪ KHĨA: Arsenate, glutathione, microarray, Oryza sativa L MỞ ĐẦU Arsenate (AsV), dạng vô asen (thạch tín), chất gây nhiễm mơi trường gây độc cho sức khỏe người Nồng độ AsV nước ngầm nhiều quốc gia giới vượt giới hạn cho phép theo tổ chức Y tế giới [2] Nhiều tài liệu cho thấy ô nhiễm AsV nguồn nước tiềm ẩn nguy hại ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người việc tiêu thụ sản phẩm nông nghiệp canh tác vùng nhiễm AsV AsV chất cực độc gây ức chế chức nội bào, phá hủy trình trao đổi chất tế bào thực vật [13] Bên cạnh đó, ảnh hưởng AsV, thực vật bị biến đổi số q trình hóa sinh sinh lý tạo thành gốc oxy hóa, ức chế phát triển dẫn đến làm giảm sản lượng trồng Để đáp ứng với trình khử gốc oxy hóa khử độc kim loại, thực vật thường sản sinh enzyme thuộc nhóm chống oxy hóa catalase peroxidase, glutathione [9, 11] Một số nghiên cứu trước đề cập đến chế phân tử hóa sinh lúa chịu ảnh hưởng AsV nồng độ cao (25 μM) Tuy nhiên nghiên cứu chưa phân tích thay đổi mức độ phân tử mang tính tổng thể Vì vậy, mục đích nghiên cứu phân tích biến đổi sớm hệ rễ lúa mơi trường có AsV nồng độ thấp (10 μM) Bên cạnh những dẫn chứng thay đổi mức độ hóa sinh, chứng thay đổi mức độ phân tử thơng qua việc sử dụng chíp sinh học (RNA microarray) cung cấp sở cho nghiên cứu sâu nhằm tìm kiếm gen liên quan đến trình chống chịu AsV lúa VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Giống lúa TN-67 (Oryza sativa L.) cung cấp Khoa Khoa học sống, Trường đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài loan, ROC Phương pháp nghiên cứu Hạt lúa khử trùng theo Huang cộng [6] Hạt lúa nảy mầm sau ngày chiều dài rễ lúa đạt khoảng cm xử lý với natri arsenate (Na3AsO4.12H2O) với nồng độ khác (5, 10, 15, 25, 50 100 μM), mẫu đối chứng xử lý với nước cất 24 Protein tổng số từ rễ lúa sau 0, 12 24 xử lý với 10 μM AsV tách chiết đệm PBS pH 5.8, điện di gel polyacrylamide (4,5% gel cô 10% gel tách) với đệm chạy TBE pH 8,5 nhiệt độ 40C Sau điện di, gel thực phản ứng kết tủa màu với chất khác để phát băng isozyme Đối với catalase (CAT), gel ngâm H2O2 0,1% 3, 3’diaminobenzidine tetrahydrochlorid (DAB) nhiệt độ phòng 30 phút Sau gel ủ với FeCl3 30% K3Fe(CN)6 30% nhìn thấy băng Đối với peroxidase (POD), gel ngâm dung dịch natri citrate chứa 0,1% H2O2 0,1% DAB điều kiện tối nhiệt độ phòng băng xuất Rễ lúa sau 12 24 xử lý với AsV ủ với 3,3’-diaminobenzidine (DAB) (1mg/ml) 45 phút nhiệt độ phòng Sản phẩm H2O2 tạo thành mẫu nghiên cứu nhận biết qua màu nâu đậm Hàm lượng glutathione (GSH) tiến hành phân tích theo Anderson cộng [1] Rễ lúa xử lý với AsV sau 12 24 tách chiết dung dịch axit sulpho-salicylic 5%, ly tâm 10 phút 13,000 v/p Dịch thu lại ủ dung dịch gồm có 700μl NADPH 0,3 mM, 100 μl DTNB 50 μl glutathione reductase (10 units ml-1) Sản phẩm phản ứng khử GSH đo máy quang phổ bước sóng 412 nm ARN tổng số tách chiết từ rễ mẫu đối chứng mẫu xử lý với 10 μM AsV 24 kít RNAeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Đức) Kỹ thuật microarray thực phòng thí nghiệm ADN microarray - Viện Sinh học, Taiwan Dữ liệu microarray xử lý phần mềm chuyên dụng GenSpringGX11 Rank Products Phân tích nhóm gen chức phần mềm chuyên biệt EasyGO [15] Tiến hành kỹ thuật PCR với số gen lựa chọn từ kết microarray 0,5 μg ARN tổng số sử dụng để tổng hợp cDNA ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, USA) với mồi oligo (dT)15 Khuyếch đại số gen lựa chọn phản ứng PCR máy luân nhiệt (BioRad) với chu kỳ nhân gen thiết kế sau: 940C phút; 30-35 chu kỳ: 940C 15 giây, 550C 30 giây, 720C 60 giây; 720C 10 phút Gen tubulin sử dụng đối chứng nội nhằm chứng tỏ mức độ biểu mẫu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tơi đánh giá độc tính AsV thông qua ức chế phát triển rễ lúa với nồng độ khác từ đến 100 μM Kết hình cho thấy rễ lúa bị ức chế hoàn toàn nồng độ 25 μM, chiều dài rễ lúa giảm gần nửa so với mẫu đối chứng 10 μM Do chúng tơi sử dụng nồng độ 10 μM cho nghiên cứu sâu Chiều dài rễ (cm) 5 10 15 25 50 100 Nồng độ AsV (μM) Hình Chiều dài rễ lúa ảnh hưởng arsenate (AsV) Trong nghiên cứu này, để đánh giá hình thành gốc oxy hóa rễ lúa tác động AsV, tiến hành nhuộm với 3-3’-diaminobenzidine (DAB) Kết cho thấy sau 12 24 giờ, rễ lúa bị xử lý với AsV (hình b,c) chuyển thành mầu nâu đậm so với mẫu đối chứng (hình 2a) Điều kết phản ứng hóa học thuốc nhuộm DAB H2O2 Ở thực vật, hệ thống bảo vệ chống oxy hóa thực nhiều enzyme oxy hoa khử catalase (CAT) peroxidase (POD) Hai enzyme giữ vai trò quan trọng việc phân hủy H2O2 nhiều loài thực vật tác dụng kim loại nặng yếu tố gây stress [5, 7] Kết phân tích điện di gel polyacrylamide cho thấy hoạt tính CAT POD lúa bị giảm sau 12 24 đáp ứng với AsV (Hình d,e) Sự giảm hoạt tính enzyme phá hủy peroxisomal protease thực vật bị tác động kim loại nặng (Sandalio et al.) [14] Hơn nữa, hoạt tính enzyme chống oxy hóa tăng cao thực vật chịu tác động kim loại mạnh thời gian kéo dài [11] Hình Ảnh hưởng AsV sau 12 24 lên hình thành H2O2 (a-c) hoạt tính catalase (d) peroxidase (e) rễ lúa Bên cạnh đó, hợp chất glutathione (GSH) có vai trò quan trọng phản ứng oxy hóa khử thực vật khử độc kim loại nặng [9] Hình cho thấy hàm lượng GSH sau 12 24 xử lý với AsV giảm so với mẫu đối chứng Trong nghiên cứu trước chúng tôi, giảm hàm lượng GSH quan sát thấy rễ lúa tác dụng với μM AsIII sau 12 24 [12] Li cộng (2005) rằng, hàm lượng GSH Arabidopsis giảm sau 48 xử lý với 75 μM AsV [8] Điều Hartley-Whitker cộng (2001) lý giải, As hấp thu vào thực vật hàm lượng GSH giảm nhanh tạo thành phytochelatin (PCs) dẫn đến thay đổi nồng độ gốc oxy hóa enzyme chống oxy hóa tế bào thực vật [5] Hàm lượng GSH (nmol-1 g TL) 50 40 30 20 10 ĐC 12h- 10 μM AsV 24h- 10 μM AsV Hình Ảnh hưởng AsV lên hàm lượng glutathione rễ lúa Trong thập kỷ gần đây, việc sử dụng chip sinh học (microarray) có ý nghĩa vơ quan trọng việc xác định mức độ biểu phiên mã hàng nghìn gen Vì vậy, để hiểu rõ chế phân tử lúa ảnh hưởng AsV, chúng tơi tiến hành phân tích hệ phiên mã chúng với mong muốn tìm kiếm gen liên quan đến trình chống chịu AsV Kết phân tích cho thấy sau 24 đáp ứng với AsV, số lượng gen có mức độ biểu tăng 427 giảm 187 Chúng tiến hành phân loại nhóm gen giả định phần mềm chuyên biệt EasyGO Kết cho thấy phần lớn gen có biểu tăng có vai trò quan trọng trình trao đổi chất chức phân tử tế bào (bảng 1) Các gen mã hóa cho protein tham gia vào trình tổng hợp axit jasmonic, đáp ứng với stress, trình trao đổi chất tế bào Kết phân tích cho thấy nhiều gen tham gia vào trình khử độc thực vật cytochrome P450 (CYP), glutathione-S- transferase (GST) UDP-glycotranferase (UGT) tăng cường biểu (bảng 1) Kết tương tự với kết nghiên cứu trước số nghiên cứu khác [2, 4, 12] Bên cạnh đó, chúng tơi nhận thấy có số lượng gen có mức độ biểu giảm liên quan đến q trình chuyển hóa lipid hợp chất thực vật thứ sinh Nhiều nghiên cứu chứng minh trình khử độc tế bào nhiều lồi sinh vật có tham gia nhóm gen Cytochrome P450 monooxygenases (CYP) UDP-glucosyltransferases (UGT) [9] Mức độ biểu khác gen CYP phát rễ lúa bị xử lý với 25 μM AsV [2] Đặc biệt, gen mã hóa Glutathione S- transferase (GST) giữ vai trò quan trọng việc khử độc chất ngoại lai, có vai trò enzyme có khả xúc tác cho phản ứng kết hợp độc tố với GSH chuyển hợp chất tới không bào thực vật [11] Kết bảng cho thấy hầu hết mức độc biểu gen mã hóa GST tăng gấp lần so với mẫu đối chứng Kết hợp với kết nghiên cứu công bố, chúng tơi khẳng định vai trò khử độc sớm CYPs, UTG, GST rễ lúa bị xử lý với AsV Bảng Kết phân tích số lượng gen rễ lúa đáp ứng với AsV Thuật ngữ Chức gen giả định gen giả định (GO) Tăng mức độ biểu GO:0009861 Tổng hợp axit jasmonic GO:0006950 Đáp ứng với stress GO:0044248 Quá trình trao đổi chất tế bào GO:0019825 Cytochrome P450 monooxygenases GO:0004364 Hoạt tính Glutathione S- transferase GO:0008194 Hoạt tính UDP-glycosyltransferase (UGT) GO:0003824 Hoạt tính catalytic Giảm mức độ biểu GO:0012505 Gen thuộc hệ thống nội màng GO:0008146 Hoạt tính sulfotransferase GO:0006629 Q trình chuyển hóa lipid GO:0019748 Q trình chuyển hóa chất thực vật thứ cấp Số lượng gen 52 33 11 28 14 225 53 20 11 Bảng Mức độ biểu điều hòa tăng gen mã hóa cho GST Tên gen OsGSTU5 OsGSTU7 OsGSTU8 OsGSTU19 OsGSTU21 OsGSTU22 OsGSTU24 OsGSTU36 OsGSTU37 OsGSTU39 OsGSTU40 OsGSTU47 OsGSTU48 Locus gen Mức độ biểu Os09g0367700 Os01g0949700 Os10g0529700 Os10g0527400 Os10g0525500 Os10g0525600 Os10g0528100 Os01g0949800 Os01g0949900 Os01g0692100 Os01g0692000 Os10g0481300 Os10g0530600 18.36 13.22 23.85 44.80 11.78 27.56 23.20 10.43 19.79 51.15 9.72 33.90 8.29 Để khẳng định kết thay đổi mức độ biểu gen từ kết microarray, tiến hành lựa chọn số gen có mức độ biểu tăng Cytochrome P450 monooxygenase (Os03g0760200) gen mã hóa Glutathione-Stransferase (OsGSTU19 OsGSTU22 OsGSTU40) Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy mức độ biểu gen hoàn toàn phù hợp với kết thu từ liệu microarray (hình 4) 12 24 Tub Os03g0726100 Glutathione-S-transferase (OsGSTU19) Os10g0527400 Glutathione-S-transferase (OsGSTU22) Os10g0525600 Glutathione-S-transferase (OsGSTU40) Os01g0692000 Cytochrome P450 monooxygenases Os03g0760200 Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phân tích mức độ biểu số gen rễ lúa sau 24 đáp ứng với AsV KẾT LUẬN Một số đặc điểm hóa sinh rễ lúa Oryza Sativa L hoạt tính chất chống oxy hóa catalase, peroxidase glutathione bị thay đổi bị xử lý với AsV 12 24 Bằng kỹ thuật microarray, phát số lượng lớn gen thay đổi mức độ biểu rễ lúa ảnh hưởng AsV 24 Phần lớn gen mã hóa cho protein tham gia vào trình trao đổi chất trình khử độc AsV gen mã hóa cho Cytochrome P450 monooxygenase, UDP-glucosyltransferase Glutathione-S-transferase Các gen có mức độ biểu tăng kiểm chứng lại kỹ thuật điện di PCR Kết báo cáo sở phân tử cho nghiên cứu sâu chức gen liên quan đến tính chống chịu arsenate lúa nói riêng thực vật nói chung TÀI LIỆU THAM KHẢO Anderson M.D, Prasad T.K, Stewart C.R 1995 Changes in isozyme profiles of catalase, peroxidase, and glutathione reductase during acclimation to chilling in mesocotyls of maize seedlings Plant Physiology Vol 109 (4): 1247-1257 Chakrabarty D, Trivedi P.K, Mirsa P, Tiwari M et al 2009 Comparative transcriptome analysis of arsenate and arsenite stresses in rice seedlings Chemosphere Vol 74 (5): 688-702 Chakraborti D 2003 Arsenic Groundwater Contamination in Middle Ganga Plain, Bihar, India: A Future Danger? Environmental Health Perspectives Vol 111(9): 1194-1201 Gupta M, Sharma P, Sarin NB, Sinha AK 2009 Differential reponse of arsenic stress in two varieties of Brassica juncea L Chemosphere 74 (9): 1201-1208 Hartley-Whitker J, Ainsworth G, Meharg AA 2001 Copper- and arsenateinduced oxidative stress in Holcus lanatus L clones with differential sensitivity Plant, Cell and Environment Vol 24 (7): 713-722 Huang TL, Nguyen QTT, Fu SF, Lin CY, Chen YC, Huang HJ 2012 Transcriptomic changes and signalling pathways induced by arsenic stress in rice roots Plant Molecular Biology Vol 80 (6): 587-608 Li C, Feng S, Shoa Y, Jiang L, Lu X, Hou X 2007 Effects of arsenic on seed germination and physiological activities of wheat seedlings Journal of Environmental Sciences Vol 19 (6): 725-732 Li Y, Dhankher OP, Carreira L, Balish RS, Meagher RB 2005 Arsenic and mercury tolerance and cadmium sensitivity in Arabidopsis plants expressing bacterial ɣ-glutamylcysteine synthetase Environmental Toxicology and Chemistry Vol 24 (6): 1376-1386 Marrs KA 1996 The function and regulation of Glutathione S-transferase in plants Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol Vol 47: 127-58 10 Meharg A.A., Harley-Whitaker J 2002 Arsenic uptake and metabolism in arsenic resistant and nonresistant plant species New Phytologist Vol 154 (1): 29-43 11 Mishara S, Jha AB, Dubey RS 2011 Arsenite treatment induces oxidative stress, upregulates antioxidant system, and causes phytochelatin synthesis in rice seedlings Protoplasma Vol 248 (3): 565–577 12 Nguyen T.T.Q., Huang T.L., Huang H.J 2013 Analysis of early responses to arsenite stress in rice roots at biochemical and transcriptional level National biotechnology conferrance No 2: 1022-1026 13 Panda SK, Upadhyay RK, Nath S 2010 Arsenic stress in plants Journal of Agronomy and Crop Science Vol 196 (3): 161-174 14 Sandalio LM, Dalurzo HC, Gόmez M, Romero-Puertas MC, Río LA 2001 Cadmium-induced changes in the growth an oxidative metabolism of pea plants Journal of Experimental Botany, Vol 52 (364): 2115-2126 15 Zhou X, Su Z 2007 EasyGO: Gene Ontology-based annotation and functional enrichment analysis tool for agronomical species BMC Genomics 8:246 SUMMARY ANALYSIS OF SOME INFLUENCES OF ARSENATE TO ORYZA SATIVA L RICE ROOTS AT BIOCHEMICAL AND TRANSCRIPTIONAL LEVEL Nguyen Thi Thuy Quynh, Hoang Tsai-Lien Faculty of teacher education, University of Education, VNU Department Life Sciences, National Chengkung University, Taiwan, ROC Arsenate (AsV) contamination in groundwater resources impacts risky to human health Besides, it inhibits intracellular functions, destroy the metabolic process and reduces the growth of plants in AsV-contaminated areas In this study, we analyzed the early changes of the rice roots under AsV environment with low concentration (10 μM) The results indicated that the activity of some antioxidant enzymes such as catalase and peroxidase, and content of glutathione are reduce after 12h and 24h treatment with AsV A large number of genes with changed expression levels were detected using microarray technique Most of the increased genes belong to gene groups that play important role in metabolic process and molecular function of plant cells The genes related to the lipid metabolic process and secondary metabolism were down-regulated Many genes involved in the detoxification process in plants has also increased expression level, such as cytochrome P450 (CYP), glutathione S-transferase-(GST) and UDP-glycotranferase (UGT) Several genes which belong to this group were identified by PCR technique with the results compatible to the analyzed microarray data The results of this report provide the molecular basis for further research on the function of the AsV tolerantrelated genes in rice seedlings in particular and in plant general Địa liên hệ: - Địa chỉ: Khoa Sư phạm, Đại học Giáo dục, Đại học Quốc gia Hà nội - Điện thoại: - Email: CQ: 043.5539607 DĐ: 0904656493 baokhanh0808@yahoo.com.vn Quynhntt-bio@vnu.edu.vn .. .phân tử hóa sinh lúa chịu ảnh hưởng AsV nồng độ cao (25 μM) Tuy nhiên nghiên cứu chưa phân tích thay đổi mức độ phân tử mang tính tổng thể Vì vậy, mục đích nghiên cứu phân tích biến... phát số lượng lớn gen thay đổi mức độ biểu rễ lúa ảnh hưởng AsV 24 Phần lớn gen mã hóa cho protein tham gia vào q trình trao đổi chất trình khử độc AsV gen mã hóa cho Cytochrome P450 monooxygenase,... rễ lúa ảnh hưởng arsenate (AsV) Trong nghiên cứu này, để đánh giá hình thành gốc oxy hóa rễ lúa tác động AsV, tiến hành nhuộm với 3-3’-diaminobenzidine (DAB) Kết cho thấy sau 12 24 giờ, rễ lúa