Đang tải... (xem toàn văn)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINHLÂM THỊ TÚ ANHMỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEOLUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆPThành Phố Hồ Chí MinhTháng 102010BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINHLÂM THỊ TÚ ANHMỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEOChuyên ngành : Thú yMã số : 60.62.50LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆPHướng dẫn Khoa học:1.TS. NGUYỄN TẤT TOÀN2.TS. NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINHThành Phố Hồ Chí MinhTháng 102010MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEOLÂM THỊ TÚ ANHHội đồng chấm luận văn:1. Chủ tịch : PGS. TS NGUYỄN VĂN KHANHTrường Đại học Nông Lâm Tp. HCM2. Thư ký : PGS.TS NGUYỄN NGỌC TUÂNTrường Đại học Nông Lâm Tp. HCM3. Phản biện 1 : PGS. TS TRẦN ĐÌNH TỪHội Thú y Việt Nam4. Phản biện 2 : PGS. TS NGUYỄN NGỌC HẢITrường Đại học Y Phạm Ngọc Thạch Tp. HCM5. Ủy viên : TS. NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINHTrường Đại học Nông Lâm Tp. HCMĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINHHIỆU TRƯỞNGiLÝ LỊCH CÁ NHÂNHọ và tên : Lâm Thị Tú AnhNgày sinh : 19011980Nơi sinh : Thành phố Hồ Chí MinhHọ tên Cha : Lâm Minh ChiếnHọ tên Mẹ : Liễu Thị Kim ThúyQuá trình học tập−Năm 1998: Tốt nghiệp phổ thông trung học tại trường PTTT Trưng Vương, Quận 1, Tp. HCM−Năm 2003: Tốt nghiệp ngành Bác sỹ thú y tại Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM−Năm 2006: Học Cao học Thú y tại Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCMTình trạng hôn nhân: độc thânĐịa chỉ liên lạcEmail : lamthi_tuanhyahoo.comĐiện thoại : 0913 177 544iiLỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.Tác giảLÂM THỊ TÚ ANHiiiCẢM TẠNhững năm học cao học đã đi qua cùng với hơn 12 tháng thực hiện đề tài. Trong những ngày tháng đó, tôi đã học hỏi được rất nhiều kiến thức cả chuyên môn lẫn trong cuộc sống. Để có được như ngày hôm nay tôi không thể quên được công ơn của Cha Mẹ, người đã sinh ra, dạy dỗ, vất vả lo toan và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được ăn học nên người. Tôi xin được khắc ghi lòng kính trọng và nhớ ơn Thầy Nguyễn Tất Toàn cùng Cô Nguyễn Thị Phước Ninh đã hết lòng dìu dắt, hướng dẫn tôi hoàn thành đề tài, luôn chia sẻ và động viên tôi những lúc khó khăn nhất.Cảm ơn BGH Trường ĐHNL Tp. HCM, BCN Khoa CNTY, Quý Thầy Cô trong Khoa luôn hết lòng vì học trò. Cảm ơn Bệnh viện Thú y và Trung tâm Thú y vùng 6, đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài.Xin cảm ơn tất cả các anh chị, bạn bè đã luôn bên cạnh và động viên tôi trong suốt quá trình học tập.Lâm Thị Tú AnhivTÓM TẮTĐề tài nghiên cứu “Một số đặc điểm và khả năng gây bệnh của Mycoplasma hyopneumoniae trên heo” được tiến hành tại Trường Đại học Nông Lâm, từ 92009 đến tháng 62010, nhằm tìm hiểu một số đặc điểm và đặc tính gây bệnh của Mycoplasma hyopneumoniae (MH) phân lập được trên heo, từ đó giúp người chăn nuôi có biện pháp kiểm soát bệnh này.Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng như phân lập MH trên môi trường Friis’, kỹ thuật PCR xác định MH trên 22 mẫu phổi heo có bệnh tích nghi ngờ do MH được thu thập từ lò mổ Nam Phong. Thực hiện một số phản ứng sinh hóa như lên men glucose, thủy phân urea, arginine và nhạy cảm digitonine, giải trình tự đoạn gene của MH, xác định sự nhạy cảm của MH với kháng sinh tylosin bằng kỹ thuật MIC và đánh giá khả năng gây bệnh của 1 gốc MH
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ******** LÂM THỊ TÚ ANH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ******** LÂM THỊ TÚ ANH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEO Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: TS NGUYỄN TẤT TOÀN TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2010 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEO LÂM THỊ TÚ ANH Hội đồng chấm luận văn: Chủ tịch : PGS TS NGUYỄN VĂN KHANH Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM Thư ký : PGS.TS NGUYỄN NGỌC TUÂN Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM Phản biện : PGS TS TRẦN ĐÌNH TỪ Hội Thú y Việt Nam Phản biện : PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI Trường Đại học Y Phạm Ngọc Thạch Tp HCM Ủy viên : TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH Trường Đại học Nơng Lâm Tp HCM ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG i LÝ LỊCH CÁ NHÂN ********* Họ tên : Lâm Thị Tú Anh Ngày sinh : 19/01/1980 Nơi sinh : Thành phố Hồ Chí Minh Họ tên Cha : Lâm Minh Chiến Họ tên Mẹ : Liễu Thị Kim Thúy Quá trình học tập − Năm 1998: Tốt nghiệp phổ thông trung học trường PTTT Trưng Vương, Quận 1, Tp HCM − Năm 2003: Tốt nghiệp ngành Bác sỹ thú y Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM − Năm 2006: Học Cao học Thú y Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Tình trạng nhân: độc thân Địa liên lạc Email : lamthi_tuanh@yahoo.com Điện thoại : 0913 177 544 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả LÂM THỊ TÚ ANH iii CẢM TẠ Những năm học cao học qua với 12 tháng thực đề tài Trong ngày tháng đó, tơi học hỏi nhiều kiến thức chuyên môn lẫn sống Để có ngày hơm tơi khơng thể qn công ơn Cha Mẹ, người sinh ra, dạy dỗ, vất vả lo toan tạo điều kiện tốt cho ăn học nên người Tơi xin khắc ghi lòng kính trọng nhớ ơn Thầy Nguyễn Tất Tồn Cơ Nguyễn Thị Phước Ninh hết lòng dìu dắt, hướng dẫn tơi hồn thành đề tài, chia sẻ động viên lúc khó khăn Cảm ơn BGH Trường ĐHNL Tp HCM, BCN Khoa CN-TY, Quý Thầy Cô Khoa ln hết lòng học trò Cảm ơn Bệnh viện Thú y Trung tâm Thú y vùng 6, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành đề tài Xin cảm ơn tất anh chị, bạn bè bên cạnh động viên suốt trình học tập Lâm Thị Tú Anh iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Một số đặc điểm khả gây bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo” tiến hành Trường Đại học Nông Lâm, từ 9/2009 đến tháng 6/2010, nhằm tìm hiểu số đặc điểm đặc tính gây bệnh Mycoplasma hyopneumoniae (MH) phân lập heo, từ giúp người chăn ni có biện pháp kiểm sốt bệnh Các phương pháp nghiên cứu sử dụng phân lập MH môi trường Friis’, kỹ thuật PCR xác định MH 22 mẫu phổi heo có bệnh tích nghi ngờ MH thu thập từ lò mổ Nam Phong Thực số phản ứng sinh hóa lên men glucose, thủy phân urea, arginine nhạy cảm digitonine, giải trình tự đoạn gene MH, xác định nhạy cảm MH với kháng sinh tylosin kỹ thuật MIC đánh giá khả gây bệnh gốc MH phân lập Kết nghiên cứu cho thấy 6/22 mẫu dương tính với MH (27,27%) mơi trường canh Friis’; 5/22 mẫu dương tính với MH (chiếm 22,27%) môi trường thạch Friis’, tỷ lệ MH dương tính mẫu phổi kỹ thuật PCR 54,55% (12/22 mẫu), tương đồng phương pháp mức độ Sáu gốc MH phân lập môi trường Friis’ lên men glucose, không thủy phân urea, arginine nhạy cảm với digitonin Các gốc MH có quan hệ di truyền gần khơng có khác biệt nhiều so với chủng giới trình tự gene 16rRNA Một gốc MH đề kháng với kháng sinh tylosin nồng độ µg/ml Heo gây bệnh thực nghiệm có triệu chứng lâm sàng bệnh viêm phổi địa phương ho khan, ngắn, hồi – tiếng, khịt mũi thở khó thở thể bụng Bệnh tích đại thể bệnh tích vi thể đặc trưng bệnh nhục hóa xẹp thùy đỉnh, thùy tim, thùy phụ, có tập trung bạch cầu trung tính xung quanh đường thở phế nang, có gia tăng số lượng bạch cầu lympho quanh mao quản, tiểu phế quản mô tiểu phế quản Kết phân lập MH môi trường Friis’ xác định kỹ thuật PCR từ phổi heo lô thí nghiệm có 2/3 mẫu dương tính, vậy, gốc MH phân lập có khả gây bệnh heo v ABSTRACT The study titled “Characteristics and pathogenesis caused by Mycoplasma hyopneumoniae in pigs” was carried out from September 2009 to June 2010 at Nong Lam university The objectives of study were to isolate and determine the bacterium caused enzootic pneumonia in pigs, also known as Mycoplasma hyopneumoniae (MH), and to subsequently examine pathogenic characteristics of MH isolates in vivo The achieved results will help farmers to bring forward strategies for control of this disease more effective The methods which were isolation of MH in Friis’s medium, polymerase chain reaction (PCR) identification of MH in 22 lungs samples that have pathology suspect pathology of MH get in Nam Phong abattoir The MH isolates carry out biochemical tests like fermenting glucose, hydrolyzing urea, hydrolyzing arginine, sensitivity to digitonin, sequenced at position of 16S rRNA gene and examined sensitivity with tylosin by MIC assay To evaluate their pathogenic characteristics, experimental pigs were used for challenge of the selective isolates in vivo The results showed that out of 22 samples (27,27%) were positive with MH in Friis’ broth medium, out of 22 samples (22,27%) in Friis’ agar medium With specific primers, 22 pig lung samples collected from slaughterhouse were tested by PCR assay, and 12 samples performed positive with MH (54.55%), the identity between these methods was at moderately good level All six MH isolates in Friis’ medium evenly showed fermenting glucose, nonhydrolyzing urea and arginine, and sensitivity to digitonin All nine MH positive samples by PCR assay were sequenced at 16S rRNA gene and a genetic analysis was carried out, the results showed that all of them were genetically high homogenous and not remarkably various compared with several international MH strains from genebank One of the isolates was resistant with tylosin at concentration of µg/ml by MIC assay vi The challenged pigs in group of inoculating a selective MH isolate showed typically clinical signs of the enzootic pneumonia disease such as a prolonged, dry, nonproductive cough with two to five coughs per episode, and labored breathing The macroscopic lesions in lung performed purple to gray areas of consolidation of the cranial, ventral and accessory lobes with fairly well demarcated Microscopic lesions were characteristic of the enzootic pneumonia disease with accumulation of neutrophils in the airways and alveoli, increasing lymphocytes infiltrated the peribronchiolar, peribronchial and perivascular regions The lungs of challenged pigs were re-isolated in Friis’ medium and tested by PCR assay, the results showed that out of samples were positive with MH Taken together, we can conclude that the selective MH isolate can be pathogenic in pigs vii MỤC LỤC Trang Trang tựa Trang Chuẩn Y i Lý lịch cá nhân ii Lời cam đoan iii Lời cảm tạ iv Tóm tắt v Abstract vi Mục lục viii Danh sách chữ viết tắt xi Danh sách bảng xii Danh sách hình sơ đồ xiii Chương ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Mở đầu 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm 2.1.1 Lịch sử phân bố địa lý 2.1.2 Căn bệnh 2.1.3 Cơ chế sinh bệnh 2.1.4 Sức đề kháng 2.1.5 Dịch tễ học 2.1.6 Triệu chứng 2.1.7 Bệnh tích viii A B Hình 4.7 Phổi heo bị nhục hóa lơ gây bệnh thực nghiệm (A) phổi heo lô đối chứng (B) Bệnh tích vi thể quan sát 2/3 heo lơ gây bệnh thực nghiệm có tập trung bạch cầu trung tính chung quanh đường thở phế nang Có gia tăng số lượng bạch cầu lympho quanh mao quản, quanh tiểu phế quản quanh mô tiểu phế quản, tăng sinh vách phế nang Trong heo lô đối chứng khơng quan sát bệnh tích đặc trưng MH Bệnh tích mà chúng tơi quan sát heo thí nghiệm phù hợp với nhận định Mare ctv (1965), tổn thương phổi kiểm tra mô học cho thấy tăng sinh bạch huyết quanh nhánh phế quản nhỏ quanh mạch máu rõ, thâm nhiễm dày đặc phế nang, bạch cầu trung tính tế bào khổng lồ đơi nhìn thấy Kwon (2002) cho biết bệnh tích vi thể xuất sau 28 ngày gây bệnh MH là: tế bào đơn nhân lớn, bạch cầu đa nhân dịch phù tích tụ đường thở, vách phế nang tăng sinh Theo Taylor (1993), biến đổi mô học xuất sau ngày nhiễm bệnh, viêm kết hợp với mao quản sung huyết Năm ngày sau nhiễm tế bào lympho 50 đại thực bào xuất Sau ngày bạch huyết tích tụ xung quanh phế quản, tiểu phế quản, sau tăng nhanh mô bạch huyết, nguyên nhân gây tắc vài tiểu phế quản A B Hình 4.8 Bệnh tích vi thể heo thí nghiệm (x100) Hình A: bệnh tích vi thể phổi heo lơ gây bệnh thực nghiệm: (1) Lympho tăng sinh quanh tiểu phế quản, vách phế quản sung huyết dầy lên; (2) Vách phế nang nhiều vùng dính vào nhau, tích tụ lympho bào tạo thành vùng phổi xẹp, nhiều chỗ vách phế nang dày lên Hình B: bệnh tích vi thể phổi heo lô đối chứng: Viêm phổi mảng, tăng lympho bào Quan sát bệnh tích đại thể bệnh tích vi thể heo thí nghiệm, đồng thời so với nghiên cứu tác giả trên, chúng tơi nhận thấy bệnh tích heo lơ gây bệnh có điểm tương đồng với tác giả Từ cho thấy heo thí nghiệm bị bệnh MH 4.3.3 Xác định lại nguyên nhân gây bệnh Sau mổ khám heo thí nghiệm, ngồi việc quan sát bệnh tích đại thể bệnh tích vi thể, tiến hành lấy mẫu phổi heo lô phân lập lại thực kỹ thuật PCR, xác định diện MH phổi heo thí nghiệm, khẳng định heo bị bệnh có phải MH gây bệnh hay khơng, kết trình bày Bảng 4.9 51 Bảng 4.9 Kết phân lập PCR bệnh phẩm heo thí nghiệm Phân lập MH Lơ gây bệnh (n = 3) Kỹ thuật PCR Dương tính Tỷ lệ (%) Dương tính Tỷ lệ (%) 2/3 66,67 2/3 66,67 Lơ đối chứng (n = 1) 0/1 0/1 Trên mẫu phổi heo lô gây bệnh phân lập lại mơi trường Friis’, có mẫu làm môi trường canh chuyển sang màu vàng xuất khuẩn lạc nghi ngờ môi trường thạch, hai mẫu nghi ngờ dương tính kiểm tra lại kỹ thuật PCR, kết mẫu dương tính với MH Mẫu phổi heo lơ đối chứng, cho kết phân lập MH âm tính môi trường canh môi trường thạch Friis’ (không làm môi trường canh chuyển màu không xuất khuẩn lạc nghi ngờ môi trường thạch) Bên cạnh việc lấy mẫu để phân lập lại, thực kỹ thuật PCR heo thí nghiệm, để xác định MH mô phổi Kết Bảng 4.7 cho thấy lô gây bệnh có 2/3 mẫu dương tính, mẫu phổi lấy từ heo lơ đối chứng cho kết PCR âm tính với MH Hai heo cho kết phân lập môi trường Friis’và kỹ thuật PCR dương tính lơ gây bệnh, heo có biểu triệu chứng lâm sàng bệnh sau tuần theo dõi, có bệnh tích đại thể bệnh tích vi thể đặc trưng bệnh sau mổ khám Điều chứng tỏ heo nhiễm MH gây bệnh Một heo lô gây bệnh khơng có biểu lâm sàng, bệnh tích đặc trưng phổi bệnh MH gây ra, đồng thời cho kết âm tính phân lập lại môi trường Friis’ xác định kỹ thuật PCR Qua tuần thí nghiệm, điều kiện ni dưỡng, chăm sóc heo lơ đối chứng khơng có triệu chứng lâm sàng bệnh tích phổi MH gây Trong heo lơ gây bệnh có triệu chứng lâm sàng sau 14 ngày nhỏ mũi ho khan, thở bụng, xuất bệnh tích đặc trưng phổi MH gây Qua ghi nhận trên, chúng tơi khẳng định gốc MH phân lập có khả gây bệnh heo 52 Chương KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Với 22 mẫu phổi xác định phương pháp phân lập MH mơi trường Friis’ cho tỷ lệ dương tính 27,27%, kỹ thuật PCR cho tỷ lệ dương tính 54,55% Sự tương đồng phương pháp mức độ với số K = 0,5 Sáu gốc MH phân lập môi trường Friis’ lên men glucose nhạy cảm với digitonin, khơng thủy phân urea arginine Chín sản phẩm PCR MH khảo sát này, có quan hệ di truyền gần khơng có khác biệt rõ rệt trình tự gene 16rRNA so với chủng giới Chỉ gốc MH phân lập đề kháng với kháng sinh tylosin nồng độ µg/ml Một gốc MH phân lập có khả gây bệnh heo thí nghiệm 5.2 Đề nghị Tiếp tục thử nhạy cảm gốc MH phân lập lại với tylosin, với kháng sinh thông dụng khác, để xác định kháng sinh có hiệu việc phòng trị bệnh, từ có khuyến cáo thích hợp điều trị bệnh Ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán MH 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN TIẾNG VIỆT Trần Ngọc Ánh, 1999 Nghiên cứu bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo miền Nam Việt Nam: Tìm hiểu trạng thái miễn dịch tự nhiên heo nái, heo xác định thời điểm nhiễm bệnh heo Luận án thạc sĩ, Khoa học Nông Nghiệp, trường Đại học Nơng Lâm TP HCM Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 2004 Di truyền phân tử Nhà xuất nông nghiệp Tp.HCM Tô Minh Châu Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh Thú y Tủ sách Đại Học Nông Lâm Tp.HCM, trang 94 – 97 Trần Thị Dân, 2004 Phát Mycoplasma hyopneumonia Actinobacillus pleuropneumoniae heo kỹ thuật PCR Báo cáo đề tài cấp Bộ, Trường Đại Học Nông Lâm, Tp.HCM Trần Thị Dân Lê Thanh Hiền, 2007 Dịch tể học thú y Nhà xuất nông nghiệp Tp.HCM, trang 75 – 78 Đặng Thị Thu Hường, 2005 Phát nhiễm Mycoplasma hyopneumonia Actinobacillus pleuropneumoniae kỹ thuật PCR ELISA Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm, Tp.HCM Võ Thị Thương Lan, 2003 Sinh học phân tử Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Lương, 1997 Dịch tể học thú y Tập 2: Phần bệnh chuyên biệt Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Lê Văn Minh, 2002 Đánh giá hiệu sử dụng vaccine re spisure – one việc phòng bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo thịt xí nghiệp chăn ni heo Đồng Hiệp TP HCM LVTN, khoa CHTY, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 54 10 Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006a Đặc điểm sinh học, chế sinh bệnh Mycoplasma đáp ứng miễn dịch đường hô hấp Chuyên đề tiến sỹ, Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM 11 Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006b Các phương pháp chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae (MH) phòng thí nghiệm Chun đề tiến sỹ, Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM 12 Nguyễn Thị Phước Ninh, Đỗ Tiến Duy, Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Ngọc Tuân Trần Thị Dân, 2006 Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae số vi khuẩn liên quan đến bệnh hô hấp phổi heo Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y – tập XIII – số 3-2006 Đại học Nông Lâm Tp.HCM 13 Nguyễn Thị Phước Ninh, Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân, Đỗ Tiến Duy Lâm Thị Tú Anh, 2009 Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae heo, xác định số đặc tính sinh hóa tính nhạy cảm với số kháng sinh sử dụng đàn heo Đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ, Trường Đại học Nông Lâm, Tp.HCM 14 Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010 Một số đặc điểm dịch tể, phương pháp chẩn đốn phòng bệnh viêm phổi địa phương heo Tp HCM tỉnh lân cận Luận án tiến sỹ nông nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 15 Trần Thanh Phong, 1996 Bệnh truyền nhiễm vi trùng heo Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM Tr.32-43 16 Bùi Thị Thu Trang, 2009 Phát gen độc lực stx1, stx2, eae, hly Escherichia coli nhóm Stec gen rfbe, fliC serotype O157:H7 Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm, Tp.HCM 17 Phạm Phong Vũ, 2005 Ứng dụng kỹ thuật RT – nPCR ống để chẩn đoán bệnh Dịch tả heo Luận án thạc sĩ khoa học Nông Nghiệp, trang 13 – 27 55 PHẦN TIẾNG NƯỚC NGOÀI Assuncão P., Antunes N T., Rosales R S., Poveda C., Fe C de la Poveda J B Davey H M., 2006 Application of flow cytometry for the determination of minimal inhibitory concentration of several antibacterial agents on Mycoplasma hyopneumoniae Journal of Applied Microbiology 1364 – 5072 Barile M F., 1983 Arginine hydrolysis In Methods in Mycoplasmology (II) Academic Press, New York, p345 – p349 Brockmeier Susan L., Halbur Patrick G., Thacker Eileen L., 2002 Porcine Respiratory Disease Complex Polymicrobial Disease Cai H.Y., van Dreumel T., McEwen B., Hornby G., Bell-Rogers P., McRaild P., Josephson G Maxie G., 2007 Application and field validation of a PCR assay for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae from swine lung tissue samples J Vet Diagn Invest., 19: 91–95 Caron J., Ouardani M and Dea S., 2000 Diagnosis and Differentiantion of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis Infections in Pigs by PCR Amplification of the p36 and p46 Genes Journal of Clinical Microbiology, p1390 – p1396 Cho K.H., Park I.H., Do J.D., Chang S.J., Park N.C., Kwon H.I Park D.S., 1996 Survey on pneumonia of slaughter pigs in Youngnam Korean J Vet Serv, 19(2): p126 - p138 Clack L K., 1999 Mycoplasma hyopneumoniae: Serology/ Vaccinology Proceedings American association of swine practitioners, p365 – 368 Dwight C H W Cooley, 1998 Veterinary Microbiology United Kingdom: Blackwell Science, p 166 Etheridge, J., Lloyd, L Cottew, G 1979 Resistance of Mycoplasma hyopneumoniae to chlortetracycline Australian Veterinary Journal, p55 -p 40 10 Falk K., Hoie S., Lium B.M., 1991 An abattoir survey of pneumonia and pleuritis in slaughter weight swine from selected herds II Enzootic pneumonia of pigs: microbiological findings and their relationship to pathomorphology Acta Vet Scand, 32(1): 67-77 56 11 Fano Eduardo, 2005 Dynamics and persistence of Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs Canadian Veterinary Medical Association, p223 – p228 12 Freundt E A., 1983 Film and spot production In Methods in Mycoplasmology (II) Academic Press, NewYork, p373 - p374 13 Friis N F., 1975 Some recommendations concerning primary isolation of Mycoplasma suipneumoniae and Mycoplasma floculare Nord Veterinaermed 14 Gardella S R., DelGiudice R A Tully J G., 1983 Immunofluorescence, In methods in Mycoplasmology (II) Academic Press, New York, p431 – p438 15 Hannan Peter C T., 2000 Guidelines and recommendations for antimicrobial minimum inhibitory concentration (MIC) testing against veterinary Mycoplasma species Vet Res., 31:373 – 395 16 Hannan P C., Windsor H M., Ripley P H., 1997 In vitro susceptibilities of recent field isolates of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyosynoviae to valnemulin (Econor), tiamulin and enrofloxacin and the in vitro development of resistance to certain antimicrobial agents in Mycoplasma hyopneumoniae Res Vet Sci 63: p157 – p160 17 Henry S C Apley M., 1999 Therapeutics Disease of Swine, editor, Iowa State University Press, Ames, 1155 – 1162 18 Kobisch M., 2000 Mycoplasma disease in pigs – old diseases still causing trouble Procceding of the international pig veterinary society Congress 16, p434 – 438 19 Kwon D., Choi C Chae C., 2002 Chronologic localization of Mycoplasma hyopneumoniae in experimentally infected pigs Vet Pathol, 39:584 – 587 20 Lóper A., 2001 Respiratory System, Thoracic Cavity Pleura Special veterinary pathology p179 – p180 21 Maes D., Verdonck M., Deluyker H., and Kruif A de, 1996 Enzootic pneumonia in pigs Vet Quart 18: 104 – 109 22 Mare D., Switzer W P., 1965 Mycoplasma hyopneumoniae a causative agent of virus pig pneumonia Vet Med 60: 841 – 845 57 23 Mayor D., Zeeh F., Frey J and Kuhnert P., 2007 Diversity of Mycoplasma hyopneumoniae in pig farms revealed by direct molecular typing of clinical material Vet Res., 38:391-398 24 Mebus C A., Underdahl N R., 1977 Scanning electron microscopy of trachea and bronchi from gnotobiotic pigs inoculated with Mycoplasma hyopneumoniae Am J Vet Res 38: 1249 – 125 25 Minion F.C., Lefkowitz E.J., Madsen M.L., Cleary B.J., Swartzell S.M and Mahairas G.G., 2004 The genome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 232, the agent of swine mycoplasmosis J Bacteriol., 186(21):7123-7133 26 Morrison R B., Hilley H D., and Leman A D., 1985 Comparison of methods for assessing the prevalence and extent of pneumonia in market weight swine Can Vet J 26: 381-384 27 Okazaki N., Narita M., Yamada S., Izumikawa K., Umetsu M., Kenri T., Sasaki Y., Arakawa Y., Sasaki T., 2001 Characteristics of macrolide – resistant Mycoplasma pneumonia strains isolated from patients and induced with erythromycin in vitro Microbiology and Immunology 45: 617 – 20 28 Pinto P.M., Klein C.S., Zaha A and Ferreira H.B., 2009 Comparative proteomic analysis of pathogenic and non-pathogenic strains from the swine pathogen Mycoplasma hyopneumoniae Proteome Sci, 7:45 29 Quinn P.J., Carter M.E., Markey B, Carter G.R, 1994 Clinical veterinary microbiology Wolfe publishing an imprint of Mosby – year Book Europe Limited, p320 – p326 30 Razin S., 1983 Urea hydrolysis In methods in Mycoplasmology (II) academic press, New York, p351 – p352 31 Razin S and Cirillo V P., 1983 Sugar fermentation In methods in Mycoplasmology (II) Academic press, New York, p337 – p342 32 Razin S., Yogev D and Naot Y., 1998 Molecular biology and pathogenicity mycoplasma Microbiology and Molecular Biology Review, 1094 – 1156 58 33 Ross R F., 1992 Mycoplasma disease A D Lerman, R D Click, W L Mengerling, R H C Penny, E Scholl and B Straw, In Disease of swine 7thed Iowa State University Press, Ames, p537 – 551 34 Ross R F, 1999 Disease of swine (Eds: Straw B E., D’allaire S., Mengcling W L and Taylor D J., 8th edition) Iowa State University Press Ames, Iowa, USA, p495 – p509 35 Ross R F Whitlestone P, 1983 Recovery, indentification of, and serological response to porcine Mycoplasma Methods in Mycoplasmology (II) Academic press, New York, p.115 – p127 36 Roth J A., 2001 Proceeding of American Association of Swine Veterinarians Pulmonary immunology, 2001, p1463 37 Savic B., Ivetic V., Milicevic V., Pavlovic I, Zutic M and Gagrcin M., 2010 Genetic diversity of Mycoplasma hyopneumoniae isolates from conventional farrowto-finish pig farms in Serbia Acta Vet Hung., 58(3):297-308 38 Schafer E R., Oneal M J., Madsen M L Mimion C., 2007 Global transcription analysis of Mycoplasma hyopneumonia following exposure to hydrogen peroxide Microbiology, 153:3785 - 3790 39 Stemke G W., Phan R., Young T F., and Ross R F., 1994 Differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae, M flocculare and M hyorhinis on the basis of amplification of a 16S rRNA gene sequence Am J Vet Res 55: 81 – 84 40 Taylor D J 1993 Pig disease 7th edition Great Britain: St Edmundsbury Press Ltd P 180 – 194 41 Thacker E., Thacker B J and Jake B H., 2001 Interraction between Mycoplasma hyopneumoniae and swine influenza virus Journal of Clinical Microbiology, 39(7):2525 – 2530 42 Thacker Eileen L., 2004 Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae Journal of Swine Health anh Production; 12(5): 252 – 254 43 Thomas A., Nicolas C., Dizier I., Mainil J., and Linden A., 2003 Antibiotic susceptibilities of recent isolates of Mycoplasma bovis in Belgium The Veterinary Record 153: 428 – 231 59 44 Tzivara A., Kritas S K., Bourriel A R., Alexopoulos C.và Kyriakis S C., 2007 Efficacy of an inactivated aqueous vaccine for the control of enzootic pneumonia in pigs infected with Mycoplasma hyopneumonia Veterinary Record, 160:225 – 229 45 Nguyen Tat Toan, 2004 Comparative Evaluation of Isolation, PCR detection and Clinico – pathological Diagnostic Approaches in Field case of M hyopneumoniae Infection in Selacted Farm of Luzon University of the Philippines Los Banos, Philippines 46 Tully J G., 1983 Test for digitonin sensitive and steron requirement In Methods in Mycoplasmology (II) Academic Press, New York, p 355 – 356 47 Vasconcelos A.T., Ferreira H.B., Bizarro C.V., Bonatto S.L., Carvalho M.O., Pinto P.M., Almeida D.F., Almeida L.G., Almeida R., Alves-Filho L., Assunỗóo E.N., Azevedo V.A., Bogo M.R., Brigido M.M., Brocchi M., Burity H.A., Camargo A.A., Camargo S.S., Carepo M.S., Carraro D.M., de Mattos Cascardo J.C., Castro L.A., Cavalcanti G., Chemale G., Collevatti R.G., Cunha C.W., Dallagiovanna B., Dambrós B.P., Dellagostin O.A., Falcão C., Fantinatti-Garboggini F., Felipe M.S., Fiorentin L., Franco G.R., Freitas N.S., Frías D., Grangeiro T.B., Grisard E.C., Guimarães C.T., Hungria M., Jardim S.N., Krieger M.A., Laurino J.P., Lima L.F., Lopes M.I., Loreto E.L., Madeira H.M., Manfio G.P., Maranhão A.Q., Martinkovics C.T., Medeiros S.R., Moreira M.A., Neiva M., Ramalho-Neto C.E., Nicolás M.F., Oliveira S.C., Paixão R.F., Pedrosa F.O., Pena S.D., Pereira M., Pereira-Ferrari L., Piffer I., Pinto L.S., Potrich D.P., Salim A.C., Santos F.R., Schmitt R., Schneider M.P., Schrank A., Schrank I.S., Schuck A.F., Seuanez H.N., Silva D.W., Silva R., Silva S.C., Soares C.M., Souza K.R., Souza R.C., Staats C.C., Steffens M.B., Teixeira S.M., Urmenyi T.P., Vainstein M.H., Zuccherato L.W., Simpson A.J and Zaha A., 2005 Swine and poultry pathogens: the complete genome sequences of two strains of Mycoplasma hyopneumoniae and a strain of Mycoplasma synoviae J Bacteriol., 187(16):5568-77 48 Vicca J., 2005 Virulence and Antimicrobial Susceptibility of Mycoplasma hyopneumoniae Isolates from Pigs Ph.D thesis Faculty of Vet Med - Ghent University, Belgium 60 49 Vicca J., Stakenborg, Maes D., Butaye P., Kruif A and Haesebrouck F., 2004 In Vitro Susceptibilities of Mycoplasma hyopneumoniae Field Isolates Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48(11): 4470 – 4472 50 Carlton W W and McGavin M D., 1995 Thomson’s Special Veterinary Pathology (Eds: Alfonso López, chapter 3) American College of Veterinary Pathogists, USA, p155 – p158 51 Williams P P., 1978 In vitro susceptibility of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis to fifty – one antimicrobial agents Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 210 – 213 52 Wittlestone P., 1990 Control of enzootic pneumonia infection in pigs Zentralblatt 20, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 254 – 259 53 Wu C C and Teddi W., 2002 In Vitro Susceptibility of Tetracycline, Chlotetracycline and Oxytetracycline vs Mycoplasma hyopneumoniae American association of swine veterinarians 54 Intervet, 2003 www.thepigsite.com/focus/schering-plough-animalhealth/2769/mpac-mycoplasma-hyopneumoniae-bacterin-for-pigs-hogs-and-swinedate date May 19 2010 55 Pfizer Animal Health, 2010 www.pfizerah.com/product_overview.aspx?drug=UF&country=US&lang=EN&specie s=SW date May 19 2010 56 Pfizer Animal Health, 2010 www.cattlestore.com/p-898-pfizer-animal-healthflusurerespisure-oneer-bac-plus.aspx date May 19 2010 61 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường Friis’ Môi trường canh Dung dịch muối đệm Hanks 30ml Nước khử ion 720ml Bacto-Brain hear infusion 5g Mycoplasma broth base 7,5g Lactalbumin hydrolysate 1,25g Yeast extract 0,5g Phenol red, dung dịch 0,1% 13,7ml Điều chỉnh pH tới 7,8 hấp khử trùng 1210C 20 phút Chất trích nấm men tươi, dung dịch 25% 36,5ml Glucose, dung dịch 2% 2,5ml Thallium acetate, dung dịch 2% 5,5ml Huyết ngựa 100ml Huyết heo, bất hoạt 560C 30 phút 100ml Bổ sung thêm kháng sinh ampicillin 0,05mg/ml môi trường Môi trường thạch Môi trường canh nêu cho thêm thạch nguyên chất 6g/lít Phụ lục 2: Cách giữ gốc MH phân lập Những mẫu phân lập MH dương tính với ba phương pháp, phân lập môi trường canh, môi trường thạch chạy kỹ thuật PCR giữ gốc lại để thực tiêu đề tài MH nuôi cấy 10 ml môi trường canh Friis’ (chứa glucose, arginine, pyruvate urea phenol red) 360C ± có thay đổi màu mơi trường (từ đỏ chuyển sang vàng) Thêm 500μl glycerol (5%) vô trùng vào canh khuẩn trên, vortex, sau chia vào tube eppendorf, trữ nhiệt độ -200C 62 Phụ lục 3: Chi-Square Test: Dương tính, Âm tính Expected counts are printed below observed counts Chi-Square contributions are printed below expected counts Duong tinh 9.00 1.000 Âm tính 16 13.00 0.692 Total 22 12 9.00 1.000 10 13.00 0.692 22 26 44 Total 18 Chi-Sq = 3.385, DF = 1, P-Value = 0.066 Phụ lục 4: Hệ số tương đồng phương pháp PCR so với phân lập MH (trị số kappa) Phân lập Phương pháp PCR Tổng + - + (a) (b) 12 - (c) 10 (d) 10 16 22 Tổng a+d + 10 = 72,7% = a+b+c+d 22 ( a + c )( a + b) * 12 Phù hợp kỳ vọng a = = = 3,27 22 a+b+c+d (b + d )(c + d ) 16 * 10 Phù hợp kỳ vọng d = = = 7,27 22 a+b+c+d 3,27 + 7,27 Phù hợp bình quân = = 47,9% 22 Phù hợp quan sát: Trị số k = 72,7 − 47,9 = 0,5 (Tương đồng phương pháp mức độ trung bình) 100 − 47,9 63 Phụ lục 5: Số mẫu dương tính mơi trường thạch Friis’, môi trường canh Friis’ kỹ thuật PCR Phân lập môi trường thạch Friis’ Phương pháp PCR Tổng + - + 12 - 10 16 22 Tổng Phân lập môi trường thạch Friis’ Phương pháp Tổng + - Phân lập môi + trường canh Friis’ - 16 16 17 22 Tổng 64 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH ******** LÂM THỊ TÚ ANH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN HEO Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC... SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: TS NGUYỄN TẤT TOÀN TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2010 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE TRÊN... tìm hiểu số đặc điểm gây bệnh MH phân lập Việt Nam, giúp cho cơng tác phòng trị bệnh viêm phổi địa phương hiệu hơn, thực đề tài Một số đặc điểm khả gây bệnh Mycoplasma hyopneumoniae heo 1.2