1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Interleukine nhóm cytokine tiết phân tử tín hiệu tìm thấy tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng hệ thống miễn dịch Chức hệ thống miễn dịch người phụ thuộc chủ yếu vào interleukine, thiếu hụt interleukin dẫn đến bệnh tự miễn thiếu hụt miễn dịch Interleukine (hIL-7) cytokine có vai trò tăng trưởng dòng tế bào B T Đây dòng tế bào có chức quan trọng hệ miễn dịch người, đích cơng virus, mầm bệnh xâm nhập vào thể người Trong y học ngày nay, protein có hoạt tính sinh học sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị loại hormone, enzyme tái tổ hợp Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất loại protein chủ yếu tách chiết từ phận động vật Tuy nhiên, nhu cầu ngày cao nguồn cung từ động vật hạn chế, giá thành lại đắt dễ nhiễm mầm bệnh nguy hiểm cho người, nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái tổ hợp đặt cách cấp thiết Trong thập niên gần đây, với bước tiến lớn lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein khơng khó khăn trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học Thực tế phương pháp áp dụng rộng rãi để tổng hợp số loại protein làm thuốc insulin, hormone v.v… mà để tổng hợp nhiều hợp chất khác nguồn nguyên liệu hạn chế đường tổng hợp hố học gặp khó khăn Hiện nay, biểu protein tái tổ hợp thực vật quan tâm nghiên cứu ưu điểm vượt trội so với hệ thống biểu khác chúng sinh trưởng mơi trường tương đối đơn giản, protein tiết môi trường nhiều phần tích luỹ tế bào nên việc thu hồi tinh dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho người so với protein có nguồn gốc từ hệ thống ni cấy khác mầm bệnh virus thực vật tác nhân gây bệnh người Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng liệu pháp sinh học góp phần hồn thiện phương pháp nghiên cứu sản xuất cytokine nói chung hIL-7 nói riêng cách tối ưu Căn vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép với phương pháp khả thi, định lựa chọn thực đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu protein interleukine tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật” Mục tiêu nghiên cứu Xác định hệ thống nuôi cấy thực vật biểu tối ưu protein hIL-7 tái tổ hợp Thu nhận tinh protein hIL-7 tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật Nội dung nghiên cứu Đổi mã di truyền gen hIL-7 phù hợp biểu hệ thống thực vật Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL-7 tái tổ hợp phù hợp với hệ thống nuôi cấy thực vật Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật: huyền phù, rễ tơ thuốc chuyển gen Phân tích, kiểm tra đánh giá chất lượng hIL-7 tái tổ hợp thu qua hệ thống nuôi cấy thực vật Ý nghĩa lý luận thực tiễn luận án 4.1 Ý nghĩa lý luận Luận án cung cấp sở khoa học cho nghiên cứu biểu hiện, sản xuất protein tái tổ hợp dùng y học thực vật thông qua biến đổi mã di truyền hệ thống ni cấy thực vật 3 Nội dung luận án sử dụng làm tài liệu giảng dạy, tham khảo cho giảng viên sinh viên trường khối khoa học tự nhiên nói chung sinh học nói riêng 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Luận án cung cấp quy trình biểu protein hIL-7 tái tổ hợp hệ thống ni cấy dòng tế bào huyền phù BY2, rễ tơ, thuốc chuyển gen quy mơ phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích ni cấy thu sinh khối tế bào Bước đầu đánh giá hoạt tính sinh học protein hIL-7 tái tổ hợp thu sau tinh hệ thống nuôi cấy, tiền đề cho nghiên cứu sâu Đóng góp luận án Luận án thiết kế thành công cấu trúc vector biểu protein hIL-7 tế bào thuốc BY2, rễ tơ thuốc chuyển gen Đã biểu thành cơng protein hIL-7 tái tổ hợp trong: dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc chuyển gen Trong đó, protein biểu cao thuốc chuyển gen ngày tuổi với hàm lượng 36,7 ng/µg protein tan tổng số, có hoạt tính sinh học cao Đây cơng trình nghiên cứu Việt Nam giới biểu protein hIL-7 hệ thống nuôi cấy thực vật Cấu trúc luận án: Luận án có 157 trang kể tài liệu tham khảo chia thành chương, phần: Mở đầu (3 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (25 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (24 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (48 trang); Chương 4: Bàn luận kết nghiên cứu (8 trang); Kết luận đề nghị (1 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (1 trang); Summary (3 trang); Tài liệu tham khảo (26 trang); Phụ lục (7 trang) Luận án có 10 bảng; 39 hình tham khảo 175 tài liệu 4 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 175 tài liệu, có tài liệu tiếng Việt, 164 tài liệu tiếng Anh địa trang web vấn đề liên quan: (1) Vai trò cytokine interleukine hệ miễn dịch người; (2) Tình hình nghiên cứu ứng dụng loại cytokine tái tổ hợp y học; (3) Nghiên cứu biểu hIL-7 tái tổ hợp hệ thống vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc Interleukine nhóm cytokine, đóng vai trò quan trọng hệ miễn dịch người Chúng có chức điều hồ miễn dịch, bao gồm phát triển tế bào, trưởng thành, di chuyển bám dính Ngồi ra, chúng có khả kích hoạt phản ứng miễn dịch thể (Chad et al., 2010) Interleukine gồm chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4 kDa ổn định gốc N - glycosyl hóa O - glycosyl hóa cầu nối disulfide nội phân tử (Yoseph et al., 2016) Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm có exon intron nằm nhiễm sắc thể số 8, vị trí 8q21.13 Hiện nay, việc nghiên cứu sử dụng loại cytokine tái tổ hợp mở hướng điều trị tích cực y học Hàng loạt cytokine khác nghiên cứu, sản xuất thử nghiệm điều trị lâm sàng như: hIL-2, hIL-7, IFN-, G-CSF, GM-CSF, hIL11 EPO (Kwon et al., 2003) Các loại cytokine có vai trò quan trọng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu không đặc hiệu, hướng nghiên cứu tập trung vào tác dụng điều trị cytokine tác nhân dược lý đích tác động quan tâm nghiên cứu Chính lý nên u cầu cấp bách đặt phải hoàn thiện quy trình hệ thống thu nhận cytokine tái tổ hợp nói chung interleukine nói riêng, phục vụ y học Các hệ thống biểu protein thường sử dụng như: hệ thống vi khuẩn, hệ thống biểu tế bào huyền phù BY2, hệ thống biểu rễ tơ hệ thống biểu tạm thời thực vật Trong đó, hệ thống biểu thực vật thể khả ưu việt so với hệ thống khác do: khả tạo sinh khối, khả thu nhận protein tái tổ hợp, tốn cơng chăm sóc v.v… Đặc biệt mầm bệnh, virus thực vật đối tượng gây bệnh cho người, nên phù hợp để biểu loại protein tái tổ hợp người phục vụ y học Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU Luận án sử dụng dòng tế bào thuốc BY2 (Nicotiana tabacum L Cv Bright Yellow 2), thuốc N benthamiana N tabacum K326 phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp Các chủng vi khuẩn E coli DH-5α, A tumefaciens, A rhizogenes, E.coli Rosetta-gami B Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt nam cung cấp Tế bào 2E8 Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp Các vector: pK7WG2D.1, pCB301, pRTRA 35S-TBAG-100xELP, pENTRTM221/cal nhận từ Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2.2 HĨA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hóa chất, KIT sử dụng hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Promega… Các loại enzyme sử dụng hãng Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…Các thí nghiệm nghiên cứu luận án thực Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Luận án hồn thành Bộ môn Sinh học đại Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu protein thực vật Khai thác trình tự nucleotide trình tự mRNA Tiến hành thay codon gen hIL-7 codon phổ biến thực vật Thêm trình tự cmyc, histag, vị trí nhận biết enzyme giới hạn vào trình tự Sử dụng BioEdit kiểm tra trình tự nucleotide trình tự acid amin trước sau đổi mã 2.3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp Trong nội dung luận án, thiết kế vector chuyển gen: (1) pET32c(+)/IL7; (2) pENTR221/cal/IL7; (3) pK7WG2D.1/cal/IL7; (4) pRTRA 35S-IL7-cmyc-histag-100xELP; (5) pCB301 35S/IL7cmyc-histag-100xELP 2.3.3 Phương pháp biểu gen vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc BY-2, rễ tơ thuốc thuốc Phương pháp chuyển gen vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2 rễ tơ thuốc thuốc thực gián tiếp thông qua A tumefaciens A rhizogene theo phương pháp Topping (1998) 2.2.4 Nhóm phương pháp phân tích dòng chuyển gen 2.2.4.1 Phân tích tiêu sinh lý dòng chuyển gen Các tiêu sinh lý dòng tế bào chuyển gen BY2 rễ tơ chuyển gen đánh giá thông qua số khối lượng tươi khối lượng khô nuôi cấy môi trường lỏng Quá trình đánh giá thực theo phương pháp Phạm Bích Ngọc năm 2009 (Ngoc et al., 2009) 2.2.4.2 Phân tích dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử Kiểm tra có mặt gen chuyển kỹ thuật PCR, xác định protein tái tổ hợp lai miễn dịch Western blot Phân tích biểu protein điện di protein theo Laemmli (1970) Western blot Định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp ELISA theo phương pháp Sun cs (2006) Protein tinh theo phương pháp IMAC mITC đánh giá hoạt tính sinh học dòng tế bào 2E8 7 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu thực vật Sử dụng trình tự gen hIL-7 cơng bố Ngân hàng Gen có mã số: J04156.1 bảng tần suất codon phổ biến thực vật (Codon Usage Database) với phần mềm Codon Optimization 2.0 để loại bỏ thay khoảng 10% codon gen hIL-7 codon phổ biến thực vật mà không làm thay đổi thành phần trật tự acid amin Sử dụng công cụ Graphical Codon Usage Analyzer kiểm tra mức độ phù hợp codon gen hIL-7 trước sau cải biến mã di truyền Ngồi ra, chúng tơi tiến hành loại bỏ trình tự ATTTA gen hIL-7 cho gây bất ổn trình phiên mã mRNA (Hood et al, 2002), kết hợp sử dụng phần mềm Invitrogen để giảm thiểu hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp Kết thay đổi thành công mã di truyền gen hIL-7 với độ tương đồng nucleotide so với trình tự gen gốc 63,6 %, độ tương đồng acid amin 100% Ngồi ra, trình tự nhận biết enzyme giới hạn NcoI, SacI, HindIII, trình tự nucleotide mã hóa cho protein c-myc epitope his-tag thêm vào đầu 5’ 3’ gen hIL-7 Trình tự nucleotide sau tối ưu có kích thước 536bp, đặt tổng hợp hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) nhân dòng vector pBSK/IL7 3.2 Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc thuốc 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 Sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI HindIII để cắt đồng thời vector tách dòng pBSK/IL7 vector pET32c(+) để tạo đầu dính sole, sản phẩm cắt kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.5.A) Kết hình 3.5.A cho thấy đường chạy thu băng có kích thước khoảng 5,9 kb tương ứng với kích thước lý thuyết vector pET32c(+); đường chạy xuất băng có kích thước khoảng 2,9 kb 0,53 kb tương ứng với kích thước vector pBSK gen hIL-7 Ghép nối gen interleukin vào vector pET32c(+) thu vector tái tổ hợp pET32c(+)/IL7 có kích thước khoảng 6,43 kb nhân dòng E.coli DH5α Kiểm tra có mặt vector pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp colony PCR với cặp mồi IL7_F IL7_R phản ứng cắt enzyme giới hạn NcoI HindIII Kết hình 3.5.B 3.5.C; đường chạy hình 3.5.B xuất băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,53 kb, đường chạy hình 3.5.C xuất hai băng có kích thước khoảng 0,53 kb 5,9 kb Các kết chứng tỏ vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 thiết kế thành công Cấu trúc biến nạp vào vi khuẩn E.coli rosetta gami B để biểu protein interleukin tái tổ hợp A C B Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen pET32c(+)/IL7 (A) Kết điện di sản phẩm cắt mở vòng pET32c(+)(đường chạy 1) vector pBSK/IL7 (đường chạy 2) cặp enzyme NcoI HindIII; (B) Kết điện di sản phẩm colony PCR pET32c(+)/IL7 cặp mồi IL7_F IL7_R, (-) Đối chứng âm (pET32c(+)), (+) Đối chứng dương (pBSK/IL7); (C) Kết diện di sản phẩm cắt vector pET32c(+)/IL7 enzyme cắt giới hạn NcoI HindIII; M Thang DNA chuẩn 1kb 3.2.2 Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 Các bước thiết kế vector pENTR221/cal/IL7 tương tự mục 3.2.1 Sử dụng enzyme cắt giới hạn SacI HindIII để tạo đầu dính cho gen hIL-7 vector pENTR221 để thực phản ứng lai ghép, thiết kế thành công vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7 3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 Chúng thực phản ứng LR plasmid tiếp nhận pENTR221/cal/IL7 vector đích pK7WG2D.1 để tạo vector pK7WG2D.1/cal/IL7 tái tổ hợp kỹ thuật Gateway Kết thiết kế thành công vector pK7WG2D.1/cal/IL7 3.2.4 Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP Các bước thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag100xELP tương tự mục 3.2.1 Sử dụng enzyme BamHI để tạo đầu dính gen hIL-7 vector pRTRA, chuẩn bị cho phản ứng lai ghép với enzyme xúc tác T4 ligase Vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag100xELP dòng hóa E.coli DH5α A.tumefaciens 3.2.5 Thiết kế vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP pCB301 xử lý đồng thời enzyme cắt giới hạn HindIII tiến hành lai ghép xúc tác enzyme T4 ligase Kết thiết kế thành công vector chuyển gen pCB301/IL7 3.3 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp 3.3.1 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp vi khuẩn Tiến hành nuôi cấy tế bào E coli rosetta-gami B chứa plasmid tái tổ hợp hai mơi trường LB chọn lọc có bổ sung IPTG với nồng độ 0,2; 0,4; 0,6 mM hai mức nhiệt độ 280C 370C 10 Kết phân tích protein thể hình 3.15, đường chạy protein dòng E coli rosetta-gami B mang plasmid pET32c(+)/IL7 cảm ứng IPTG xuất băng có kích thước khoảng 37 kDa tương ứng với kích thước protein hIL-7 dung hợp với Thiodedoxin (Trx.tag), trình tự mã hóa cmyc-tag his-tag Trong đó, dòng đối chứng nuôi cấy 370C (đường chạy 1) nuôi cấy 280C (đường chạy 5) không biểu protein Hình 3.15 Kết kiểm tra khả biểu hIL-7 từ vi khuẩn E coli Rosetta gami B nuôi 37oC 28oC - 4: Nuôi cấy 370C; 1: không bổ sung IPTG, 2: 0,6 mM IPTG, 3: 0,4 mM IPTG, 4: 0,2 mM IPTG; - 8: Muôi cấy 280C; 5: không bổ sung IPTG, 6: 0,6 mM IPTG, 7: 0,4 mM IPTG, 8: 0,2 mM IPTG; M: thang protein chuẩn (Fermentas) Chúng xử lý mẫu protein DTT nồng độ nhiệt độ khác nhau, sau tiến hành lai miễn dịch Western blot để xác định xác protein biểu có protein mong muốn Độ nhạy phản ứng lai Western blot đánh giá đối chứng dương protein tái tổ hợp scFv có trình tự c-myc với nồng độ xác định 50 ng/µl Ngồi ra, chúng tơi định lượng lượng protein hIL-7 có mẫu so sánh mầu sắc vạch mẫu với vạch đối chứng dương Kết thể hình 3.16 cho thấy màng lai, đường chạy 11 protein số 2, 3, 4, 5, 6, xuất băng màu đậm, rõ nét có kích thước tính tốn lý thuyết, dòng đối chứng khơng có protein Hình 3.16 Kiểm tra biểu protein hIL-7 pha tan Western blot (-) Đối chứng âm: mẫu protein không cảm ứng IPTG; Mẫu protein không xử lý DTT; 2, 3, 4, 5, 6, 7: mẫu protein xử lý DTT điều kiện khác nhau; (+) Đối chứng dương: 150 ng protein scFv; M Thang chuẩn protein (Fermentas) 3.3.2 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng tế bào BY2 Sử dụng dòng BY2 chuyển gen dòng khơng chuyển gen (đối chứng âm) sau 12 ngày nuôi cấy để tách protein tan tổng số, điện di gel 12,6% SDS polyacrylamide tiến hành phản ứng Western blot để đánh giá chất lượng protein thơng qua protein c-myc, phát có mặt protein hIL-7 kháng thể kháng c-Myc Độ nhạy phản ứng Western blot đánh giá đối chứng dương protein tái tổ hợp scFV có gắn c-Myc Kết thể hình 3.24 cho thấy, băng protein đường chạy rõ, sắc nét chứng tỏ protein thu sạch, bị đứt gãy Các dòng BY2 chuyển gen hIL-7 số 2, 3, 32 xuất băng khoảng 23 kDa Trong đó, dòng số 13, 39 khơng xuất băng protein hIL-7 12 kết kiểm tra PCR cho kết dương tính; điều tượng gen chuyển không hoạt động (Sun et al., 2006) Hình 3.24 Kiểm tra biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng tế bào huyền phù BY2 Western blot M Thang protein chuẩn; (+) Đối chứng dương (protein scFv 150 ng); (-) Đối chứng âm (dòng tế bào BY2 hoang dại); - 5: dòng tế bào BY2 chuyển gen; Phản ứng lai sử dụng kháng thể anti c- myc Từ kết cho thấy, thiết kế biểu thành công protein hIL-7 tái tổ hợp tế bào huyền phù BY2 Chúng sử dụng kỹ thuật ELISA để đánh giá gián tiếp mức độ biểu protein hIL-7 dòng BY2 chuyển gen dương tính kiểm tra Western blot Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp gắn c-myc tính tốn dựa phương trình đường chuẩn protein scFv gắn c-myc Kết thể hình 3.25 Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp tích luỹ tế bào huyền phù chuyển gene BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số Tuy nhiên, mức độ tích luỹ protein hIL-7 tái tổ hợp thấp so với protein tổng số Hàm lượng hIL-7 (ng/μg protein tổng số) 13 3.5 2.5 1.5 0.5 3.25 2.25 Dòng Dòng Dòng 32 Dòng BY2 chuyển gen Hình 3.25 Biểu đồ so sánh hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp dòng BY2 chuyển gen Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp tích lũy tế bào huyền phù chuyển gen BY2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số 3.3.3 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp dòng rễ tơ chuyển gen Chúng sử dụng A.rhizogenes ATCC15834 để chuyển vector pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mảnh thuốc để cảm ứng tạo rễ tơ chuyển gen Sau qua trình chọn lọc, kiểm tra môi trường chứa kháng sinh kỹ thuật PCR, chọn dòng rễ tơ sinh trưởng, phát triển tốt mang gen chuyển để đánh giá biểu protein hIL-7 tái tổ hợp Sử dụng kỹ thuật Western blot để phân tích biểu protein hIL-7 dòng rễ tơ chuyển gen Kết thể hình 3.30 Kết kiểm tra cho thấy, dòng rễ tơ chuyển gen mã hóa protein hIL-7 xuất băng kích thước khoảng 23 kDa, tương ứng với kích thước protein hIL-7 gắn thêm c-myc histag theo tính tốn lý thuyết Trong đường chạy đối chứng âm dòng rễ tơ khơng chuyển gen không xuất băng protein Điều cho thấy gen mã hóa protein hIL-7 chuyển biểu thành cơng rễ tơ thuốc 14 Hình 3.30 Kết biểu protein hIL-7 dòng rễ tơ Western blot M Thang protein chuẩn; - 5: dòng rễ tơ chuyển gen; (+) Đối chứng dương (protein scFv 150 ng), (-) Đối chứng âm: dòng rễ tơ không chuyển gen Phản ứng lai sử dụng kháng thể kháng c-myc Hàm lượng hIL-7 (ng/μg protein tổng số) 30 25 23.3 22 20 19.93 20 17.84 15 10 Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng Dòng rễ tơ chuyển gen Hình 3.31 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein hIL-7 dòng rễ tơ chuyển gen Chúng sử dụng phương pháp ELISA để xác định hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp dòng rễ tơ chuyển gen Kết thể hình 3.31 cho thấy, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp thu nhận từ dòng rễ tơ chuyển gen dao động từ 17,84 ng/µg đến 23,3 ng/µg 15 protein tan tổng số Trong đó, biểu protein hIL-7 tái tổ hợp cao dòng 1, đạt 23,3 ng/µg protein tan tổng số, thấp dòng 5, đạt 17,84 ng/µg protein tan tổng số Đặc biệt, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp biểu dòng dòng khơng có khác biệt đáng kể 3.3.4 Biểu protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc phương pháp Agro-infiltration Chúng sử dụng chủng A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP để biểu tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc phương pháp Agroinfiltration Sau ngày biến nạp, tiến hành thu bảo quản -80oC Để kiểm tra biểu protein hIL-7 tái tổ hợp, tiến hành tách chiết protein tổng số đo nồng độ theo phương pháp Bradford (1976), sau sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot vị trí biểu tạm thời non, bánh tẻ già Hình 3.35 Kiểm tra biểu protein hIL-7 thuốc Western blot M Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); Lá non, Lá bánh tẻ, Lá già; (-) Đối chứng âm (lá thuốc không chuyển gen) Kết thể hình 3.35 cho thấy đường chạy 1, 2, xuất băng có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein hIL-7 tái tổ hợp có gắn thêm protein cmyc, histag ELP; 16 đường chạy đối chứng âm, thuốc không chuyển gen không xuất băng 3.3.4.4 Phân tích định lượng tinh protein hIl-7 tái tổ hợp Sau biểu thành công protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc lá, tiến hành tinh protein phương pháp sắc ký ion cố định kim loại (niken) để tinh định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp Đây phương pháp hiệu để tinh protein tái tổ hợp liên kết với his-tag Phương pháp dựa nguyên lý histidine tạo phức hợp với kim loại hoá trị II (niken) nồng độ pH trung tính Sự tương tác protein liên kết his-tag với kim loại phụ thuộc vào nồng độ pH Protein đích sau liên kết với cột tinh sạch, hoà tan thu lại cách giảm pH dung dịch tăng nồng độ đệm ion nồng độ đệm EDTA imidazole Sau tinh sạch, kiểm tra biểu protein hIL-7 tái tổ hợp điện di SDS-PAGE phương pháp lai miễn dịch Western blot Kết thể hình 3.34 cho thấy, chúng tơi thu băng protein có kích thước khoảng 64 kDa, theo tính tốn lý thuyết 64 Hình 3.36 Kết tinh định lượng protein hIL-7 phương pháp IMAC (A) Điện di SDS-PAGE: 1A Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A Dịch chiết thu nhận sau qua cột tinh sạch; 3A Protein hIL-7 sau tinh 17 (B) Kết Western blot: 1B Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B Dịch chiết thu nhận sau qua cột tinh sạch; 3B Protein hIL-7 sau tinh (C) Định lượng protein hIL-7 western blot sử dụng phần mềm ImageJ: 1C, 2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng, 5C Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C protein hIL-7 sau tinh (30 µg protein tổng số/giếng) Sau tinh theo phương pháp IMAC, nồng độ protein tổng số định lượng theo phương pháp Bradford protein hIL-7 định lượng phần mềm ImageJ màng lai Kết thu 27,86 ng/µg protein tan tổng số So sánh với số nghiên cứu biểu protein tạm thời khác biểu protein hIL-7 thuốc N Benthamiana tương đối cao Kết cho thấy hiệu phương pháp biểu tạm thời tinh protein hIL-7 từ thuốc N benthamiana thời gian ngắn, dễ thực Để thu protein hIL-7 tái tổ hợp với hàm lượng cao hơn, tiếp tục định lượng tinh phương pháp mITC dựa đặc tính gắn kết ELP với protein đích hIL-7 Chúng tơi sử dụng 100 gam thuốc biến nạp phương pháp agroinfiltration để tinh thu nhận protein hIL-7 tái tổ hợp theo phương pháp mITC Kết hình 3.37 cho thấy, đường chạy xuất băng có kích thước khoảng 64 kDa 130 kDa (trạng thái dimer) protein có gắn ELP; đường chạy dịch chiết protein khỏi màng lọc sau đưa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất băng protein nào, điều chứng tỏ protein IL7 có gắn ELP giữ lại màng lai không bị rửa trôi protein khác Ở đường chạy số dịch chiết sau rửa màng nước milipore-Q lạnh nồng độ ion thấp có băng protein có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein hIL-7 tái tổ hợp theo tính tốn 18 Hình 3.37 Kết tinh protein hIL-7 phương pháp mITC M Thang protein chuẩn; Protein hIL-7 tinh sau rửa màng nước lạnh; Dịch chiết khỏi màng sau đưa dịch thô qua màng; Dịch chiết protein chứa IL7/ELP trước tinh Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 phương pháp mITC Dịch chiết Protein Protein Hiệu suất Độ tinh protein tổng số (mg) tái tổ hợp (mg) thu hồi (%) (%) Dịch thô 1634,7 38,3 100 X trước tinh Dịch hIL-7 45,8 36,7 95,82 86,3 tinh Từ kết xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi protein hIL-7 phương pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh đạt 86,3% Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp protein hòa tan tổng số 2,34%, kết tương đương với nghiên cứu trước hàm 19 lượng protein tái tổ hợp protein hòa tan tổng số: 2% (Lamphear et al., 2004), (Streatfield et al., 2002); 2,2% (C.H.Ha et al, 2015); 3% (Gil, 2001) Hình 3.38 Kết định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp Western blot Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước tinh (30 µg/giếng); Protein hIL-7 tách khỏi màng rửa màng nước milipore-Q lạnh; 3, 4, 5, Đối chứng dương với nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng Phương pháp gắn kết ELP vào protein đích tỏ có nhiều ưu điểm dễ dàng thu nhận tinh protein tái tổ hợp nhờ tính chất đặc biệt ELP, đồng thời hàm lượng protein tái tổ hợp thu thường cao Shoj cộng (2009) thu nhận 200 mg HA/kg tươi, Mortimer cộng (2012) thu nhận 675 mg HA/kg tươi sản xuất kháng nguyên virus cúm gia cầm H5N1 phương pháp Trong nghiên cứu biểu protein hIL-7 tái tổ hợp gắn kết ELP, thu nhận 36,7 ng/µg protein tan tổng số Kết cho thấy biểu tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp thuốc N benthamiana cao, sở để tiến hành sản xuất lượng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng y học 20 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học protein hIL-7 tái tổ hợp Để đánh giá hoạt tính sinh học protein hIL-7 sử dụng mẫu protein hIL7 biểu tạm thời thuốc phương pháp agro-infiltration nồng độ hIL-7 là: 0,125 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; µg/ml; 1,5 µg/ml; µg/ml; 2,5 µg/ml khả hoạt hố tế bào 2E8 Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.10 hình 3.39 Bảng 3.10 Kết hoạt hố dòng tế bào 2E8 protein interleukin Mức độ hoạt hóa tế bào 2E8 (%) 35,7 45,3 53,3 63,8 73,6 82,5 79,3 0,35 Nồng độ protein hIL-7 0,125 µg/ml 0,25 µg/ml 0,5 µg/ml µg/ml 1,5 µg/ml µg/ml 2,5 µg/ml Giá trị ED50 (g/ml) 100 80 60 40 Protein IL-7 thực vật 20 0.125 0.25 0.5 1.5 2.5 Hình 3.39 Khả hoạt hóa dòng tế bào 2E8 protein IL-7 21 Qua bảng 3.10 hình 3.39 cho thấy, protein hIL-7 tái tổ hợp biểu tạm thời thuốc thể hoạt tính sinh học việc hỗ trợ sinh trưởng hoạt hố dòng tế bào 2E8, với khả hoạt hóa đạt 82,5% so với đối chứng âm (dòng tế bào 2E8 khơng bổ sung hIL-7 vào môi trường nuôi cấy) Ở nồng độ chất thử hIL-7 tăng dần, % hoạt hóa tế bào mẫu tăng theo, cho thấy hoạt tính sinh học mẫu thử ổn định; đó, khả hoạt hóa cao nồng độ µg/ml 82,5% Sau khả hoạt hóa mẫu khơng tăng mà lại giảm đi, điều giải thích protein hIL-7 liều lượng cao gây ức chế cho sinh sản hoạt hóa tế bào, chí gây chết cho tế bào Qua kết trên, bước đầu khẳng định protein hIL-7 tái tổ hợp có khả thể hoạt tính sinh học giống với tự nhiên, mở khả sản xuất lượng lớn protein hIL-7 tái tổ hợp phục vụ y học nhằm đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho người Chương BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Biểu protein interleukin E.coli rosetta-gami B Trong nội dung nghiên cứu luận án, sử dụng vector pET32c(+)/IL7 tái tổ hợp để biểu protein hIL-7 vi khuẩn E.coli Rosetta-gami B điều khiển promoter T7lac nhờ hoạt tính T7 RNA polymerase tế bào chủ biến đổi phage T7 Chủng rosetta-gami B mang plasmid pRARE mã hoá cho tRNAs chủng K-12 đột biến trxB/gor có khả tăng cường hình thành cầu nối disulfide tế bào chất kết hợp với vector biểu pET32c có chứa đoạn DNA mã hố cho oligo-histidine (His-tag) hỗ trợ việc phát tinh chế protein hIL-7 nhằm thu nhận protein hIL-7 tái tổ hợp có cấu trúc giống tự nhiên để kiểm tra hoạt động gen hIL-7 tái tổ hợp trước chuyển vào hệ thống nuôi cấy thực vật 22 Khi biểu hiện, protein hIL-7 dung hợp với protein Thiodedoxin (Trx.Tag) pET32c(+) để tăng cường khả cuộn, gấp biểu dạng tan giúp cho việc thu nhận tinh protein hIL-7 dễ dàng Khi có nhiều protein tạo hình thành thể vùi vi khuẩn Đây tinh thể đậm đặc protein cuộn gấp sai hoạt động chức Vì lý đó, nên chúng tơi sử dụng hệ thống biểu pET, hai hệ thống biểu thường sử dụng E coli để kiểm sốt q trình biểu protein Các dòng vector pET có promoter T7/lac, vị trí đa nhân dòng (multi cloning site) trình tự kết thúc T7 Việc phiên mã từ promoter T7/lac đòi hỏi phải có T7 RNA polymerase Tế bào chủ E coli có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, bị protein lac operon, lacI ức chế kìm hãm biểu gen Khi IPTG bổ sung trình biểu protein tái tổ hợp, cảm ứng giải phóng lacI khỏi operator lac operon trình phiên mã bắt đầu T7 RNA polymerase tạo bám vào promoter T7/lac protein tái tổ hợp sản xuất Trong nghiên cứu luận án, xác định hàm lượng IPTG tối ưu 0,4mM điều kiện nhiệt độ 37oC cho khả sản xuất protein hIL-7 tái tổ hợp tốt Trong nghiên cứu luận án, tiến hành thiết kế vector biểu bao gồm trình tự mã hóa protein hIL-7 trình tự mã hóa cho thiodedoxin tạo protein dung hợp có kích thước khoảng 37kDa gần 80 kDa (trạng thái dimer), giúp tăng cường khả cuộn gấp tạo cấu trúc không gian protein hIL-7 tăng khả tiết môi trường ngoại bào, giúp cho việc thu nhận protein đơn giản Tuy nhiên, biểu loại protein sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt protein người có hạn chế định, đặc biệt E coli thường lẫn với lipopolysaccharide, loại nội độc tố người Vì vậy, nhiều hệ thống khác nghiên cứu để thay hệ thống biểu vi khuẩn, có hệ thống biểu protein tái tổ hợp thực vật 23 4.2 Biểu protein interleukin dòng tế bào BY-2, rễ tơ Sử dụng tế bào huyền phù thực vật mơ hình sản xuất protein tái tổ hợp quy mơ phòng thí nghiệm ngày trở nên phổ biến Đặc biệt, protein sản xuất từ dòng tế bào BY-2 có chứa N-liked glycan có cấu trúc tương tự tế bào động vật, điều làm tiền đề cho việc thu nhận protein tái tổ hợp có cấu trúc hoạt tính sinh học giống tự nhiên Trong nghiên cứu chúng tôi, hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp biểu dòng tế bào BY-2 đạt 2,25 - 3,25 ng/g protein tan tổng số, tương đương 0,225 - 0,335% protein tan tổng số Hàm lượng biểu thấp so với số nghiên cứu biểu protein khác hệ thống BY-2 như: P.B Ngọc (2009) biểu protein thaumatin I tế bào BY2 cho thấy protein thaumatin I tái tổ hợp tiết khoảng 1,024 g/ml môi trường nuôi cấy; La Việt Hồng (2015), hàm lượng protein miraculin tái tổ hợp biểu hệ thống huyền phù BY-2 dao động từ 1,13 - 3,10 ng/g protein tan tổng số, Đào Thị Sen (2016), hàm lượng protein GP5 tái tổ hợp thu nhận qua hệ thống BY2 đạt 3,4% protein tổng số 4.3 Biểu tạm thời protein interleukin thuốc Phương pháp có lợi mức độ biểu protein tái tổ hợp cao nhiều so với phương pháp khác, thời gian sản xuất protein nhanh hơn, khơng bị ảnh hưởng vị trí gắn gen tế bào thực vật, đặc biệt không gặp phải vấn đề an toàn sinh thái phương pháp tạo chuyển gen Trong nghiên cứu luận án, để tránh gặp phải tượng RNAi làm giảm hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp, chúng tơi biểu đồng thời protein đích interleukin protein hỗ trợ HcPro virus khoai tây Y nhằm chống lại tượng câm gen thực vật cách ngăn cản phân giải mRNA RNA sợi đơi, từ giảm 24 lượng siRNA phá hỏng chức cắt enzyme cắt sợi đôi Dicer RISC [176] Kết quả, thu protein hIL-7 tái tổ hợp biểu thuốc với hàm lượng cao KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Mã di truyền gen hIL-7 thay đổi phù hợp với hệ thống biểu thực vật với độ tương đồng nucleotide so với trình tự gen hIL-7 gốc 63,6 % độ tương đồng acid amin 100% Đã thiết kế thành công cấu trúc vector chuyển gen pET32c(+)/IL7; pENTR221/cal/IL7; pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP; pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP phục vụ chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế bào huyền phù BY-2, rễ tơ thuốc thuốc để biểu protein hIL-7 tái tổ hợp Hàm lượng protein hIL-7 tái tổ hợp cao đạt 36,7 ng/µg protein tan tổng số hệ thống biểu tạm thời; thấp đạt 2,25 ng/µg protein tan tổng số hệ thống ni cấy tế bào BY2 Hoạt tính sinh học protein hIL-7 thu nhận qua hệ thống biểu tạm thời đạt 82,5% nồng độ µg/ml Đề nghị Tiếp tục thử nghiệm protein hIL-7 tái tổ hợp tinh mức độ động vật thí nghiệm lâm sàng nhằm đánh giá sâu hoạt tính sinh học protein hIL-7 trước sản xuất quy mô lớn Nghiên cứu tối ưu hệ thống biểu dòng tế bào BY2, rễ tơ thuốc nhằm tận dụng ưu điểm hệ thống để nâng cao hiệu suất sản xuất protein hIL-7 Đồng thời nghiên cứu biểu số loài thực vật khác để làm phong phú nguồn nguyên liệu tổng hợp protein hIL-7 tái tổ hợp  ... cứu biểu protein interleukine tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật Mục tiêu nghiên cứu Xác định hệ thống nuôi cấy thực vật biểu tối ưu protein hIL -7 tái tổ hợp Thu nhận tinh protein hIL -7 tái. .. thống nuôi cấy thực vật Biểu protein hIL -7 tái tổ hợp hệ thống nuôi cấy thực vật: huyền phù, rễ tơ thuốc chuyển gen Phân tích, kiểm tra đánh giá chất lượng hIL -7 tái tổ hợp thu qua hệ thống nuôi. .. tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy thực vật Nội dung nghiên cứu Đổi mã di truyền gen hIL -7 phù hợp biểu hệ thống thực vật Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa hIL -7 tái tổ hợp phù hợp với hệ