Luận văn Tiến Sĩ: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÁC DÒNG DÓ BẦU (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) ĐẶC SẮC Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Thành Phố

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và trân trọng đến PGS Tiến sĩ Trần Văn Minh và PGS Tiến sĩ Bùi Cách Tuyến đã nhận hướng dẫn khoa học cho luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn GS Tiến sĩ Bùi Chí Bửu và GS Tiến sĩ Nguyễn Thị Lang đã giúp đỡ trong việc áp dụng phương pháp khảo sát đa dạng di truyền. Tôi xin trân trọng cám ơn Viện Công Nghệ sinh học và Môi trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long trong việc giúp đỡ và tạo điều kiện cho việc tiến hành các thí nghiệm. Xin trân trọng cảm ơn Vườn Quốc gia Phú Quốc, Chi cục Kiểm Lâm Quảng Nam, Ủy Ban Dân tộc Miền núi, Trung tâm Khảo sát Thiết kế Nông nghiệp tỉnh Khánh Hòa, Chi cục Kiểm Lâm An Giang và Thảo Cầm Viên TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ trong các cuộc khảo sát thực tế. TP. HCM, ngày 15 tháng 3 năm 2010 Đinh Trung Chánh v TÓM TẮT Trong Luận án này, chúng tôi trình bày: (1) kết quả khảo sát trên hiện trường và các thí nghiệm trong phòng cũng như trên thực địa nhằm tìm hiểu đặc điểm của những cây Dó bầu (Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte) đang có trầm; (2) ứng dụng di truyền học phân tử để khảo sát đa dạng dưới loài; (3) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, phát sinh phôi soma và tạo hạt giống nhân tạo để nhân nhanh giống cây Dó bầu từ các cá thể cây mẹ có trầm; (4) thăm dò khả năng kích thích tạo trầm bằng các biện pháp vi sinh và hóa học. Phần tổng quan đã dựa vào nhiều nguồn tài liệu tham khảo, nhấn mạnh rằng giá trị cao của gỗ trầm là một động lực dẫn tới sự khai thác quá mức và sự cạn kiệt của các loài cây này trong rừng tự nhiên. Nhưng nông dân các tỉnh được khảo sát từ Quảng Nam trở vào cho đến đảo Phú Quốc đã đáp ứng với tình hình khan hiếm các sản phẩm trầm bằng các kỹ thuật trồng, quản lý, kích thích tạo trầm và khai thác trầm một cách đa dạng. Một số kỹ thuật dân gian để kích thích sự tạo trầm đã được ghi nhận. Nghiên cứu đa dạng dưới loài được thực hiện với hai phương pháp sinh học phân tử: phản ứng PCRRAPD và giải trình tự chuỗi DNA. Sử dụng phản ứng PCRRAPD trên 12 mẫu cá thể cây Dó bầu thí nghiệm từ các xuất xứ gần nhau và trong quần thể cho thấy các mẫu được chia thành 5 nhóm chính, phản ánh sự đa dạng dưới loài của các mẫu Dó bầu được khảo sát. Kết quả nghiên cứu trình tự DNA của bốn xuất xứ Dó bầu khác nhau cũng đã củng cố cho kết luận về đa dạng dưới loài từ phương pháp PCR. Mẫu vật thu thập từ những cây Dó bầu có dấu hiệu tạo trầm được sử dụng cho các thí nghiệm nuôi cấy mô qua hai bước chính: (1) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và (2) nuôi cấy phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo. Các thí nghiệm nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tập trung vào việc xác định môi trường thích hợp, tác dụng của sự bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng cũng như các điều kiện vật lý ảnh hưởng lên sự vi nhân giống invitro từ đỉnh sinh trưởng. Môi trường WPM tỏ ra tốt hơn môi trường MS cho việc nuôi cấy. So sánh các vật liệu nguồn từ Bắc đảo Phú Quốc vi (BD1 và BD2) và từ Nam đảo Phú Quốc (ND1 và ND2) cho thấy xuất xứ này có ảnh hưởng lên sự hình thành và phát triển chồi invitro. Các thí nghiệm nuôi cấy tế bào soma được thiết kế liên hoàn nhằm dẫn tới việc sản xuất hạt giống nhân tạo có thể sử dụng thuận tiện trong việc nhân nuôi cây con thay cho hạt giống thực sinh. Việc nuôi cấy phát sinh tế bào phôi soma từ các mẫu lá và rễ trên môi trường cơ bản MS bổ sung BA, kinetin, NAA, IBA, 2,4D, vitamin B5 cho thấy tỷ lệ phát sinh tế bào soma cao với mẫu nuôi cấy là rễ (dòng ND, nam đảo Phú Quốc). Sau khi có phôi soma, thí nghiệm nhân sinh khối dịch huyền phù phôi soma được tiến hành trên môi trường nuôi cấy có agar, nhân sinh khối trên môi trường lỏng và sau đó tái sinh phôi soma. Thể giả phôi (PLB), một dạng thuận lợi cho sự vi nhân giống, được chuyên hóa bằng cách bổ sung kích thích tố. Hạt giống nhân tạo được thực hiện với natri alginat và calci clorua trên môi trường WPM bổ sung sucrose. Natri alginat 4% cho một độ đông đặc thỏa đáng và không ảnh hưởng bất lợi lên sự tái sinh. Sinh trưởng của cây con sau nuôi cấy trong ống nghiệm được theo dõi ở vườn ươm trong 12 tháng. Sự khác biệt về sinh trưởng của cây con từ bốn xuất xứ ND1, ND2, BD1, BD2 là không có ý nghĩa, nhưng bề rộng lá từ ND1 và ND2 nhỏ hơn từ BD1, BD2. Sự phân lập nấm trên các mô có dấu hiệu hình thành trầm đã cho phép xác định một tập đoàn gồm 10 loài nấm khác nhau hiện diện trong các mô gỗ được khảo sát. Một số chi nấm được xác định tương đồng với một số công trình gần đây. Từ đó, thí nghiệm thăm dò kích thích tạo trầm với bảy nghiệm thức (vi sinh và hóa học) trên ba địa điểm: Đại Lãnh (Nha Trang), Thảo Cầm Viên (TP. Hồ Chí Minh) và Vĩnh Long đã được thực hiện. Kết quả không hoàn toàn đồng nhất ở ba địa điểm này mặc dù xử lý bằng clorua (Cl) mang lại tác dụng cao ở hai trong ba địa điểm và cũng được xếp hạng cao nhất. Xử lý bằng nấm đen và nitrat (NO 3) cho kết quả đứng thứ hai ở Đại Lãnh và Thảo Cầm Viên và thứ nhất ở Vĩnh Long. vii SUMMARY This thesis presents findings from field studies, laboratory and in situ experiments on the characteristics of Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte (eaglewood) and the application of plant cell technologies to propagate specific clones of this endangered species of Vietnam. Besides, explorative experiments on the inducement of eaglewood formation from planted trees of this species were also performed. A review of litteratures was performed, focusing on the characteristics of the species and a wide range of utilization and market value of eaglewood and its derivatives in Asia. The studies on formation of eaglewood in the nature and in controlled experiments were also reviewed. The high value of eaglewood and its products has been the main motivation of its overexploitation, and leading to depletion of the species in natural forests. However, field studies conducted in various provinces in the natural area of the species from Quảng Nam to Phú Quốc shown a positive trend of planting Aquilaria and inducing eaglewood formation initiated by farmers. PCRRAPD and DNA sequencing were used to explore the intraspecific diversity. High similarity values (0.751.0) were obtained from a test with 18 samples, which can be grouped into 5 clusters, relecting the provenances of the samples. DNA sequencing was also performed on 4 samples and chains of both DNA and proteins were elaborated. Distance analyses shown the possibility of grouping the samples based on DNA chain was better than those based on protein sequences. Materials collected during the field visits in North and South Phú Quốc Island from Aquilaria trees having indications of eaglewood formation were used in micropropagation experiments. Two set of experiments were conducted, meristematic and somatic cell cultures, to find appropriate techniques and conditions. The meristematic culture experiments aim to determine suitable medium, the addition of growth regulators and the physical condition affecting in viii vitro propagation and development of plantets. The somatic cell culture experiments were designed according to a schemee that leads to the production of artificial seeds, i.e. a form of culture embedding in organic polymers to be conveniently used as natural seed substitues. In meristematic culture, WPM was found better than MS medium. The addition of BA (0.1 mgl) and NAA (0.1 mgl) was found suitable for protocorm formation, while the supplementation of CW was found giving a high rate of differentiation. A combination of BA (0.1 mgl) and BA (0.1 mgl) + NAA (0.1 mgl) gave better shoot elongation of the plantets invitro. Besides, a high light intensity (54.72 μmolm2s), combined with good aeration is required for the growth and development of the cultures. A comparison of the stocks, including two from North Phu Quoc Island (BD1 and BD2) and two from South Phu Quoc Island (ND1 and ND2), shown that provenances influences the variations of shoot formation and growth invitro. Somatic cell cultures were performed with leaf and root tissues on MS medium with the supplementation of BA, Ki, NAA, IBA, 2,4D, and vitamine B5. Root tissues from ND stock gave good results. Somatic cells developed rapidly in media supplemented with 2,4D, while in media with BA + NAA + Ki + vitamine B5 the somatic cells had a milky white color. Somatic cell suspensions were multiplied in liquid media or in media gelatinized with agaragar and somatic embryos were regenerated. PLB, a convenient form for micropropagation, can be differentiated by the supplementation of BA (5mgl) + NAA (0.2 mgl) or Ki (3 mgl) + NAA (0.2 mgl) and the results were better than BA or Ki alone. Artificial seed production experiments were performed with sodium alginat and the seeds were regenerated with sodium chloride on WPM with the addition of sucrose. Sodium alginate at 4% was found giving an adequate consistency, but a higher concentration can give harmful effect on regeneration. The growth of the seedlings from micropropagated plantets were monitored up to 12 months. The differences of growth performances of plantets from 4 stocks ix ND1, ND2, BD1, BD2 were found nonsignificant but leaf widths of the plantet from ND1 and ND2 stocks were smaller than from BD1, BD2. Ten (10) fungi species were isolated and identified in the samples of infected wood. Certain similarity between our results and fungi recorded by previous authors were recognized. Based on results of the isolation experiments and the field study, an explorative experiement was carriedout with seven treatments: (1) Control, (2) White fungi, (3) Black fungi, (4) Chlorinebased (Cl) , (5) Oilbased, (6) Sulfate (SO4 2) , (7) Nitrate (NO3 ), on three sites: Đại Lãnh, The HCMC Zoo and Vĩnh Long. The results were not totally consistent in three sites, although the effect of chlorinebased treatment was high in two of three sites and was assessed as highest in the total score. Black fungi and nitratebased treatments were ranked second of seven treatments. x MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................iii TÓM TẮT ............................................................................................................................ v SUMMARY ........................................................................................................................ vii MỤC LỤC ........................................................................................................................... x BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................................xiiiii DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................................ xv DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ .......................................................................... xviii Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1.1. Lý do thực hiện đề tài ................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................. 3 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................................. 3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................... 4 1.4.1. Về mặt khoa học ................................................................................................. 4 1.4.2. Về mặt thực tiễn .................................................................................................. 4 1.5. Những đóng góp mới của luận án .............................................................................. 4 Chương 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ......................................................................... 6 2.1. Cây Dó bầu và sản phẩm trầm hương ........................................................................ 6 2.1.1. Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Dó bầu ............................................ 6 2.1.2. Công dụng và phân loại trầm hương ................................................................... 8 2.2. Cơ sở lý thuyết của đề tài ......................................................................................... 10 2.2.1. Đánh giá đa dạng di truyền ............................................................................... 10 2.2.2. Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy phát sinh phôi soma .............. 12 2.2.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ......................................................................... 12 2.2.2.2. Nuôi cấy phát sinh phôi soma ..................................................................... 14 2.2.3. Sự hình thành trầm hương ................................................................................ 17 Chương 3 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 23 3.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 23 3.1.1. Điều tra thực trạng, sưu tầm và lấy mẫu khảo sát ............................................ 23 3.1.2. Đánh giá đa dạng di truyền ở cấp độ dưới loài ................................................. 23 3.1.3. Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và sản xuất hạt giống nhân tạo từ các cây Dó bầu đã cho trầm ........................................................................................ 24 xi 3.1.4. Nghiên cứu bước đầu gây tạo trầm (agarwood) trên cây Dó bầu bằng phương pháp vi sinh và hoá học. .............................................................................................. 24 3.2. Địa điểm và vật liệu thí nghiệm ............................................................................... 24 3.2.1. Địa điểm khảo sát thực địa................................................................................ 24 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 25 3.2.2.1. Vật liệu đánh giá đa dạng di truyền cấp dưới loài: ..................................... 25 3.2.2.2. Vật liệu nuôi cấy mô và tạo hạt nhân tạo:................................................... 26 3.2.2.3. Vật liệu thí nghiệm tạo trầm: ...................................................................... 27 3.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 28 3.3.1. Phương pháp điều tra thực địa và sưu tập mẫu vật ........................................ 28 3.3.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền cấp dưới loài ................................. 29 3.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nuôi cấy phôi soma và tạo hạt nhân tạo ............. 36 3.3.4. Phân lập các loài vi sinh và kích thích sự tạo trầm ........................................ 40 Chương 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............................................. 43 4.1. Kết quả điều tra thực địa .......................................................................................... 43 4.1.1. Hiện trạng gây trồng cây Dó bầu ở các địa điểm điều tra ................................. 43 4.1.2. Phân loại và phân cấp sản phẩm trầm hương ở các địa phương ....................... 45 4.1.3. Kỹ thuật kích thích tạo trầm ở các địa điểm điều tra ........................................ 46 4.2. Kết quả phân tích đa dạng dưới loài của các dòng Dó bầu...................................... 48 4.2.1. Sản phẩm phản ứng PCR với các chất mồi (primers) ....................................... 48 4.2.2. Phân tích trình tự đoạn nucleotid được dòng hóa trong plasmid ..................... 54 4.3. Kết quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và sản xuất hạt giống nhân tạo từ các cây Dó bầu đã cho trầm ........................................................................................ 58 4.3.1. Nuôi cấy chồi đỉnh sinh trưởng cây Dó bầu in vitro ......................................... 58 4.3.2. Nuôi cấy phát sinh phôi soma ........................................................................... 67 4.3.3. Nuôi cấy tế bào soma và tạo hạt nhân tạo cây Dó bầu ..................................... 75 4.3.4. Thuần hóa và ươm nuôi cây Dó bầu cấy mô .................................................... 97 4.4. Kết quả phân lập các loài vi sinh và thí nghiệm kích thích sự tạo trầm ................ 104 4.4.1. Kết quả phân lập và định danh vi sinh vật trong các mô gỗ có trầm .............. 104 4.4.2. Thí nghiệm thăm dò sự lây nhiễm và kích thích tạo trầm .............................. 105 4.4.3. Sự biến đổi của mô gỗ sau khi kích thích tạo trầm ......................................... 109 4.4.4. Thành phần hoá học của tinh dầu trầm do thí nghiệm lây nhiễm ................... 114 xii Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 117 5.1. Kết luận .................................................................................................................. 117 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 119 TIẾNG VIỆT ............................................................................................................... 119 TIẾNG NƯỚC NGOÀI .............................................................................................. 121 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 124 PHỤ LỤC 1. KHẢO SÁT THỰC ĐỊA 124 Phụ lục 1.1.Bảng tổng hợp phỏng vấn các hộ có tham gia khai thác và sản xuất trầm hương Phụ lục 1.2: Hình ảnh phỏng vấn các hộ có tham gia khai thác và sản xuất trầm PHỤ LỤC 2. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN................................................125 Phụ lục 2.1. Tiến trình lấy mẫu và thiết bị khảo sát đa dạng di truyền Phụ lục 2.2 Sản phẩm PCR Phụ lục 2.3: Giải trình tự DNA của 4 dòng Dó bầu có xuất xứ địa lý khác nhau PHỤ LỤC 3. THÍ NGHIỆM NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY DÓ BẦU.................125 Phụ lục 3. 1. Sơ đồ rút gọn nuôi cấy phôi soma và tạo hạt nhân tạo cây Dó bầu Phụ lục 3.2. Sơ đồ vị trí lấy mẫu Dó bầu có trầm để thí nghiệm nuôi cấy Phụ lục 3.3. Hình ảnh lấy mẫu và thí nghiệm nhân giống vô tính Phụ lục 3.4. Môi trường cơ bản dùng trong các thí nghiệm nuôi cấy PHỤ LỤC 4. KHẢO SÁT SỰ LÂY NHIỄM TẠO TRẦM VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TRẦM HƯƠNG................168 Phụ lục 4.1 Hình ảnh lây nhiễm tạo trầm, sơ chế và phân loại trầm hương Phụ lục 4.2. Phiếu Giám định nấm trên các mẫu gỗ Dó bầu có trầm ở các vùng khảo sát Phụ lục 4.3. Thành phần hóa học của trầm hương nguyên liệu mua ở Khánh Hòa Phụ lục 4.4. Thành phần hóa học của trầm hương lấy từ thí nghiệm lây nhiễm xiii BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4dichorophenoxyacetic acid ABA acetyl butyric acid ADP adenosin diphosphat AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình Khuếch đại Độ dài Đoạn) AMP adenosin monophosphat APPCR Arbitrary primed PCR (PCR với chất mồi bất kỳ) ATP adenosin triphosphat BA 6benzyl aminopurin BD Bắc đảo Phú Quốc CAD cinnamil alcol dehydrogenase CORR Correlation (Tương quan) CRD Complete Random Design (Kiểu thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên) CTAB Cetyltrimetilammonium bromur CV% Coefficient of variation (Hệ số biến động) CW Coconut water (nước dừa) DAF DNA amplified fingerprinting (Phương pháp dấu ấn DNA khuếch đại) DAP Day after planting (ngày sau nuôi cấy) DMSO Hóa chất dimetil sulphoxid DNA Desoxyribonucleic acid ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long EC Embryogenic clump (cụm sinh phôi) EDTA Etylen diamine tetra acetat EN Endangered (cấp nguy cơ) GCMS Gas Chromatography Mass Spectrophotometry (sắc ký khí khối phổ) IAA βIndol acetic acid IBA βIndol butyric acid Ki Kinetin (6furfuryl aminopurine) LSD Least significant difference (hiệu số hay số sai biệt có nghĩa nhỏ nhất, hoặc còn gọi là khoảng sai dị tối thiểu) MS Môi trường MurashigeSkoog (1962) MSStat Phần mềm thống kê NAA αNaptalen acetic acid ND Nam đảo Phú Quốc NST Nhiễm sắc thể NTSYS Numerical Taxonomy System (hệ thống phân loại số) xiv PAC Paclobutrazol (chất kìm hảm sinh trưởng phát triển thân lá) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase) PDA PotatoDextrose Agar (môi trường khoai tây, đường dextroz và agar) PLB Protocormlike body (thể sinh cụm chồi hay thể giả phôi) RAPD Randomirized Amplified Polymorphism DNA (đa hình DNA khuếch đại ngẫu nhiên) RCBD Randomized Complete Block Design (kiểu thí nghiệm khối đầy đủ) SAHN Sequential agglomerative hierachic nonoverlapping SDS Sodium dodecyl sulfate (natri dodecyl sulfat) SSR Simple sequence repeat (Loạt lặp lại đơn) SYSTAT Phần mềm thống kê TAE Tris base, Acetic acid và EDTA TE TrisEDTA (Dung dịch đệm) UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (khoảng cách bắt cặp không gia quyền với trung bình cộng) UV Ultra Violet (tia cực tím) WinDis Phần mềm thống kê WPM Woody Plant Medium (môi trường cho cây gỗ) của Loyd và McCown, 1981