BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM Mục lục& KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1952, Lodder Kreger-van-Rij phân loại 164 loại nấm men Năm 1984, Kreger-van-Rij cơng bố có tới 196 lồi Trên giới sử dụng nhiều kĩ ĐỀ TÀI: KIỂM NGHIỆM SINH KHỐI NẤM MEN BÁNH MÌ thuật để định danh phân loại loại nấm men khác Đa số loài nấm men thuộc chi Saccharomyces có lợi ứng dụng nhiều sản phẩm lên men bia, rượu, bánh mì… Trong trình sản xuất bánh mì việc xác định mật độ sinh khối tế bào tiêu chất lượng nấm men quan trọng việc sản xuất chất lượng sản phẩm báo cáo trình bày phương pháp định lượng sinh khối tế bào nấm men có mẫu để góp phần nâng cao hiệu sản xuất 1 TỔNG QUAN VỀ NẤM MEN TRONG SẢN XUẤT BÁNH MÌ SACCHAROMYCES 1.1 Giới thiệu chung Saccharomyces chi nấm men sử dụng rộng rãi ngành thực phẩm làm bánh mì, sản xuất cồn Saccharomyces có nghĩa nấm đường loại vi sinh vật đuợc sản xuất với quy mô lớn giới 1.2 Phân loại Chi Saccharomyces có khoảng 40 lồi (van der Walt, 1970) loài giống biết nhiều chúng ứng dụng làm bánh, bia, rượu,… chúng diện nhiều sản phẩm có đ ường, đất, trái chín, phấn hoa,… 1.3 Một số lồi đại diện • Saccharomyces bayanus • Saccharomyces boulardii • Saccharomyces bulderi • Saccharomyces cariocanus • Saccharomyces cariocus • Saccharomyces cerevisiae • Saccharomyces chevalieri • Saccharomyces dairenensis • Saccharomyces ellipsoideus • Saccharomyces martiniae • Saccharomyces monacensis • Saccharomyces norbensis • Saccharomyces paradoxus • Saccharomyces pastorianus • Saccharomyces spencerorum • Saccharomyces turicensis • Saccharomyces unisporus • Saccharomyces uvarum • Saccharomyces zonatus Trong đó, loại người sử dụng phổ biến Saccharomyces cerevisiae, dùng để sản xuất rượu vang, bánh mì bia từ hàng nghìn năm trước 1.4 Đặc điểm hình thái Nấm men Saccharomyces có hình bầu dục, gần tròn, kích thước khoảng - µm x - µm Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5-14 mircomet Saccharomyces loại nấm men thuộc nhóm thể đơn bào, gồm có nấm men chìm nấm men nổi: • Nấm men chìm (lager): hầu hết tế bào quan sát nảy chồi đứng riêng lẻ cặp đơi Hình dạng chủ yếu hình cầu • Nấm men (ale): tế bào nấm men mẹ sau nảy chồi thường dính lại với tạo thành chuỗi tế bào nấm men Hình dạng chủ yếu hình cầu ovan với kích thước 7-10 micromet Sự khác nấm men v nấm men chìm: khả lên men loại đường trisacarit, ví dụ raffinoza Trong nấm men ch ìm có enzym sử dụng hồn tồn đường raffinoza nấm men sử dụng đ ược 1/3 đường sacaroza Ngồi chúng khác v ề khả hô hấp, khả trao đổi chất lên men khả hình thành bào tử Quá trình trao đổi chất nấm men chìm chủ yếu xảy q tr ình lên men, nấm men xảy mạnh q trình hơ hấp, sinh khối nấm men thu nhiều nấm men chìm Nấm men chìm có nồng độ enzym thấp nấm men Khả tạo bào tử nấm men chìm lâu hạn chế nấm men 1.5 Thành phần cấu tạo Nấm men Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, ngành Ascomycota thuộc giới nấm Nấm men Saccharomyces gồm thành phần chủ yếu sau: Màng tế bào chất: nằm sát vách tế bào, có cấu tạo chủ yếu lipoprotein, giữ vai trò điều hòa vận chuyển chất dinh dưỡng cho tế bào Tế bào chất: gồm có mạng lưới nội chất vị trí nhiều hệ thống enzyme khác nhau, đảm bảo vận chuyển vật chất cho tế bào cấu tử khác máy Golgi, lysosom, không bào, ( ch ứa sản phẩm bị phân cắt, hay chất độc lạ có hại cho tế bào Năng lượng cung cấp cho tế bào qua phản ứng xảy ty thể nằm tế bào chất Trong tế bào chất có nhân chứa thơng tin dị truyền cho tế bào thành phần liên quan trình sinh tổng hợp sinh sản tế bào Nhân nấm men có phần trung thể (centrosome) centrochrometin ph ần đáy nhân có thêm khơng bào (vacuole), bên ch ứa cặp nhiễm sắc thể (NST) bên ngồi màng nhân có nhi ều ti thể bám quanh Ngồi có hạt glycogen, hạt mỡ dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào 1.6 Sinh trưởng sinh sản 1.6.1.Sinh trưởng Quá trình sinh trưởng nấm men gồm pha: pha tiềm sát, pha số, pha cân pha suy vong.Trong tiềm phát nấm men không sinh sản, pha thứ hai nấm men bắt đầu nảy chồi mạnh v lên men Trong pha cân sinh trưởng, nấm men ổn định lên men mạnh Ở pha cuối cùng, sinh sản ngừng lại bắt đầu kết lắng Khả kết lắng nấm men có vai trò quan trọng Men chìm kết lắng dạng đáy thùng lên men men lên bề mặt dịch lên men Tốc độ lên men tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố: khả lên men nấm men, hoạt tính sinh lý số lượng tế bào chúng môi trường, phụ thuộc vào nhiệt độ, pH, thành phần hố học dịch lên men Ngồi phụ thuộc vào hàm lượng chất prơtêin tế bào nấm men 1.6.2.Sinh sản Men sinh sản vơ tính thơng qua mọc chồi hữu tính thơng qua hình thành nang bào tử Trong q trình sinh sản vơ tính, chồi phát triển từ men mẹ điều kiện thích hợp sau đó, chồi đạt tới kích thước men trưởng thành tách khỏi men mẹ Khi điều kiện dinh d ưỡng men có khả sinh sản hữu tính tạo nang bào tử 1.6.2.1 Sinh sản vơ tính Sinh sản vơ tính nấm men thường gặp nẩy chồi, chồi hoàn chỉnh phát triển ngay, chồi nối liền với tế b mẹ (bud scar) chồi rời tế bào mẹ gọi điểm sinh sản (birth scar) Sự phân đôi (fission) không nhận thấy Saccharomyces cerevisiae thường gặp Schizosaccharomyces 1.6.2.2 Sinh sản hữu tính Nấm men không sinh quan sinh dục mà chúng sinh hai tế bào dinh dưỡng mà nhiệm vụ giống giao tử; Quá trình hợp tế bào chất (plasmogamy) hợp nhân (karyogamy) xảy v thành lập tế bào nhị bội, nang cuối bào tử nang thành lập nang Số bào tử nang tùy thuộc vào số lần phân chia nhân thường 8, bào tử nang giải phóng, nẩy mầm để hình thành tế bào dinh dưỡng từ chúng sinh sản vơ tính nẩy chồi hay phân đôi Tuy nhiên, sinh sản hữu tính khơng phải đơn giản Theo Guilliermond (1949), nấm men có loại chu kỳ sinh trưởng hay vòng đời khác mô tả loại nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ludwigii SchizoSaccharomyces octosporus  Saccharomyces cerevisiae Đây loài dị tản với bào tử nang hình thành bào tử nang mang gen a, hai nang với bào tử nang mang gen tạo loại gen phát triển độc lập Khi tiến hành tiếp hợp , loài a tiếp hợp thành chồi mang tính giao tử hai giao tử tế bào hợp tử (zygote), sau tế bào tiếp hợp nẩy chồi cho tế bào giống hệt tế bào tiếp hợp mang 2n NST, tế bào tiếp hợp phát triển thành nang (tế bào tiếp hợp to tế bào dinh dưỡng có hình bầu dục) điều kiện môi trường bất lợi, tế bào tiếp hợp giảm phân để hình thành tế bào đơn bội tế bào đơn bội mang gen a tế bào đơn bội mang gen  Saccharomyces ludwigii Nấm men bắt đầu với bào tử nang A1, A2, A1, A2 nang mỏng vỏ; bào tử nang hoạt động giao tử Sự tiếp hợp với A1 A2 cuối thành lập tế bào tiếp hợp nhị bội nang, tế bào tiếp hợp nẩy mầm với ống mầm (germ tube) th ò ngoài, ống mầm loại tế bào đa nhân hoạt động sợi khuẩn ty nhị bội cuối phát triển thành tế bào nhị bội xem nang Nhân tế bào nhị bội với hai nang A1 hai nang A2; Như v ậy, Saccharomyces ludwigii có vòng đời hồn tồn nhị bội tế bào đơn bội giai đoạn bào tử nang để hình thành nang tiếp hợp để tạo tế bào tiếp hợp  SchizoSaccharomyces octosporus Đây loài nấm đồng tán, tế bào dinh dưỡng đơn bội phân đôi thành tế bào con, tế bào đơn bội tế bào giao tử sinh sản hữu tính xảy với hai tế bào tiến gần lại mọc chối (producrance) v tiếp xúc với tạo thành đường hay ống thông với gọi l ống tiếp hợp (conjugation tube) hay kênh tiếp hợp (conjugation canal), nhân hai tế bào giao tử di chuyển vào ống tiến hành tiếp hợp hình thành nhân nhị bội, tế bào chất hai giao tử hợp thành tế bào tiếp hợp sau tạo thành nang Nhân tế bào hợp tử phân chia lần đầu giảm phân để thành nhân đơn bội tiếp đến phân chia thành nhân nhân thành bào tử nang chu kỳ sinh trưởng hoàn tất Như vây, nấm men SchizoSaccharomyces octosporus có chu kỳ sinh trưởng đối xứng với Saccharomyces ludwigii chủ yếu giai đoạn đơn bội ỨNG DỤNG SINH KHỐI NẤM MEN 2.1 Vai trò nấm men sản xuất bánh mì Trong cơng nghệ sản xuất bánh mì, giai đoạn lên men bột bánh mì đóng vai trò định đến chất lượng bánh mì Quá trình lên men thực nấm men.Khi nấm men chuyển hóa đường có bột mì thành cồn CO theo phương trình phản ứng sau Chính CO2 làm bánh mì nở Khi CO tạo thành bị giữ lại mạng gluten Gluten bột mì loại protein đặc biệt, chúng có tính chất đàn hồi tạo mạng protein khác khơng có đặc tính Khi nướng bánh mì nhiệt độ cao,CO2 tăng thể tích, mạng gluten căng tạo thành túi chứa CO Khi nhiệt độ cao hơn,CO2 khỏi túi chứa tạo lỗ xốp bánh, kết bánh có độ xốp.khả lên men mạnh độ xốp bánh nhiều bánh nở, thể tích bánh tăng Tuy nhiên, khơng phải thể tích bánh lớn định đến chất lượng bánh mì Mức độ tăng thể tích bánh mì nói lên khả lên men bột mì nấm men Các nước sản xuất bánh mì có u cầu mức tăng thể tích khác Điều phụ thuộc vào thói quen sử dụng bánh mì 2.2 Phân loại chế phẩm nấm men Trong sản xuất bánh mì nước châu Âu, người ta sử dụng dạng nấm men để làm nở bánh: • • • Dạng nấm men lỏng Dạng nấm men nhão (paste) Dạng nấm men khô 2.2.1.Nấm men dạng lỏng Nấm men dạng lỏng có ưu điểm dễ sử dụng có hoạt lực làm nở bánh cao Tuy nhiên, nấm men lỏng có nhược điểm lớn khó bảo quản, thời gian sử dụng nằm giới hạn 24 sau sản xuất Chính thế, việc sản xuất sử dụng nấm men lỏng thường tổ chức phân xưởng riêng sở sản xuất bánh mì mang tính chất tự cung cấp Nấm men lỏng sản phẩm thu nhận sau trình lên men hiếu khí kết thúc Người ta thu nhận dịch lên men có chứa sinh khối nấm men dạng phát triển để sản xuất bánh mì Lượng nấm men sử dụng thường lớn từ 1-10% so với khối lượng bột mì đem sử dụng Ngoài ra, sử dụng nấm men lỏng vấn đề chất lượng quan tâm dễ bị nhiễm vi sinh vật lạ, bị lẫn sản phẩm trao đổi chất nấm men Hiện nhiều sở sản xuất bánh mì nước châu Âu châu Mỹ khơng sử dụng nấm men lỏng mà sử dụng chủ yếu nấm men dạng paste dạng khô 2.2.2.Nấm men dạng paste Nấm men dạng paste khối nấm men thu sau ly tâm nấm men lỏng Nấm men paste thường có độ ẩm khoảng 70-75% Nấm men thường có hoạt lực nở bánh nấm men lỏng trình ly tâm thời gian kéo dài, nhiều tế bào nấm men chết Nếu bảo quản lạnh 4-7oC, ta sử dụng nấm men paste khoảng 10 ngày Như chuyển nấm men lỗng sang nấm men paste, ta kéo dài thời gian sử dụng thuận lợi việc vận chuyển Ở nhiều nước, nhiều sở sản xuất bánh mì thường sử dụng nấm men paste.Liều lượng sử dụng khoảng 3% – 5% so với bột khối lên men,điều kiện tùy vào chất lượng nấm men paste 2.2.3.Nấm men khô Nấm men khô lại sản xuất từ nấm men paste Người ta sấy nấm men paste nhiệt độ < 40oC sử dụng phương pháp sấy thăng hoa Nấm khơ có độ ẩm < 10%, hoạt lực nở không cao lại có ưu điểm lớn thời gian sử dụng lâu dễ vận chuyển 2.3 Chỉ tiêu nấm men dùng sản xuất Không thể đơn dựa vào hình thái kích thước, hay khả lên men nấm men để xác định nấm men tốt hay xấu, cần có phối hợp thơng số Kết phân tích nấm men bánh mì sản xuất Liên Xô số nước khác, người ta đưa tiêu chuẩn nấm men Saccharomyces cerevisiae chọn để sản xuất men bánh mì sau:   Tế bào lớn, có dạng hình cầu hay hình trứng, đường kính 7×11 mm Hoạt tính maltase: biểu thị thời gian để 1g nấm men ép phóng thích 10ml CO2  lên men 20 ml dung dịch đường maltose 5%≤70 phút Hoạt lực làm dậy bột: biểu thị thời gian 5g nấm men ép làm nở khối bột 280g đến  chiều cao 1,5cm theo khn có kích th ước xác định, không 45 phút 100% bền vững với rỉ đường : tiêu đưa sau nhiều năm nghiên cứu, cho thấy nấm men nhạy cảm với nồng độ rỉ đường khả sinh sản qua hệ nhanh Chủng nấm men đánh giá bền vững 100% rỉ đường, chúng tồn 6-7 hệ mà khơng bị chết mơi trường có nồng  độ rỉ đường cao Khả tích lũy sinh khối nấm men l 0,2/giờ, điều kiện nuôi nấm men có    sục khí, mơi trường có nồng độ chất khô l 8% 30ºc Khả sinh sản nhanh bị thay đổi trình bảo quản Thường lên men tốt nồng độ đường 30% với PH = Có khả lên men đường saccharose , glucose maltose Có enzym zimaza maltaza cao Độ bền nấm men > 72  Nhiệt độ: topt = 28-300C  pH: pHopt=4,5-5,5  Oxy: Saccharomyces cerevisiae loại vi sinh vật hiếu khí tùy tiện Ngừng cung cấp oxy 15 giây gây tác dụng ” âm” hoạt động sống nấm men  Dinh dưỡng: có khả sử dụng đường glucose, galactose, saccharose, raffinose, maltose,glycerin nguồn carbon, sử dụng acid amin muối amôn nguồn nitơ 10 Các tiêu cảm quan đánh giá chất lượng bột sản xuất bánh mì: Loại bột Loại thượng hạng Loại I Loại II Loại thô Chỉ tiêu Màu sắc Cho tất loại bột Mùi Cho tất loại bột Vị Cho tất loại bột Sâu mọt Đặc tính Màu trắng trắng ngà Màu trắng trắng ngà Màu trắng ngà trắng sẫm Màu trắng ngà trắng sẫm, có mãnh vỏ Mùi bình thường bột, khơng có mùi hơi, mốc mùi lạ Vị ngọt, vị bình thường bột khơng có vị chua, đắng vị lạ Khơng có sâu mọt 11 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THU SINH KHỐI NẤM MEN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM SINH KHỐI NẤM MEN 4.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc 12  Một số đặc điểm phương pháp • Định số lượng tế bào vi sinh vật sống • Chọn lọc vi sinh vật tùy mơi trường điều kiện ni cấy • Thực kỹ thuật hộp trải hay hộp đổ • Trong phương pháp cần thực pha loãng mẫu với mật độ tế bào thích hợp để xuất khuẩn lạc riêng lẻ • Số lượng khuẩn lạc tối ưu 25-250 • Điều kiện ni cấy cần đảm bảo cho số khuẩn lạc xuất tối đa • Dễ cho sai số lớn => lặp lại đĩa • Đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml • Là phương pháp tốt để xác định mật độ tế bào sống  Ưu điểm: độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật mật độ thấp mẫu  Mật độ tế bào mẫu tính theo cơng thức: Mi (CFU/ml) = Ai x Di/ V Trong đó: Mi : mật độ tế bào vi sinh vật mẫu ban đầu Ai : số khuẩn lạc trung bình/đĩa Di : độ pha lỗng V : dung tích huyền phù tế bào cho vào đĩa 13 4.2 Định lượng nấm men mẫu  Cách tiến hành Cân 10g mẫu, bổ sung 90ml dung dịch pha loãng Mẫu đồng pha lỗng Hút vơ trùng 0,1ml dịch mẫu lên đĩa môi trường DBRC DG18, dùng que trang trải dịch mẫu mặt đĩa môi trường khơ Nếu mật độ q thấp cấy 1ml mẫu Đặt ngửa đĩa bao nylon, để hở miệng bao, ủ 25°C 5-7 ngày Thực đĩa cho nồng độ pha loãng Đếm tính số lượng khuẩn lạc đĩa Khi cần thiết phỉa quan sát kính hiển vi soi hay kính lúp để phân biệt khuẩn lạc nấm men hay nấm mốc Tính mật độ CFU/g theo cơng thức nêu phần 4.1 Nếu cần phân loại hay định danh cấy chuyền vào ống thạch nghiêng SDA định danh  Quy trình định lượng tiến hành theo sơ đồ: Đồng pha loãng mẫu thành độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… TÀI LIỆU THAM KHẢO Trải 0,1 ml mẫu lên đĩa DRBC DG18, ủ ngửa đĩa 250C, 5-7 ngày [1] Trần Linh Thước, Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước, Thực Phẩm Và Mỹ Phẩm NXB Giáo Dục, 2012 Đếm khuẩn lạc, tính mật độ (CFU/g) Ay Huey Huang, Tsu Lan Wu, [2] Hsein Chang Chang, Shiang Ning Leaw, and Tsung Chain Chang (2001) Rapid Identification of Yeasts in Positive Blood Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ 300C, ngày Cultures by a Multiplex PCR Method [3] Dương Thị Thùy Dương, đồ ánĐịnh kĩ thuật danhnuôi cấy bảo quản nấm men công nghiệp,2009 14 [4] http://vi.wikipedia.org/wiki/N%E1%BA%A5m_men [5] http://vi.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae 15 ... đổi chất nấm men chìm chủ yếu xảy tr ình lên men, nấm men xảy mạnh trình hơ hấp, sinh khối nấm men thu nhiều nấm men chìm Nấm men chìm có nồng độ enzym thấp nấm men Khả tạo bào tử nấm men chìm... 2.1 Vai trò nấm men sản xuất bánh mì Trong cơng nghệ sản xuất bánh mì, giai đoạn lên men bột bánh mì đóng vai trò định đến chất lượng bánh mì Quá trình lên men thực nấm men. Khi nấm men chuyển... dụng bánh mì 2.2 Phân loại chế phẩm nấm men Trong sản xuất bánh mì nước châu Âu, người ta sử dụng dạng nấm men để làm nở bánh: • • • Dạng nấm men lỏng Dạng nấm men nhão (paste) Dạng nấm men khô