WELCOME Nhóm CƠNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP ADN TÁI TỔ HỢP CÁC ENZYM CHỦ YẾU CÁC VECTOR SỬ DỤNG Nội dung CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ TẠO, TÁCH VÀ CHỌN LỌC DỊNG ADN TÁI TỔ HỢP • • Tạo từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác Nhờ kỹ thuật ghép nối đoạn ADN cá thể khác loài, loài khác Sơ đồ q trình tạo dòng AND tái tổ hợp CÁC ENZYM CHỦ YẾU DÙNG TRONG KỸ THUẬT ADN TÁI TỔ HỢP (E) (E) cắt cắt giới giới hạn hạn (E) nuclease nuclease Enzym (E) (E) polymerase polymerase ((E) E) ligase ligase ENZYM CẮT GIỚI HẠN • • Là enzym có khả cắt ADN vị trí đặc hiệu thành đoạn ADN ngắn Có loại enzym giới hạn:  Loại I: cắt điểm cách vị trí nhận biết khoảng 1000-5000 nucleotid Loại II Cắt vị trí nhận biết Loại III: Cắt điểm cách vị trí nhận biết khoảng 20 nucleotid ENZYM POLYMERASE • • • Xúc tác cho trình chép a.Nu (ADN, ARN) Tổng hợp a.Nu cách nối Nu với theo NTBS dựa theo mạch khn Qúa trình tổng hợp diễn theo chiều 5’-3’ khởi đầu cần có đầu 3’- OH tự ARN polymera se cADN ENZYM LIGASE • • Ligase enzyme xúc tác phản ứng nối hai mảnh DNA cách tạo cầu nối phosphodiester đầu 5’(P) đầu 3’(OH) hai nucleotide đứng cạnh Trong sinh học phân tử, người ta coi ligase chất keo phân tử để kết dính mẫu DNA lại với Có cách: Nối đầu Nối đầu lệch • • CÁC VECTƠ SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP Vectơ chuyển gen ( phân tử ADN) phương tiện để đưa gen cần chuyển vào tế bào chủ Muốn vectơ chuyển gen cần có đặc điểm sau: Có điểm khởi đầu chép Có trình tự đặc hiệu để enzym cắt giới hạn bám vào Có gen thị Có khả tự nhân lên nhiều tế bào chủ • • • • CÁC VECTƠ SỬ DỤNG TRONG CƠNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP ỨNG DỤNG: • • • • • Tạo dòng, nhân dòng đoạn trình tự gen Nghiên cứu biểu đoạn trình tự ADN, gen Chuyển gen vào tế bào sinh vật khác Sản xuất ARN Sản xuất protein CÁC VECTƠ SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP VECTƠ PLASMID: Plasmid pBR322 CÁC VECTƠ SỬ DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP VECTƠ PHAGE: • Dùng làm vectơ chuyển gen khả thực việc mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào chủ nhận (tải nạp) • • Hiện nay, thường sử dụng Phage M13 làm vectơ tách dòng Phage M13 có ADN sợi đơn chứa 10 gen, có kích thước khoảng 6400bp, xâm nhiễm vào E.coli Bluescript M13 10 CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ • • • MỤC ĐÍCH SỬ DỤNG: Ni số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tạo dòng Hệ thống tế bào chủ cần đơn giản, dễ sử dụng Dùng để biểu gen, đặc biệt sinh vật nhân chuẩn bậc cao động vật, thực vật Hệ thống tế bào chủ càn mang tính đặc thù Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp TẾ BÀO CHỦ NHÂN SƠ TẾ BÀO CHỦ NHÂN CHUẨN 11 TẾ BÀO CHỦ NHÂN SƠ: • VK E.coli sử dụng nhiều kỹ thuật tạo tách dòng gen đáp ứng yêu cầu tế bào chủ lý tưởng, tế bào dễ nuôi cấy, dễ giữ nhân giống, chấp nhận nhiều vectơ 12 TẾ BÀO CHỦ NHÂN CHUẨN: • Một nhược điểm sử dụng E.coli làm tế bào chủ để tách dòng gen sinh vật nhân sơ khơng có màng bao bọc NST Do gen sinh vật nhân chuẩn biểu E.coli mơi trường khác với mơi trường bình thường gen sinh vật nhân chuẩn • Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn rộng từ VSV nhân chuẩn bậc thấp nấm men, nấm mốc, tảo tế bào sinh vật đa bào phức tạp động vật, thực vật 13 TẾ BÀO NẤM MEN (Saccharomyces cerevisiae): • • Là SV nhân chuẩn ưa thích để nghiên cứu kỹ thuật di truyền Sử dụng nhiều để sản xuất bánh mỳ bia 14 CÁC TẾ BÀO CHỦ THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT: • • Có thể sử dụng vật chủ thí nghiệm thao tác gen • Tảo đơn bào sử dụng làm tế bào chủ nhiều thí nghiệm thao tác gen (ở thực vật) Các tế bào vật chủ thường ni cấy mơi trường thích hợp điều kiện để sử dụng thí nghiệm thao tác gen so với tế bào thể 15 Tế bào thận Tế bào thận Khỉ xanh Châu Phi Chuột đồng nhỏ THÀNH TỰU 16 Tế bào thận Tế bào tử cung Phôi người Chuột bạch Tạo, tách chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp TẠO PLASMID TÁI TỔ HỢP: Tạo nguồn gen: có phương pháp khác để thu thập gen: • • • Thu nhận ADN từ hệ gen Tổng hợp gen phương pháp hóa học Lập ngân hàng ADN bổ trợ (cADN) Tạo plasmid tái tổ hợp: gắn ADN cADN vào vectơ chuyển gen để tạo plasmid tái tổ hợp Có nhiều phương pháp gắn đoạn ADN, cADN vào plasmid: • • • Phương pháp dùng đầu dính Phương dùng đoạn nối linker Phương pháp dùng enzym terminal transferase 17 Tạo, tách chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp TÁCH DÒNG ADN TÁI TỔ HỢP: Tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ • Biến nạp thực nhiều cách: • • • • Xử lý tế bào chủ nhận hóa chất Phương pháp xung điện Phương pháp vi tiêm Phương pháp dùng súng bắn gen 18 Tạo, tách chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp CHỌN LỌC DÒNG ADN ĐẶC HIỆU VÀ BIỂU HIỆN GEN: Chúng ta cần kiểm tra, chọn lọc dòng gen mong muốn sau tạo điều kiện cho gen biểu Chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp đặc hiệu: • • Bởi sử dụng loại gen khác nên tạo số lượng dòng ADN lớn loại enzym giới hạn cắt đoạn gen khơng mong muốn nhà nghiên cứu muốn tách dòng ADN cụ thể đặc hiệu nên cần phải tiến hành chọn lọc Có ba hướng để chọn lọc dòng ADN: • • • Lai a.Nu: dùng mẫu ARN dò đặc hiệu Phát kiểu hình Phát phản ứng miễn nhiễm 19 Tạo, tách chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp Biểu gen mong muốn: • Muốn gen tạo dòng biểu protein cần phải có vectơ mang đầy đủ yếu tố phiên mã dịch mã Đối với dòng gen động vật có vú tạo sản phẩm protein có hoạt tính sinh học cần với số lượng lớn có giá trị thương mại 20 Thành tựu công nghệ ADN tái tổ hợp 21 ... enzym terminal transferase 17 Tạo, tách chọn lọc dòng ADN tái tổ hợp TÁCH DÒNG ADN TÁI TỔ HỢP: Tiến hành biến nạp plasmid tái tổ hợp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ • Biến nạp thực nhiều cách: • •...Nhóm CƠNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP ADN TÁI TỔ HỢP CÁC ENZYM CHỦ YẾU CÁC VECTOR SỬ DỤNG Nội dung CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ TẠO, TÁCH VÀ CHỌN LỌC DỊNG ADN TÁI TỔ HỢP • • Tạo từ hai hay nhiều... dòng ADN tái tổ hợp TẠO PLASMID TÁI TỔ HỢP: Tạo nguồn gen: có phương pháp khác để thu thập gen: • • • Thu nhận ADN từ hệ gen Tổng hợp gen phương pháp hóa học Lập ngân hàng ADN bổ trợ (cADN) Tạo