TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐỒNG NAI KHOA THỰC PHẨM, MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU DƯỠNG TIỂU LUẬN MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề Tài: Sản Xuất Giống Cây Trồng Sạch Bệnh GVHD: Ths Đinh Quốc Thượng Biên Hòa ngày 16/5/2015 LỜI CÁM ƠN Cám ơn trường Đại Học Công Nghệ Đồng Nai, Khoa Thực Phẩm, Môi Trường Và Điều Dưỡng cám ơn thầy Đinh Quốc Thượng giáo viên bô môn cơng nghệ sinh học giúp chúng em hồn thành tốt tiểu luận Trong trình học tập làm tiểu luận em nhận môn cơng nghệ sinh học có giá trị bổ ích sống tương lai cho chúng em sau Trong tiểu luận chúng em xin trình bày đề tài sản xuất giống trồng bệnh với ứng dụng quan trọng vào đòi sống q trình hồn thành tiểu luận xin cám giúp đỡ thầy em xin cám ơn NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN Nhận xét ths Đinh Quốc Thượng: …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Chữ ký giáo viên Thầy Đinh Quốc Thượng MỤC LỤC PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Định nghĩa 1.1.Công nghê sinh học PHẦN 2: SƠ LƯỢC SẢN XUẤT GIỐNG CÂY TRỒNG SẠCH BỆNH 2.1 Cơ sở di truyền phương pháp tạo bệnh 2.2 Thành tựu sản xuất giống trồng bệnh 2.3 Kỹ thuật tạo bệnh PHẦN 3: ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT TẠO CÂY SẠCH BỆNH TRÊN CÂY LAN 12 3.1 Chọn mẫu khử trùng mẫu cấy .12 3.2 Nhân giống 13 3.3 Tái sinh hoàn chỉnh in-vitro 14 3.4 Chuyển vườn ươm 14 PHẦN 4: ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CÂY ĂN TRÁI CÓ MÚI SẠCH BỆNH 15 4.1 Tổng quan 15 5.2.2 Nhược điểm: 21 PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Định nghĩa 1.1 Công nghê sinh học Khái niệm công nghệ sinh học bao trùm nhiều quy trình hai cơng đoạn việc làm thay đổi sinh vật sống theo mục đích người, trở với hóa động vật, trồng trọt, cải tạo sinh vật thông qua hoạt động sinh sản chọn lọc có điều kiện lai ghép Khái niệm thời đại bao gồm kỹ thuật gen công nghệ nuôi cấy mô tế bào Hiệp hội Hóa học Hoa Kỳ định nghĩa cơng nghệ sinh học việc ứng dụng khía cạnh sinh học sinh vật, hệ thống q trình vào nhiều ngành cơng nghiệp khác để hiểu biết khoa học sống cải tiến giá trị vật liệu sinh vật dược, trồng chăn nuôi Công nghệ sinh học lĩnh vực công nghệ cao dựa tảng khoa học sống, kết hợp với quy trình thiết bị kỹ thuật nhằm tạo công nghệ khai thác hoạt động sống vi sinh vật, tế bào thực vật động vật để sản xuất quy mô công nghiệp sản phẩm sinh học có chất lượng cao, phục vụ cho lợi ích, nhu cầu người đồng thời phát triển kinh tế - xã hội bảo vệ môi trường 1.1.1 Ứng dụng công nghệ sinh học cuốc sống Ngày nay, công nghệ sinh học ứng dụng vào nhiều lĩnh vực sống: công nghiệp, nông nghiệp, y học Bằng kiến thức sinh học thực vật, động vật, nấm, vi khuẩn, sử dụng "công nghệ DNA tái tổ hợp" nhà khoa học cố gắng tạo trồng, vật ni có suất chất lượng cao, loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh cho người công nghệ tế bào kĩ thuật chuyển gen phát triển Việt Nam Hoa hồng lớn lên từ tế bào qua phương pháp nuôi cấy mô Công nghệ sinh học lĩnh vực rộng tham gia vào nhiều khâu lĩnh vực khác: Tin sinh học lĩnh vực đa ngành giải vấn đề sinh học cách sử dụng kỹ thuật tính tốn, làm cho tổ chức nhanh chóng phân tích liệu sinh học Lĩnh vực gọi sinh học tính tốn, định nghĩa là" khái niệm sinh học phân tử sau áp dụng thơng tin kỹ thuật để hiểu tổ chức thông tin liên kết với phân tử này, quy mô lớn." Tin sinh học đóng vai trò quan trọng lĩnh vực khác nhau, chẳng hạn chức gen, cấu trúc gen, proteomics, tạo thành thành phần quan trọng lĩnh vực công nghệ sinh học dược phẩm Công nghệ sinh học lam thuật ngữ sử dụng để mô tả ứng dụng hàng hải thủy sản công nghệ sinh học, ứng dụng tương đối Cơng nghệ sinh học xanh áp dụng công nghệ sinh học nơng nghiệp Một ví dụ việc lựa chọn hóa thực vật thơng qua vi nhân giống Một ví dụ khác thiết kế chuyển gene thực vật để phát triển môi trường cụ thể diện (hoặc khơng) hóa chất Một hy vọng cơng nghệ sinh học xanh sản xuất giải pháp thân thiện với môi trường so với truyền thống công nghiệp nông nghiệp Một ví dụ việc kỹ thuật chuyển gen kháng sâu bệnh vào thực vật, khơng cần phải sử dụng chất bảo vệ thực vất nhiều Một ví dụ bắp chuyển gene Công nghệ sinh học đỏ áp dụng lĩnh vực y dược Một số ví dụ thiết kế sinh vật để sản xuất kháng sinh, kỹ thuật chữa bệnh di truyền qua kỹ thuật di truyền Công nghệ sinh học trắng, gọi cơng nghệ sinh học cơng nghiệp, công nghệ sinh học áp dụng công nghiệp Một ví dụ ni cấy vi sinh vật để sản xuất hóa chất hữu ích Dùng enzyme chất xúc tác cơng nghiệp để sản xuất hóa chất có giá trị tránh gây nhiễm mơi trường Cơng nghệ sinh học trắng có xu hướng tiêu thụ tài nguyên so với quy trình truyền thống sử dụng để sản xuất hàng công nghiệp.[4] 1.1.2 Sản xuất trồng sach bệnh Phương pháp nuôi cấy mô áp dụng từ lâu nhà trồng hoa nhà chọn giống muốn nhân nhanh giống đặc cấp, cải thiện hiệu thời kì chọn lọc Ni cấy mơ tế bào thực vật tiến hành Việt Nam từ năm 70 Hiện nay, nước có vài chục phòng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào Phần lớn phòng thí nghiệm tiến hành nghiên cứu ứng dụng: chủ yếu kỹ thuật invitro ống nghiệm Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo bệnh có khả đóng góp cho nghiên cứu ứng dụng xa nữa, đặc biệt cải biến di truyền cơng nghệ thu nhận chất có hoạt tính sinh học Ở trồng bị nhiễm Virus sinh trưởng phát triển kém, suát phẩm chất thấp ngừng sinh trưởng khơng cho thu hoạch Việc nhiễm Virus trồng nguyên nhân làm thối hóa giống Vì u cầu đặt tạo bệnh Làm Virus việc giải phóng Virus khỏi bị nhiễm Virus Việc có ý nghĩa to lớn phục tráng giống trồng bị thối hóa nhiễm bệnh virus cung cấp giống có chất lượng tốt cho sản xuất Đề tài "kỹ thuật nuôi cấy invitro ứng dụng tạo bệnh" giúp cho người có kiến thức chọn tạo giống trồng, hướng nghiên cứu ứng dụng tiến hành thành công PHẦN 2: SƠ LƯỢC SẢN XUẤT GIỐNG CÂY TRỒNG SẠCH BỆNH 2.1 Cơ sở di truyền phương pháp tạo bệnh Virus loại bệnh chữa Bệnh Virus gây tổn thất lớn suất, phẩm chất Bệnh Virus lan truyền qua hệ nhân giống vô tính gây tượng thối hóa giống: khoai tây, khoai lang, loại hoa trồng từ củ cành giâm Việc tạo giống Virus biện pháp bắt buộc phải tiến hành cho tất nhân giống vơ tính biện pháp phục tráng giống cho giống bị thối hóa virus Ni cấy đỉnh sinh trưởng thực chất nuôi cấy invitro, phận nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có chứa từ đến vài non Những tạo từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có độ đồng cao chúng sinh từ tế bào chưa bị phân hóa tế bào nơi khác Các giả thiết giải thích tế bào sinh trưởng Virus: + Virus vận chuyển nhờ hệ thống mô dẫn hệ thống chưa có mơ phân sinh Virus khơng thể vào tế bào mô phân sinh + Tại mô phân sinh đỉnh tế bào có tốc độ phân chia cao khơng đồng với tốc độ nhân vật chất di truyền tế bào Virus tế bào mô phân sinh phân chia không chép thông tin di truyền Virus + Mô phân sinh đỉnh nơi tổng hợp auxin nên thường có hàm lượng cao, có tác dụng ngăn cản ức chế chép vật chất di truyền Virus 2.2 Thành tựu sản xuất giống trồng bệnh Đầu năm 1949, Limmaset Cornuet chứng minh Virus phân bố theo quy luật gần đỉnh sinh trưởng mật độ Virus giảm Năm 1952, Morel Martin người tạo thược dược khỏe từ bệnh thông qua đường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ áp dụng rộng rãi để nhân vơ tính bệnh Virus nhiều loài Năm 1978, Walkey tạo thuốc đậu ngựa Virus từ thuốc bị nhiễm bệnh TMV đậu ngựa bị nhiễm bệnh CMV Kartha Gamborg tạo 100% sắn Virus cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bị bệnh 2.3 Kỹ thuật tạo bệnh Điều kiện cần thiết nuối cấy in vitro Điều kiện trước tiên vô trùng Tất khâu nuôi cấy trùng: dụng cụ nuôi cấy, mẫu nuôi cấy, môi trường (giá thể) thao tác nuôi cấy…Sự thành công hay thất bại công việc nuôi cấy mô phụ thuộc vào việc vô trùng Nếu có khâu khơng vơ trùng mẫu ni cấy bị nhiễm trùng chết Phòng thí nghiệm ni cấy mơ phòng thí nghiệm chun hóa cao với thiết bị chun dụng, bao gồm phòng chuẩn bị mẫu, phòng cấy mẫu, phòng ni nhà lưới để đưa đất Mơi trường ni cấy giá thể có đầy đủ chất dinh dưỡng, hoạt chất vi lượng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng Quy trình kỹ thuật tạo bệnh: Trình tự thực hiện: Chọn khỏe mạnh đem trồng nhà kính Ni dưỡng nhiệt độ 380C, chăm sóc cho sinh trưởng, phát triển tốt Lấy mẫu chồi đỉnh với kích thước từ 0,2 – mm để khử Virus Cấy mẫu vào môi trường nuôi dưỡng giàn lắc – tuần nhân chuyển lần đạt đến số lượng chồi định Tách nuôi thạch agar để thúc chồi thúc rễ Sử dụng môi trường: MS + IAA + GA3 Ra lồng lưới ( đặt lồng lưới riêng) Kiểm tra Virus (Test): phương pháp: Sử dụng thị + Phương pháp Huyết Thanh Phương pháp Elisa + Sử dụng Kính hiển vi điện tử + Phương pháp lai DNA Khi kiểm tra có khả xảy ra: + Khả 1: Dương tính ( Vẫn Virus) + Khả 2: Âm tính (đã Virus) Những mẫu Virus tiến hành nhân nhanh để tạo thành thương phẩm theo quy trình ni cấy mơ tế bào - Nếu cần bảo tồn lưu giữ nguồn gen dùng phương pháp lạnh sâu PHẦN 3: ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT TẠO CÂY SẠCH BỆNH TRÊN CÂY LAN Quy trình nuôi cấy tạo hoa Lan bệnh: 3.1 Chọn mẫu khử trùng mẫu cấy Tách vảy hành từ cây, bóc già xuất mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng Cắt bỏ gốc mầm, sau khử trùng cách ngâm cồn 70% 30 giây, rửa nước cất vô trùng ngâm dung dịch Ca(OCl) 2% 25 phút, việc khử trùng tiến hành tủ cấy Mô rửa lại với nước cất vô trùng - lần Mỗi mầm đặt đĩa petri vô trùng cẩn thận tách non Sau lần tách, nhúng mầm vào cồn 70 0C giây rửa với nước cất vô trùng Chuyển sang đĩa petri vô trùng khác, tách mầm dao nhọn vô trùng Dùng dao nhọn tách lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng khỏi mô cấy vào môi trường nhân giống ban đầu 3.2 Nhân giống Các chất chiết trái đề nghị dùng nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây chúng có hiệu lần cấy chuyền thể tích khơng q 10% thể tích mơi trường Ví dụ mơi trường Lan Hồ điệp là: MS+ 1ppm BAP + 1ppm Kinetine + 5% nước dừa, khoai tây, chuối xanh + 0,1% than + 40g đường + 6g agar Nhiệt độ để nhân giống Lan 220C– 260C tuỳ vào loài Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục tạo khối tròn gọi thể chồi Thể chồi lấy khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước chồi Lát cắt chuyển vào mơi trường trì (mơi trường phát triển chồi) Mỗi đỉnh sinh trưởng phát triển thể chồi sau khoảng tuần, cắt tiếp cấy chuyền sang mơi trường 3.3 Tái sinh hồn chỉnh in-vitro Khi đạt đến số giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích rễ) Sau -5 tháng, thể chồi phát triển thành Ví dụ lan Hồ Điệp, môi trường sử dụng là: MS + 1ppm NAA + 0,1% than + 40g đường + 6g agar 3.4 Chuyển vườn ươm Cây cao 5-7 cm có từ 3-4 chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vơ trùng có bổ sung chất dinh dưỡng Sau thời gian phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu Sau chuyển chậu khoảng tuần bón phân, lúc có đủ sức chống chọi với bệnh tật Như vậy, từ mô hoa Lan chọn ni cấy có 3-4 chuyển vườn trồng thời gian khoảng từ đến 11 tháng Với phương pháp nhân giống invitro đảm bảo tạo mang đặc tính giống hồn tồn với cha mẹ (cây ổn định mặt di truyền), không nhiễm bệnh tạo số lượng lớn thời gian ngắn Tuy nhiên, việc cấy mô phải thực thật nghiêm túc tỉ mỉ theo quy trình, phải có điều kiện trang thiết bị đầy đủ, mơi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt điều kiện vô trùng phải đảm bảo nghiêm ngặt Cần ý thêm, loài khơng phải địa, phải hố vùng chọn mẫu đem ni cấy, có đảm bảo hiệu từ khâu nuôi cấy phòng thí nghiệm đến trồng ngồi vườn ươm PHẦN 4: ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CÂY ĂN TRÁI CÓ MÚI SẠCH BỆNH 4.1 Tổng quan Cây có múi tên gọi chung nhóm cam, chanh, quýt, bưởi họ Rutaceae Trên giới sản xuất có múi ngành lớn với diện tích 3,5 triệu sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân đầu người 15 kg quả/năm Một trở ngại sản xuất có múi bệnh vàng greening (VLG), số bệnh virus tương tự virus khiến sản lượng chất lượng bị giảm sút Các giống đặc sản bị bệnh làm suy thoái cam sành quýt chum Hà Giang, cam Canh bưởi Diễn Hà Nội, cam Xã Đồi cam Sơng Con Nghệ An, bưởi Phúc Trạch cam bù Hà Tĩnh, cam Bố Hạ Bắc Giang v.v Bệnh VLG virus lây lan qua giống côn trùng môi giới (rầy chổng cánh, rệp cam, rệp ) Do nhân giống có múi bệnh biện pháp quan trọng để nâng cao xuất chất lượng có múi Sản xuất giống có múi bệnh giới thiệu kinh nghiệm Đài Loan Pháp Viện Bảo vệ thực vật nghiên cứu áp dụng thành công thực tiễn nước ta Công nghệ bao gồm sử dụng kỹ thuật vi ghép mô phân sinh đỉnh sinh trưởng để làm bệnh cho giống; chuẩn đoán kiểm tra giống phương pháp phân tử bệnh PCR ELISA, sử dụng vật liệu sản xuất giống: hệ thống nhà lưới ba cấp với khung nhơm sắt có lưới chống trùng, dùng giá thể từ chất hữu thực vật (vỏ lạc, bã mía ) cộng với phân bón tổng hợp cát để trồng bầu Công nghệ nhân giống có múi bệnh lược tả sử dụng dự án nhân giống có múi bệnh thực Hà Giang, Tuyên Quang Nghệ An 2001 - 2002 4.2 Quy trình sản xuất giống ăn có múi bệnh 4.2.1 Tạo đầu dòng bệnh (cây So) kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng Nguyên tắc làm bệnh phương pháp dựa vào đặc điểm lây lan bệnh vàng greening (VLG) bệnh virus, viroid có múi: Bệnh lan truyền theo mạch dẫn Bệnh không lây lan qua hạt Đỉnh sinh trưởng gồm mô phân sinh chưa hình thành mạch dẫn bệnh Ghép mảnh mô phân sinh lên mầm mọc từ hạt nhận bệnh Cách ghép thực phòng thí nghiệm kính hiển vi mảnh ghép mơ phân sinh có kích cỡ nhỏ 100 - 150 nanomet (100 - 150 phần nghìn mét) gốc ghép đoạn mầm mọc từ hạt nuôi ống nghiệm Vi ghép thực điều kiện vơ trùng nên hồn tồn bệnh Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng (Microshoot tip grafting) Murashige áp dụng lần vào năm 1972 sau cải tiến hồn chỉnh Navarro 1975, 1976, 1980, 1981 Hong Ji Su 1984 Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng bao gồm giai đoạn: chuẩn bị gốc ghép, chuẩn bị đỉnh sinh trưởng, vi ghép nuôi ống nghiệm sau đem trồng chậu Chuẩn bị gốc ghép lần 1: Xử lý hạt để gieo làm gốc ghép: lấy hạt giống cam bưởi chua, bóc vỏ khử trùng dung dịch Javel 1% phút Hạt gieo mơi trường thạch có chứa chất dinh dưỡng (mơi trường MS) ống nghiệm đặt buồng tối nhiệt độ 28oC Tiêu chuẩn gốc ghép: chiều cao 10 - 12 cm, đường kính thân 1,5 - mm Chuẩn bị đỉnh sinh trưởng: Đỉnh sinh trưởng lấy từ chồi non giống gốc tuyển chọn vườn sản xuất hay nhà lưới cách ly Sau thu chồi non, tỉa to xung quanh, giữ lại phần chồi dài khoảng - 1,5 cm Kỹ thuật vi ghép: Cây giống cần làm Tỉa xung quanh Cắt đỉnh sinh trưởng Vị trí đặt đỉnh sinh trưởng bệnh Sau 10 ngày tỉa lá, gốc ghép chồi non mọc Cây gốc ghép 15 ngày tuổi lấy khỏi ống nghiệm, cắt phía cách cổ rễ - 2,5 cm; rễ cọc cắt bớt để lại - cm Dùng dao vi ghép kính lúp soi để mở miệng ghép gốc ghép, phải thận trọng để tầng sinh gỗ không bị tổn thương Đỉnh sinh trưởng phần mô phân sinh dài khoảng 100 - 150 nm, dùng dao lưỡi mỏng cắt đặt nhanh vào vị trí ghép gốc ghép Cây sau vi ghép đặt ống nghiệm có sẵn môi trưởng lỏng (môi trường MS + đường saccaro) Cây bảo quản nhiệt độ 28 oC, cường độ ánh sáng 1000 lux 16 hàng ngày đèn huỳnh quang Sau tuần dùng kính lúp để kiểm tra xem chồi ghép có sống khơng Nếu chồi ghép sống, tháng sau có thêm mới, đạt tiêu chuẩn ghép lần thứ Sau ghép lần 2, bao chùm túi nilon khoảng tuần Nếu ghép sống, chuyển chậu to bảo quản nhà lưới chống trùng Những sau vi ghép chăm sóc đầy đủ giám định bệnh kỹ thuật PCR, ELISA 4.2.2 sản xuất giống bệnh 4.2.2.1 Hệ thống nhà lưới ba cấp * Nhà lưới cấp 1, bảo quản giống gốc bệnh (So): Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng tạo So Những giống gốc bệnh So giữ chăm sóc nhà lưới chống trùng cấp * Nhà lưới cấp 2, bảo quản S1 nhân mắt ghép bệnh Những So cung cấp mắt ghép để ghép lên gốc ghép thích hợp cho S1, bảo quản nhà lưới cấp để nhân hàng loạt mắt ghép bệnh Những S1 giám định bệnh thường kỳ tháng/lần Những dương tính tiếp tục loại bỏ Cây S1 lấy mắt ghép để nhân giống năm, sau phải thay đợt S1 * Nhà lưới cấp 3, sản xuất giống bệnh để cung ứng cho sản xuất Các mắt ghép bệnh từ S1 cung ứng cho nhà lưới cấp để sản xuất giống bệnh Gốc ghép chọn cho thích hợp với mắt ghép tuỳ theo mục tiêu sản xuất 4.2.2.2 Quy trình sản xuất giống bệnh nhà lưới cấp Chuẩn bị gốc ghép: Chọn giống làm gốc ghép: có nhiều giống để chọn làm gốc ghép cho có múi Theo khuyến cáo chuyên gia đầu ngành, dùng bưởi chua để làm gốc ghép cho loại bưởi, dùng chấp cam để ghép cho loại cam quýt Thành phần đất gieo hạt gốc ghép: gồm 1/3 đất màu + 1/3 cát vàng + 1/3 mùn hữu hấp khử trùng nước nóng 100oC 60 phút Gieo hạt: khoảng cách gieo hạt x cm Gieo xong lấp hạt cm đất nhỏ mịn, sau dùng ván ấn chặt mặt luống Tưới nước đủ ẩm hàng ngày Chăm sóc con: có thật, bắt đầu phun phân bón để thúc sinh trưởng khoẻ (dùng loại phân bón có nguyên tố vi lượng) Cây cao 12 - 15 cm có - thật đủ tiêu chuẩn ngôi, chuyển qua giai đoạn chờ ghép 4.2.3 Kỹ thuật ngơi chăm sóc chờ ghép Cây gốc ghép cấy vào túi bầu polyetylen đựng hỗn hợp nuôi Hỗn hợp túi bầu ươm con: Gồm: 1/3 đất màu + 1/3 cát vàng + 1/3 mùn hữu + 100 g/bầu phân NPK Túi bầu: sử dụng túi polyetylen mầu đen, kích cỡ 16 x 35 cm Tiêu chuẩn gốc ghép: Chiều cao 40 - 50 cm, đường kính gốc đạt 0,3 cm.Cây mọc thẳng, khoẻ mạnh, không bị sâu bệnh hại Chẩn bị mắt ghép: Mắt ghép phải lấy từ S1, dùng mắt thức (mắt rõ), khơng lấy mắt ghép cành non (cành phải tháng tuổi trở lên) Phương pháp ghép: Ghép theo phương pháp mắt nhỏ có gỗ ghép nêm Vị trí ghép cách mặt bầu 20 cm Thời vụ ghép: có múi ghép tốt từ tháng - 10 Chăm sóc sau ghép: Tỉa bỏ chồi mọc từ gốc ghép Dùng phân bón để ni q trình chăm sóc Phân loại theo lơ đồng sinh trưởng để không che khuất lẫn Bấm tạo tán từ chồi ghép cao 20 cm, có - lá, để lại - chồi tạo cành cấp sau cho Thường xuyên kiểm tra sâu bệnh hại để phòng trừ kịp thời Khi đủ tiêu chuẩn xuất vườn, phải giám định bệnh cho kỹ thuật PCR, ELISA Cây bệnh phát sớm loại bỏ Phương pháp lấy mẫu để giám định bệnh cho lô giống: mẫu 50 cây, lấy bánh tẻ Nếu mẫu dương tính phải thử lại cách chia lơ nhỏ hơn, 10 cây/mẫu Nếu mẫu dương tính phải thử lại để phát xác bị nhiễm bệnh, phải loại bỏ khỏi vườn 4.3 Yêu cầu sản xuất ăn trái có múi Xây dựng hệ thống nhà lưới nhân giống có múi bệnh cách vùng bệnh km Có thể tạo khoảng cách cách loại bỏ tất có múi vùng bán kính nêu Dùng nước nóng để xử lý hạt gốc ghép (55oC 50 phút) Dùng mắt ghép bệnh lấy từ vườn nhân mắt ghép S1 Kiểm dịch chặt chẽ để bảo vệ vườn ươm Không đưa nguồn bệnh vào vườn ươm đường Xung quanh vườn ươm phải có hàng rào chắn gió Các nhà lưới chống trùng phải có buồng vào cửa Giữa lần cửa có đủ điều kiện khử trùng dày dép, quần áo, mũ để ngăn vi sinh vật côn trùng theo người vào nhà lưới (Hỗn hợp vôi bột 80% + Sunfat Đồng 20% rải xuống nền) Không cho người lạ vào thăm, trừ họ khử trùng dày dép, quần áo, mũ khoác quần áo chuyên dùng Khử trùng dụng cụ dao kéo trình làm việc nhà lưới nước Javen 10% Luôn kiểm tra chất lượng nước tưới Luôn phân cách phần cũ phần vườn ươm vùng gồm khác Định kỳ tháng/lần giám định bệnh cho tất lô giống, xác định loại bỏ có kết dương tính (bị bệnh): greening, tristeza, loét vi khuẩn, exocortis, tatter leaf, psorosis Các giống phải có phiếu ghi rõ tên gồm gốc ghép, mắt ghép Trước xuất vườn, giống phải có chứng bệnh PHẦN 5: TRIỂN VỌNG, ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM 5.1 Triển vọng Kỹ thuật nhân in vitro phương pháp tạo bệnh môi trường lỏng khắc phục nhược điểm phương pháp nhân giống vơ tính chiết, ghép, giâm… nhân số lượng lớn giữ nguyên đặc điểm tốt dòng vơ tính ưu tú tuyển chọn có suất cao, chất lượng tốt khả kháng bệnh cao Trong tương lai tạo số lượng lớn bệnh có độ đồng cao phục tráng giống trồng tiếng thối hóa nhiễm bệnh Virus cung cấp giống có chất lượng tốt cho sản xuất 5.2 Ưu nhược điểm 5.2.1 Ưu điểm Kỹ thuật nhân in vitro phương pháp tạo bệnh môi trường lỏng khắc phục nhược điểm phương pháp nhân giống vơ tính chiết, ghép, giâm… nhân số lượng lớn giữ nguyên đặc điểm tốt dòng vơ tính ưu tú tuyển chọn có suất cao, chất lượng tốt khả kháng bệnh cao Trong tương lai tạo số lượng lớn bệnh có độ đồng cao phục tráng giống trồng tiếng thoái hóa nhiễm bệnh Virus cung cấp giống có chất lượng tốt cho sản xuất Cây giống invitro chưa có nhu cầu sản xuất bảo quản thời gian dài điều kiện in vitro 5.2.2 Nhược điểm: Mặc dù có hệ số nhân giống lớn giống tạo có kích thước nhỏ xuất dạng ko mong muốn Cây giống in vitro cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả tự tổng hợp chất hữu Đồng thời giống in vitro ni dưỡng bình thủy tinh bình nhựa nên độ ẩm khơng khí thường bão hòa Do trồng điều kiện tự nhiên thường bị cân nước, gây tượng bị héo chết Vì trước chuyển từ điều kiện in vitro điều kiện in vitro cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để quen dần với điều kiện bên ngồi có độ ẩm khơng khí thấp ánh sáng mạnh Cần trang bị thiết bị đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao Những vấn đề tồn vi nhân giống Tính bất định mặt di truyền Sự nhiễm mẫu Việc sản sinh hợp chất độc từ mô nuôi cấy Hiện tượng thủy tinh hóa TÀI LIỆU THAM KHẢO "The Convention on Biological Diversity (Article Use of Terms)." United Nations 1992  ... PHẦN 2: SƠ LƯỢC SẢN XUẤT GIỐNG CÂY TRỒNG SẠCH BỆNH 2.1 Cơ sở di truyền phương pháp tạo bệnh 2.2 Thành tựu sản xuất giống trồng bệnh 2.3 Kỹ thuật tạo bệnh ... SƠ LƯỢC SẢN XUẤT GIỐNG CÂY TRỒNG SẠCH BỆNH 2.1 Cơ sở di truyền phương pháp tạo bệnh Virus loại bệnh chữa Bệnh Virus gây tổn thất lớn suất, phẩm chất Bệnh Virus lan truyền qua hệ nhân giống vơ... bỏ Cây S1 lấy mắt ghép để nhân giống năm, sau phải thay đợt S1 * Nhà lưới cấp 3, sản xuất giống bệnh để cung ứng cho sản xuất Các mắt ghép bệnh từ S1 cung ứng cho nhà lưới cấp để sản xuất giống