PCR (Polymerase Chain Reaction) NỘI DUNG GIỚI THIỆU VỀ PCR NGUYÊN TẮC CỦA PHẢN ỨNG PCR TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG PCR ỨNG DỤNG PƯ PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH NHIỄM VSV GIỚI THIỆU VỀ PCR PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) Kary Mullis & cs phát minh năm 1985 Chỉ năm sau 1993: Nobel hóa học PP khuếch đại in vitro để tạo nhiều đoạn DNA đích  Mô máy sinh TH DNA TB sống  công cụ mạnh để , nghiên cứu Y- Sinh học, đặc biệt  tác nhân VSV gây bệnh Trình tự đích Chuỗi DNA Chuỗi DNA siêu Nhiễm sắc thể Chuỗi DNA xoắn đôi NGUYÊN TẮC CỦA PƯ PCR  PCR dựa qt chép DNA tb Cấu trúc DNA (C-G, A-T) Caàu Hydro Cytosine (C) Adenine (A) Guanine (G) Thymine (T) Thymine (T) Guanine (G) Adenine (A) Cytosine (C) Deoxyribose (phaân tử đường) Phosphoric Acid (phân tử phosphate) Chuỗi xoắn kép DNA Phương pháp Boom Phương pháp Phenol-chloroform (tủa) Breaking the cell membrance Removing proteins Precipitating Phương pháp Cột Ly giải mẫu Chất tẩy ly giải màng tế bào Proteinase K phá hủy proteins Nạp mẫu vào cột Nucleic acids gắn vào màng lọc thành phần khác qua màng Rửa cột Loại bỏ tất chất bẩn diện Dung giải, thu DNA DNA giải phòng khỏi cột sẳn sàng cho ứng dụng sau đó: PCR, lai phân tử, tạo dòng Ổn định hiệu suất cao làm tay Thích hợp với nhiều loại mẫu hàm lượng mẫu khác Giảm công lao động thời gian Số lượng mẫu lớn linh động Chi phí hiệu Hóa chất tự pha chế 3.2 Thành phần phản ứng PCR (PCR mix) • DNA mẫu (template) cần phát • Enzym khuếch đại: Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus), rTth DNA polymerase (Thermus thermophilus) • Mồi (primer) • dNTPs (A, T, C, G) • Mg2+ • Đệm (buffer) • Nước (H2O) PCR MIX Các bước tiến hành PCR 4.1 Lấy mẫu 4.2 Xử lý mẫu 4.3 Tách chiết DNA / RNA 4.4 Chạy phản ứng PCR 4.5 Phát sản phẩm PCR QUI TRÌNH PCR ỨNG DỤNG PƯ PCR TRONG CHẨN ĐỐN BỆNH NHIỄM VSV Phát & đònh lượng VSV gây bệnh • Tác nhân khó ni cấy hay khơng ni cấy (VK lậu, HBV, HCV, …) • Tác nhân có thời gian ni cấy dài (VK M tuberculosis) • Tác nhân vi sinh vật nguy hiểm (virus H5N1,…) • Tác nhân ni cấy thất bại có mặt bệnh phẩm, bị điều trị KS trước Phaùt độc tố VSV (VK E coli, S aureus, …) Xác đònh tính kháng thuốc VSV gây bệnh (HBV, VK lao, …) Xác đònh kiểu gen VSV gây bệnh (HCV, VK Helicobacter pylori, …) PCR chẩn đốn xđ lao • Chẩn đốn xđ nhanh xác • Chẩn đốn xđ nhiều t/h lao phổi mà soi khơng thấy, cấy khơng • Các trường hợp lao ngồi phổi khó chẩn đốn xđ lao màng não, lao khớp, lao màng bụng, lao màng tim, lao xương PCR chẩn đoán & điều trị HBV PCR điều trị HCV PCR chẩn đoán bệnh • HIV • Sốt xuất huyết – Chẩn đốn sớm trước xuất IgM – Chẩn đoán sớm trước giảm tiểu cầu – Định type • Human papilloma virus – Chẩn đốn xác – Định type Kết luận • Các pp SHPT ngày phát triển & phổ biến qui mô rộng • Cần đánh giá, chọn lựa & triển khai xét nghiệm SHPT phù hợp với bệnh nhiễm VSV, tình hình sở đòa phương ... chu kỳ = 128 Amplicon * Các pp SHPT dựa PCR • PCR (Polymerase Chain Reaction) * RT -PCR (Reverse Transcription -PCR) * Real-time PCR * Multiplex -PCR * Nested PCR • Lai phân tử (Dot-Blot) • Giải trình...NỘI DUNG GIỚI THIỆU VỀ PCR NGUYÊN TẮC CỦA PHẢN ỨNG PCR TIẾN HÀNH PHẢN ỨNG PCR ỨNG DỤNG PƯ PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH NHIỄM VSV GIỚI THIỆU VỀ PCR PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng... cần thiết cho phòng xét nghiệm PCR Hóa chất, thuốc thử PCR 3.1 Hóa chất tách chiết DNA / RNA 3.2 Thành phần phản ứng PCR (PCR mix) Các bước tiến hành PCR Khu vực PTN PCR đơn giản Trang thiết bò