Đang tải... (xem toàn văn)
Dành cho các bạn thuộc nghành Công nghệ sinh học phân tử
Lời nói đầu Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) phận quan trọng công nghệ chìa khóa (key technology) lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp đời sở thành tựu sinh học phân tử đóng vai trò cách mạng phát triển sinh học cải tạo sinh giới Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép nhà công nghệ sinh học phân lập khuếch đại gen đơn từ genome sinh vật để nghiên cứu, biến đổi chuyển vào thể sinh vật khác Các kỹ thuật gọi tạo dòng gen sản xuất số lượng lớn gen xác định Bên cạnh giáo trình như: sinh học phân tử, nhập môn công nghệ sinh học, công nghệ tế bào, công nghệ chuyển gen… giáo trình công nghệ DNA tái tổ hợp giúp sinh viên tiếp cận thêm lĩnh vực khác công nghệ sinh học thông qua việc cung cấp kiến thức theo hướng tạo dòng biểu gen sau: - Các enzyme dùng tạo dòng phân tử - Các hệ thống vector - Một số kỹ thuật tạo dòng gen: điện di, PCR… - Tạo dòng xây dựng thư viện genomic DNA cDNA - Biểu gen tạo dòng E coli Do giáo trình xuất lần đầu tiên, lĩnh vực công nghệ DNA tái tổ hợp lại phức tạp, nên khó tránh khỏi thiếu sót chưa đáp ứng yêu cầu bạn đọc Vì thế, mong nhận nhiều ý kiến đóng góp để lần xuất sau hoàn thiện Chúng chân thành cảm ơn Quỹ Nâng cao chất lượng-Dự án Giáo dục đại học hỗ trợ biên soạn giáo trình này, PGS TS Lê Trần Bình đọc thảo góp nhiều ý kiến quý báu Các tác giả Phụ lục Một số thuật ngữ Adapter Một oligodeoxyribonucleotide tổng hợp tương tự linker, có đầu đầu lồi 5’ tương ứng với vị trí cắt hạn chế cho phép nối cDNA sợi đôi với plasmid vector bacteriophage λ vector có đầu tương đồng (xem thêm linker) Adenosine diphosphate (ADP) Một ribonucleoside 5’-diphosphate cấu tạo từ adenine, đường ribose (5C) hai gốc phosphate ADP có tác dụng nhận phosphate chu trình lượng tế bào Adenosine triphosphate (ATP) Một ribonucleoside 5’-triphosphate cấu tạo từ adenine, đường ribose (5C) ba gốc phosphate ATP phân tử chứa lượng hóa học tế bào, chủ yếu tập hợp ty thể (mitochondria) lạp thể (chloroplast) Các gốc phosphate ATP có mang liên kết bị thủy phân phóng thích lượng tự lớn Năng lượng trình hô hấp quang hợp sử dụng để tạo thành ATP từ ADP Sau đó, ATP biến đổi ngược trở lại thành ADP nhiều vùng khác tế bào, lượng phóng thích dùng để điều khiển phản ứng hóa sinh nội bào Đôi xảy thủy phân tiếp ADP thành AMP (adenosine monophosphate) để phóng thích lượng nhiều Amino acid Là phân tử nhỏ mang gốc amine (-NH 3) gốc carboxyl (-COOH) liên kết với nguyên tử carbon Amino acid đơn vị cấu trúc sở chuỗi polypeptide Có 20 amino acid khác chuỗi polypeptide có tự nhiên Trình tự xếp amino acid chuỗi polypeptide định cấu trúc chức polypeptide protein mà tạo thành Ampicillin (Amp) Chất kháng sinh bán tổng hợp dùng môi trường chọn lọc để chọn tế bào mang đột biến khuyết dưỡng chọn dòng tế bào (tái tổ hợp) mang đoạn DNA tạo dòng BAC (bacteria artificial chromosome) Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn, dựa sở plasmid F-factor, sử dụng làm vector tạo dòng BAC tái E coli với đoạn chèn DNA có kích thước lên đến 300 kb Bản đồ cắt hạn chế (restriction map) Trình tự vị trí nhận biết (recognition sites) tất enzyme hạn chế (restriction enzyme hay restriction endonuclease, RE) phân tử DNA Bazơ đồng đẳng (analog base) Chất hóa học có cấu trúc phân tử giống base bình thường DNA Chúng thay nitrogen base bình thường DNA hoạt động tác nhân đột biến Trong lần chép DNA, base đồng đẳng bắt cặp sai với base bình thường, tạo nên đột biến điểm Ví dụ: base đồng đẳng adenine (A) 2-aminopurine (AP) gắn vào DNA vị trí adenine; lần chép tiếp bắt cặp với cytosine (C), lần chép C kết cặp với guanine (G) Như diễn thay cặp A-T cặp G-C Bazơ nitơ (nitrogen base) Loại phân tử cấu tạo nên nucleic acid (DNA RNA) Các nitrogen base có nucleic acid adenine, guanine, cytosine thymine (DNA) uracil (RNA) Trình tự xếp chúng dọc theo phân tử nucleic acid tạo nên thông tin di truyền thể sinh vật Bắt cặp bổ sung (complementary base pairing) Sự kết hợp thành đôi nitrogen base nằm hai mạch đơn chuỗi xoắn kép DNA-DNA, DNA-RNA RNA-RNA thông qua mối liên kết hydrogen Sự bắt cặp mang tính đặc hiệu: guanine bắt cặp với cytosine, adenine bắt cặp với thymine DNA uracil RNA Biến nạp (transformation) Là trình truyền DNA ngoại lai vào tế bào nhận, chẳng hạn sphaeroplast protoplast, hợp nhiễm sắc thể nhờ tái tổ hợp tương đồng biến đổi đơn vị chép tự trị (autonomous replicon) Sự biến nạp xuất điều kiện tự nhiên số vi khuẩn (ví dụ: Bacillus, Haemophilus, Neisseria Streptococcus), nhiều vi khuẩn (ví dụ: E coli) thể sinh vật eukaryote biến nạp xuất tế bào “thấm” DNA phương pháp nhân tạo như: hóa biến nạp, điện biến nạp Biến nạp điện (electroporation) Kỹ thuật dùng xung điện tạo lỗ thủng tạm thời màng sinh chất để đưa DNA ngoại lai vào bên tế bào vật chủ Biến tính (denaturation) Là tượng chuyển từ dạng mạch kép sang dạng mạch đơn DNA RNA thường nhiệt gây nên Biến tính protein tượng chuyển từ cấu hình hoạt động thành dạng không hoạt động Biểu gen (gene expression) Là trình phiên mã (transcription) dịch mã (translation) gen để tạo sản phẩm protein Cặp base (base pair, bp) Là liên kết A-T C-G phân tử DNA mạch kép, đơn vị đo chiều dài phân tử DNA Chromosome walking Kỹ thuật dùng để lập đồ nhiễm sắc thể từ tập hợp đoạn DNA cắt hạn chế chồng lên (overlapping) Bắt đầu từ thư viện chứa đoạn DNA nói tạo dòng Một đoạn DNA mang gen biết lựa chọn sử dụng mẫu dò để nhận dạng (ví dụ: cách lai khuẩn lạc) đoạn khác, đoạn chồng lên chứa gen Sau đó, trình tự nucleotide đoạn phân tích nhờ xác định toàn đoạn nhiễm sắc thể Từ đó, đồ vùng đặc biệt xây dựng Chu trình sinh tan (lylic cycle) Một kiểu chu trình sống thực khuẩn thể (bacteriophage) xâm nhiễm vi khuẩn, điều khiển hoạt động sinh sản sinh trưởng gen sinh bacteriophage hệ con, chui khỏi tế bào vi khuẩn sau phá vỡ tế bào Chu trình tiềm tan (lysogenic cycle) Là tượng hệ gen bacteriophage diện trạng thái ổn định không sinh tan tế bào vật chủ sống Các tế bào vật chủ tiếp tục sinh trưởng phân chia, chép hệ gen bacteriophage (prophage) phối hợp với nhiễm sắc thể vật chủ cho tế bào phân chia prophage chuyển vào hai tế bào Prophage trì cách hợp nhiễm sắc thể vật chủ (ví dụ: bacteriophage λ, bacteriophage Φ105) plasmid bên nhiễm sắc thể (ví dụ: bacteriophage P1 bacteriophage F116) Tế bào vật chủ biểu kiểu hình biến đổi Chuỗi contig (contiguous sequence) Một đoạn trình tự dài hình thành từ số đoạn phân tử ngắn chồng lên (overlapping) Chuỗi khảm (concatemer) Phân tử DNA bao gồm nhiều đoạn cá biệt nối với thông qua đầu dính Chuỗi mã hóa (coding sequence) Đoạn phân tử DNA mang mã di truyền xác định để phiên mã thành mRNA sau dịch mã thành chuỗi polypeptide Chuyển gen (transgenic) Quá trình chuyển đoạn DNA ngoại lai (foreign DNA) kỹ thuật khác (Agrobacterium, vi tiêm, bắn gen, xung điện ) vào thể vật chủ (vi sinh vật, động vật thực vật) Chuyển nhiễm (transfection) Kỹ thuật đưa DNA phage DNA virus vào tế bào vật chủ Cosmid Vector lai (hybrid vector) cấu thành từ đoạn trình tự plasmid vị trí cos (đầu dính) bacteriophage λ Công nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) Hệ thống phương pháp phòng thí nghiệm cho phép cắt đoạn DNA từ sinh vật để ghép nối vào DNA sinh vật khác tạo phân tử DNA tái tổ hợp Phân tử đưa vào sinh vật khác để tạo giống chủng vi sinh vật, thực vật động vật có phẩm chất đặc biệt, đáp ứng nhu cầu ngày cao sản xuất đời sống người Công nghệ có ứng dụng rộng rãi y học, dược học, nông nghiệp nhiều ngành công nghiệp khác Công nghệ sinh học (biotechnology) Theo nghĩa rộng trình công nghiệp có sử dụng vi sinh vật tế bào động vật thực vật (công nghệ sinh học truyền thống) Theo nghĩa phổ biến trình sản xuất sử dụng giống sinh vật mới, tạo công nghệ DNA tái tổ hợp (công nghệ sinh học đại) Trong công nghệ sinh học truyền thống (lên men sản xuất rượu, bia, ủ chua thực phẩm, làm phomát, trồng trọt, chăn nuôi ) trước tiên người chọn lựa đối tượng sản xuất thích hợp (chủng vi sinh vật, trồng vật nuôi) thông qua thực tiễn sản xuất sau phương pháp khoa học gây đột biến, phân lập… Ngày nay, cách thay đổi gen nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta tạo đối tượng sản xuất thích hợp hơn, thay đổi lượng chất nhiều trình sản xuất công nghệ sinh học truyền thống trước đây, nâng chúng lên vị trí cao mở triển vọng lớn cho lĩnh vực hoạt động công nghệ sinh học Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) Tiền chất triphosphoryl hóa (“năng lượng cao”) cần thiết cho trình tổng hợp DNA N ký hiệu cho bốn nitrogen base (A, G, T C) Deoxyribonuclease (DNase) Loại enzyme nuclease thủy phân (phân hủy) DNA sợi đôi DNA sợi đơn Deoxyribonucleic acid (DNA) DNA đại phân tử sinh học có cấu trúc xoắn đôi, tồn chủ yếu nhân tế bào, nhiễm sắc thể, mang thông tin di truyền sinh vật Phân tử DNA gồm hai chuỗi polynucleotide, chuỗi xoắn quanh chuỗi tạo nên chuỗi xoắn kép Trong nucleotide, theo chiều dọc gốc phosphate nối xen kẽ với phân tử đường deoxyribose tạo nên khung bên chuỗi xoắn kép, theo chiều ngang phân tử đường kết hợp với bốn nitrogen base: adenine, guanine, cytosine thymine DNA không trực tiếp thể chức sinh học mà gián tiếp qua protein mã hóa DNA tạo RNA, RNA tạo protein RNA acid nhân (nucleic acid) Nó có thành phần cấu tạo giống DNA, ngoại trừ gốc thymine (T) DNA thay gốc uracil (U), RNA dạng sợi đơn dạng xoắn kép DNA Quá trình đọc mã di truyền chứa DNA để tổng hợp protein gọi phiên mã (transcription) tạo RNA mang thông tin di truyền mRNA (messenger RNA) mRNA kết hợp với quan tử tế bào ribosome để tạo protein trình dịch mã (translation) Quá trình gọi trình sinh học Năm 1962, Watson (Mỹ) Crick (Anh) chia sẻ Giải Nobel với Wilkins (Anh) phát minh cấu trúc không gian DNA ý nghĩa việc truyền thông tin di truyền Điều đáng tiếc Franklin, người có đóng góp đáng kể cho phát minh trước Theo qui định Giải Nobel không dược phép tặng cho người Dịch chuyển điểm đứt (nick translation) Phương pháp đánh dấu DNA phóng xạ [α-32P]dCTP nhờ enzyme DNA polymerase I E coli Dịch mã (translation) Sự tổng hợp protein khuôn mRNA Quá trình chuyển thông tin di truyền trình tự base mRNA sang trình tự amino acid chuỗi polypeptide tế bào gọi trình sinh tổng hợp protein Dịch mã ngược (reverse translation) Là kỹ thuật phân lập gen nhờ khả chúng việc lai với đoạn mã oligonucleotide đó, đoạn chuẩn bị cách dự đoán đoạn mã nucleic acid từ đoạn mã hóa protein biết trước Dideoxyribonucleotide triphosphate (ddNTP) Một đồng phân dNTP dùng để kết thúc chuỗi DNA thí nghiệm xác định trình tự gen (sequencing) Dimer Là hỗn hợp tạo hai phân tử đồng khối lượng phân tử gấp đôi so với phân tử nguyên thủy DNA bổ sungg̣ (complementary DNA, cDNA) DNA tổng hợp khuôn mẫu mRNA nhờ trình phiên mã ngược (reverse transcription) Do vậy, có trình tự xếp nucleotide bổ sung với trình tự nucleotide mRNA Ví dụ: mRNA trình tự UUGAAG DNA bổ sung có trình tự tương ứng AACTTC DNA bổ sung tổng hợp tự nhiên chu trình sống virus mang vật chất truyền RNA Ví dụ: HIV, virus cúm retrovirus nói chung DNA bổ sung tổng hợp nhân tạo phòng thí nghiệm để xây dựng thư viện cDNA (cDNA library) DNA khuôn mẫu (template DNA) Sợi DNA mà trình tự nucleotide dùng làm khuôn mẫu để tổng hợp nên sợi DNA trình tái (sao chép) khuếch đại DNA (PCR) để tổng hợp nên sợi RNA trình phiên mã DNA polymerase Enzyme tổng hợp DNA khuôn mẫu DNA cách xúc tác phản ứng gắn nucleotide riêng biệt vào đầu chuỗi DNA tổng hợp Năm 1959, hai nhà khoa học người Mỹ Kornberg Ochoa nhận Giải Nobel nghiên cứu làm sáng tỏ chế trình chép DNA liên quan đến DNA polymerase I DNA siêu xoắn (supercoiled DNA) DNA xoắn lại thân nó, thường kết gấp khúc, mở xoắn xoắn lại chuỗi xoắn kép DNA DNA vệ tinh (satellite DNA) Là đoạn DNA mang trình tự lặp lại nối tiếp có thành phần khác với trị số trung bình DNA hệ gen DNA vệ tinh tạo thành băng theo gradient tỷ trọng dễ dàng phân biệt với băng phần lớn DNA hệ gen DNA vệ tinh có tỷ trọng nhỏ Bản DNA vệ tinh lặp lại hàng triệu lần hệ gen, tập trung chủ yếu vùng tâm động hai đầu nhiễm sắc thể Dòng (clone) Tập hợp tế bào phân tử giống hệt bắt nguồn từ tế bào hay phân tử ban đầu Dot blot Là kỹ thuật vết tròn nhỏ (hoặc điểm) có chứa nucleic acid đặt lên màng nitrocellulose nylon để lai với đoạn mồi DNA có đánh dấu đồng vị phóng xạ Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (restriction fragment length polymorphism, RFLP) Tính đa hình chiều dài đoạn cắt hạn chế để sai biệt di truyền vị trí nhận biết enzyme hạn chế (chẳng hạn thay đổi nucleotide) dẫn đến sai biệt chiều dài đoạn hình thành từ phản ứng cắt hạn chế DNA với enzyme RFLP thường dùng để thiết lập đồ di truyền với số marker di truyền biết trước Đánh dấu ở đuôi (end labelling) Bổ sung phân tử phóng xạ vào đuôi polynucleotide nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase Đầu (blunt end) Các đầu DNA sợi đôi đầu 3’ 5’ lồi (protruding ends) Đầu dính (cohesive ends sticky ends) Các đầu phân tử DNA có trình tự bổ sung ngắn dính kết lại để nối hai phân tử DNA với Các đầu dính thường enzyme hạn chế tạo Đầu tận C (C terminus) Gốc carboxyl (COOH) tự vị trí tận phân tử protein chuỗi polypeptide Đầu tận N (N terminus) Gốc amine (NH2) vị trí tận phân tử protein chuỗi polypeptide Tất polypeptide tổng hợp từ đầu tận N đến đầu tận C Điểm đứt (nick) Điểm đứt gãy sợi đơn DNA sợi đôi Điện di gel (gel electrophoresis) Kỹ thuật dùng để phân tách phân tử nucleic acid protein dựa vào dịch chuyển chúng giá thể dạng gel (agarose polyacrylamide) ảnh hưởng điện trường Sự dịch chuyển phân tử phụ thuộc vào điện tích, cấu hình, kích thước khối lượng phân tử nucleic acid protein dung môi nồng độ chất dùng làm giá thể Đoạn cắt hạn chế (restriction fragment) Các đoạn DNA nhỏ sinh sau xử lý đoạn DNA lớn enzyme hạn chế Đoạn kết thúc phiên mã (terminator hay transcription terminator) Trình tự nucleotide nằm cuối gen hoạt động tín hiệu kết thúc phiên mã Nó hiệu cho RNA polymerase giải phóng phân tử RNA tạo thành khỏi gen Lưu ý không nhầm với ba kết thúc (terminator codons hay stop codons: UAG, UAA UGA), xuất mRNA, tín hiệu dừng dịch mã (xem mã vô nghĩa) Có hai loại terminator phổ biến: Rho-independent terminator (thường cấu trúc thân-quai (stem-loop structure) RNA phiên mã) nằm đầu operons, Rho-dependent terminator (vùng cấu trúc đặc trưng RNA, không dịch mã, xem yếu tố Rho) nguyên nhân gây chiều phân cực dịch mã (translational polarity) Đoạn Klenow (Klenow fragment) Còn gọi đoạn lớn DNA polymerase I Đây đoạn DNA polymerase I (khối lượng phân tử 76.000) E coli bị hoạt tính exonuclease 5’→3’ Đoạn mồi (primer) Một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với mạch DNA khuôn mẫu có mang đầu 3’-OH tự giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp chuỗi DNA Đoạn nhồi (stuffer fragment) Còn gọi vùng đệm hay vùng trung tâm Là phần phage λ loại bỏ thay đoạn chèn DNA (insert DNA) mà không ảnh hưởng đến khả sinh sản phage tế bào vật chủ Đoạn xuôi ngược (palindrome) Đoạn DNA mạch kép có trình tự xếp base hai mạch đơn giống hệt đọc theo chiều (chẳng hạn 5’→3’) Ví dụ: đoạn nhận biết enzyme hạn chế Đóng dấu (replica plating) Phương pháp chuyển nguyên mẫu khuẩn lạc vết tan từ đĩa thạch gốc sang đĩa thạch cách dùng màng nylon (ví dụ: màng Hybond-N+) vừa khít áp lên mặt thạch đĩa gốc để dính lấy tế bào khuẩn lạc (colony) vết tan (plaque) đĩa gốc, đưa màng áp lên mặt thạch Đơn vị phiên mã (transcriptional unit) Đoạn DNA mã hóa cho phân tử RNA, điểm khởi đầu phiên mã đến điểm kết thúc phiên mã, dài gen Đơn vị chép (replicon) Đoạn DNA điểm khởi đầu chép kéo dài hai phía tới hai điểm kết thúc chép Đơn vị tái tổ hợp (recon) Đoạn DNA gen có chiều dài đủ ngắn để trao đổi chéo diễn bên Hiện nay, biết cặp nucleotide Đuôi polyA (polyA tail) Đoạn trình tự dài 50-200 nucleotide adenine bổ sung vào đầu 3’ hầu hết mRNA eukaryote sau phiên mã E coli (Escherichia coli) Vi khuẩn thường có ruột non động vật có xương sống E coli coi sinh vật mẫu cho việc nghiên cứu hoạt động tế bào Đây vi khuẩn Gram âm có kích thước genome khoản 4×10 base-pair Các trình biểu gen (phiên mã dịch mã) đôi với nhau, sinh sợi mRNA tổng hợp sử dụng cho trình dịch mã Không có tượng biến đổi sau dịch mã (post-translation) Vì thế, E coli xem tế bào vật chủ đơn giản Rất nhiều thí nghiệm tạo dòng gen thực hàng ngày phòng thí nghiệm sử dụng E coli làm vật chủ với nhiều chủng khác mặt di truyền cho ứng dụng đặc biệt Endonuclease Là enzyme nuclease cắt bên phân tử nucleic acid, ngược với exonuclease enzyme phân giải DNA từ đầu hai đầu Nuclease thủy phân liên kết phosphodiester nucleotide phân tử nucleic acid Các nuclease đặc hiệu DNA (deoxyribonuclease) đặc hiệu RNA (ribonuclease) Enzyme Chất xúc tác sinh học, phân tử sinh học có chất protein đóng vai trò chất xúc tác cho phản ứng biến đổi hóa sinh Enzyme gắn DNA (DNA ligase) Enzyme dùng để nối phân tử DNA với cách tạo mối liên kết phosphodiester nhóm 5’-phosphate nhóm 3’hydroxyl trình tái sửa chữa DNA Enzyme hạn chế (restriction enzyme, RE) Loại endonuclease có khả cắt DNA đoạn trình tự định mà chúng nhận biết Enzyme hạn chế phát vào năm 1970, chúng tồn tế bào vi khuẩn, có tác dụng cắt DNA ngoại lai (ví dụ: DNA phage) điểm xác định, để tiêu diệt DNA Cho đến 900 enzyme hạn chế tìm thấy Các enzyme hạn chế sử dụng rộng rãi phòng thí nghiệm thao tác gen “chiếc kéo” cắt DNA điểm đặc hiệu Vị trí cắt phụ thuộc vào loại enzyme hạn chế lựa chọn Năm 1978, Arber (Thụy Sĩ), Nathans (Mỹ) Smith (Mỹ) nhận Giải Nobel nhờ phát enzyme hạn chế ứng dụng chúng để giải nhiều vấn đề quan trọng sinh học phân tử Các enzyme “chiếc kéo phân tử” cắt DNA thành đoạn xác định, mở thời kỳ phát triển sinh học đại-Thời kỳ thao tác gen Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) DNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA-dependent DNA polymerase) có RNA virus (retrovirus) dùng để tổng hợp cDNA điều kiện in vitro Exon Các đoạn DNA gen có chức phiên mã Exon tồn sinh vật prokaryote eukaryote Riêng sinh vật eukaryote exon nằm xen kẽ với đoạn intron Các intron chiếm tới 90% tổng số DNA tế bào eukaryote chức phiên mã Eukaryote Sinh vật có tế bào mang nhân điển hình (nhân thật) nghĩa nhân bao bọc màng nhân tham gia vào hai chế phân bào quan trọng nguyên phân giảm phân Exonuclease Loại enzyme nuclease tác động vào đầu tận phân tử nucleic acid, cắt nucleotide theo thời gian Chúng chuyển hóa theo đầu 5’ 3’ sợi DNA Ex vivo Thuật ngữ dùng để thí nghiệm thực tế bào nuôi cấy, tế bào sau đưa vào thể sống β-galactosidase Enzyme mã hóa gen lacZ Enzyme thủy phân lactose thành glucose galactose miniprep) plasmid vector, sau cắt enzyme hạn chế thích hợp điện di kiểm tra agarose gel Sàng lọc khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc để phát protein dung hợp tiến hành sau: Nuôi cấy qua đêm 37oC (một lượng nhỏ) từ 5-10 khuẩn lạc môi trường LB có chứa ampicillin Sau đó, cảm ứng nuôi cấy cách bổ sung thêm isopropylthio-βgalactoside (IPTG) cho vector pUR tiếp tục nuôi 37 oC, vector pEX chuyển nuôi cấy 37oC lên nhiệt độ 40oC tiếp tục nuôi cấy (có sục khí) Sau khoảng thời gian nuôi cấy khác (1, 2, giờ…), lấy mL dịch nuôi cấy ly tâm nhanh để thu tiểu thể, tái huyền phù chúng đệm 1× SDS, biến tính 100oC phút, ly tâm 12.000 g phút nhiệt độ phòng Tiến hành điện di SDS polyacrylamide gel 6% Dùng dịch huyền phù tế bào mang vector làm đối chứng Protein dung hợp xuất băng dịch chuyển chậm băng β-galactosidase đối chứng Tách chiết protein dung hợp để sản xuất kháng thể Protein dung hợp tách chiết theo số cách: dùng dịch chiết urea, sắc ký lực aminophenylthiogalactoside, điện di SDS-polyacrylamide gel phối hợp cách Phương pháp đơn giản điện di SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), trình trình bày mục (nuôi cấy lượng lớn 200 mL) Nhuộm gel phát băng protein mới, sau cắt băng khỏi gel, đông khô khoảng ngày nghiền thành bột mịn Bột dùng tiêm vào thỏ để sản xuất kháng thể II Sản xuất protein nguyên thể Các protein nguyên thể sản xuất E coli cách sử dụng promoter điều hòa mạnh trình tự liên kết ribosome hiệu Để biểu gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome mạnh cần cung cấp promoter đủ Trong đó, để biểu gen eukaryote (hoặc gen prokaryote với trình tự liên kết ribosome yếu) cần phải cung cấp promoter lẫn trình tự liên kết ribosome (Hình 7.4) Các mức độ biểu khác từ 1% 30% protein hòa tan tổng số (total soluble protein) tế bào Hình 7.4 Protein nguyên thể Gen tạo dòng (gen A) đặt sau promoter trình tự SD vi khuẩn mRNA mã hóa amino acid đặc hiệu đoạn chèn để tạo loại protein nguyên thể Biểu gen ở prokaryote: Promoter Bước biểu protein eukaryote vi khuẩn chọn vector biểu mang promoter mạnh (strong promoter) prokaryote Promoter trình tự DNA hướng dẫn RNA polymerase liên kết với DNA khởi đầu tổng hợp RNA Các promoter khác có hiệu suất khác nhau, nói chung, promoter mạnh giúp mRNA khởi đầu tần số cao Các promoter khác mang hai đoạn bảo toàn cao, xác định khoảng 10 bp khoảng 35 bp nằm vùng ngược hướng (upstream) với điểm khởi đầu phiên mã (còn gọi vùng 5’ không dịch mã5’ untranslation region) Hai đoạn đánh giá quan trọng việc xác định cường độ promoter Các promoter thích hợp cho biểu gen ngoại lai E coli promoter mà hai cường độ khả điều hòa thể mạnh Nếu sản phẩm gen tạo dòng độc (toxin) tế bào E coli sau nhân đôi gen làm cho cường độ promoter yếu promoter không điều hòa Sự phiên mã mức độ cao gây trở ngại cho việc chép DNA plasmid dẫn đến tính không ổn định plasmid Phần giới thiệu vector biểu mang promoter P L bacteriophage λ, promoter (lai) trp-lac promoter bacteriophage T7 Promoter PL bacteriophage λ Promoter PL phage λ (Hình 7.5) promoter mạnh, có khả điều hòa tốt dùng số vector biểu Ơ nhiệt độ thấp (31 oC), promoter PL trì trạng thái bị ức chế sản phẩm gen cI Sau hoạt tính gen ức chế bị phá hủy cách tăng nhiệt độ nuôi cấy promoter P L xúc tiến phiên mã phần lớn mRNA Một vài vector sử dụng promoter PL λ như: pPLa 2311, pPLa pKC30 Hình 7.5 Vector pKC30 pKC30 plasmid có kích thước xấp xỉ 6,4 kb, mang promoter P L bacteriophage λ vị trí nhận biết HpaI nằm vùng hướng (có 321 nucleotides) với vị trí khởi đầu phiên mã P L Plasmid dạng phân chia vector pBR322 chứa đoạn HindIII-BamHI có nguồn gốc từ bacteriophage λ chèn vào vị trí HindIII BamHI vector Đoạn chèn cDNA mang tín hiệu promoter (P L), vị trí nhận biết sản phẩm gen N (nutL), thân gen N, tín hiệu kết thúc phiên mã phụ thuộc rho (tL) Vị trí nhận biết HpaI nằm với vùng mã hóa gen N Các trình tự DNA chèn vào vị trí HpaI điều chỉnh cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào thể tiềm tan bacteriophage mẫn cảm với nhiệt độ (cIts857) Các tế bào sinh trưởng đến pha log 30oC sau thay đổi tới 40 oC để bất hoạt sản phẩm gen cI mở promoter P L Vector dùng để biểu protein cII bacteriophage λ với mức độ khoảng 4% protein hòa tan tổng số tế bào Promoter trp-lac Sự biểu gen tạo dòng vi khuẩn E coli điều hòa promoter khác Chẳng hạn promoter tac (một dạng promoter lai promoter trp promoter lac) sử dụng thành công để sản xuất lượng lớn protein E coli (Hình 7.6) - Promoter trp điều hòa gen ức chế trp cảm ứng bổ sung 3-IAA (3-indolylacetic acid) vào môi trường, cách thiếu tryptophan - Promoter lac điều hòa gen ức chế lac cảm ứng bổ sung nhân tố cảm ứng IPTG cho nuôi cấy vi khuẩn - Cuối promoter lai trp-lac chứa đoạn trp-35 gắn với đoạn lac-10 operator lac Boer cs thiết kế năm 1982, promoter lai trp-lac điều hòa gen ức chế lac (lac repressor) Hình 7.6 Vector pKK177-3 pKK177-3 tac vector chứa vị trí tạo dòng gen ngoại lai hướng với promoter tac Cùng hướng với vị trí tạo dòng rrnB mang gen 5S E coli hai nhân tố kết thúc phiên mã T1 T2 Promoter bacteriophage T7 Một hệ thống biểu khác phát triển Tabor Richardson (1985), Studier Moffatt (1986) hệ thống bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter (Hình 7.7) Hệ thống thiết kế cho biểu có chọn lọc gen tạo dòng Chúng cho phép mức độ biểu cao vài gen không biểu hiệu hệ thống khác Hình 7.7 Vector pET-3 mang promoter (PФ10) bacteriophage T7 Ф10 và yếu tố kết thúc phiên mã Ф (TФ) Yếu tố kết thúc phiên mã tạo thể phiên mã có sức đề kháng mạnh hoạt tính exonuclease Vector pET-3a dạng phân chia vector pET-3 vùng khởi đầu dịch mã (S10) bacteriophage T7 Ф10 (protein vỏ bacteriophage T7) có mang vị trí BamHI codon 11 chèn vào Vị trí NdeI (CATATG) đặt vùng khởi đầu dịch mã sử dụng để xây dựng plasmid biểu protein nguyên thể Hình 7.8 Vector pAS1 Vector pAS1 plasmid dài khoảng 5,8 kb mang promoter P L bacteriohage λ vị trí cắt hạn chế BamHI định vị codon khởi đầu ATG gen cII bacteriophage λ Plasmid có nguồn gốc từ pKC30, gen cII bacteriophage λ chèn vào vị trí HpaI Gen cII sau cắt bỏ enzyme exonuclease lại codon khởi đầu ATG (G ATG nucleotide vị trí BamHI) Để biểu gen bị codon khởi đầu, pAS1 cắt BamHI sau xử lý với enzyme mung-bean nuclease nuclease S1 để loại bỏ đầu lồi (đầu tận sợi đơn) Gắn DNA đầu với đoạn DNA đầu bắt đầu với codon thứ hai gen biểu đặt gen khung với ATG Các gen chèn vào theo kiểu điều hòa cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào thể tiềm tan mẫn cảm nhiệt độ bacteriophage λ (cIts857) Các tế bào sinh trưởng tới pha log muộn 30 oC sau nâng lên 40 oC để bất hoạt gen ức chế (repressor) mở promoter P L Gen chèn vào điều hòa hoạt động protein N nutL nutR để ngăn cản kết thúc tR Hiệu suất dịch mã mRNA chịu chi phối vài yếu tố: - Mức độ bổ sung chuỗi SD đầu 3’ 16S rRNA - Khoảng cách chuỗi SD codon AUG để chuỗi DNA eukaryote định vị - Nucleotide theo sau AUG ảnh hưởng liên kết ribosome Đưa codon ATG vào gen tạo dòng trì vị trí liên kết ribosome (RBS) vi khuẩn cách dùng vector pAS1 (Hình 7.8) Vector pAS1 mang promoter PL RBS gen cII bacteriophage λ, codon khởi đầu ATG dung hợp trực tiếp với phần mã hóa đầu tận amino gen eukaryote muốn biểu Cách làm hạn chế việc tối ưu khoảng cách chuỗi SD vi khuẩn codon khởi đầu ATG gen eukaryote để có biểu hiệu gen Đoạn DNA có gắn promoter chuỗi SD sau biến nạp vào chủng E coli thích hợp Sàng lọc thể biến nạp để thu khuẩn lạc có mức độ phiên mã cao III Xác định mức độ biểu gen tạo dòng Nói chung có ba cách thường dùng để đánh giá mức độ biểu protein ngoại lai gen tạo dòng: - Điện di polyacrylamide gel để xác định protein có kích thước thích hợp sản xuất mức độ cao tế bào mang vector biểu Thông thường, protein quan tâm quan sát cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue thuốc nhuộm bạc Nếu không thấy có băng protein dùng thuốc nhuộm này, đánh dấu trao đổi chất với 100 µCi [35S]Met [35S]Cys mL dịch nuôi cấy phút Điện di SDS-polyacrylamide gel thực phóng xạ tự ghi cho phép phát protein quan tâm - Phân tích Western blot cách dùng kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm thẩm tích lên màng nitrocellulose sau thực diện di SDS-PAGE (xem chương 2) - Nếu mức độ biểu thấp nên đặt gen lacZ hướng với gen biểu Như vậy, phiên mã dịch mã hạn chế biểu gen thay đổi hệ thống biểu kiểm soát thay đổi hoạt tính β-galactosidase Western blot Phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể có tính đặc hiệu cao Vì vậy, áp dụng phản ứng để phát có mặt tinh protein Kháng thể (antibody) sản xuất đưa kháng nguyên vào thỏ tinh từ máu thỏ sau gây nhiễm Những kháng thể tạo cách kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do tế bào lympho khác tiết ra), chúng có khả nhận biết số kháng nguyên Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) tương tác với kháng nguyên định Hình 7.9 Sơ đồ kỹ thuật Western blot Kháng thể đánh dấu bằng enzyme (hoặc chất phát huỳnh quang) để phát protein đặc hiệu (thường thẩm tích lên màng nitrocellulose sau chạy điện di SDS-PAGE, cố định đó) thông qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 7.9) Cơ chế phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể trình bày hình 7.10 Sau protein màng lai gắn với kháng thể thứ đặc hiệu tiếp đến kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) phức hợp liên kết với chất để tạo màu Sự diện protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã gen ngoại lai chuyển vào tế bào vật chủ) phát nhờ xuất màu phản ứng lai Hình 7.10 Sơ đồ mô tả liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme Western blot Sự phân bố protein đặc hiệu tế bào tổ chức mô phát kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western blot Ngoài ra, kháng thể sử dụng để tinh protein đặc hiệu kết tủa miễn dịch sắc ký lực (affinity chromatography) Kháng thể đánh dấu dùng để định lượng kháng nguyên kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt ELISA ELISA ELISA kỹ thuật hóa sinh, dựa phản ứng liên kết kháng nguyênkháng thể, dùng chủ yếu miễn dịch học để phát có mặt kháng thể kháng nguyên mẫu Tương tự kỹ thuật Western blot, ELISA người thường dùng hai loại kháng thể Một kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên protein (kháng thể thứ nhất) Một kháng thể khác, phản ứng với phức hợp kháng thể-kháng nguyên, kết hợp với enzyme (kháng thể thứ hai) Kháng thể thứ hai nhờ có liên kết với enzyme (như tên kỹ thuật xét nghiệm) nên bắt màu với chất để tạo tín hiệu (Hình 7.11) Hình 7.11 Sơ đồ kỹ thuật ELISA Do ELISA thực để đánh giá có mặt kháng nguyên kháng thể mẫu phương pháp quang phổ (đo độ hấp thụ quang), công cụ hữu ích để xác định nồng độ (định lượng) kháng nguyên kháng thể IV Tăng mức độ biểu hiện gen tạo dòng Các mức độ biểu gen ngoại lai E coli thường kiểm tra thử nghiệm chức xét nghiệm miễn dịch khác Tuy nhiên, cố đạt đến mức tối đa biểu sản phẩm gen phân tích phức tạp Để khắc phục khó khăn sản phẩm gen eukaryote không dung hợp biểu người ta sử dụng phương pháp cho DNA ngoại lai dung hợp với đoạn tương ứng gen lacZ cho phép gen ngoại lai chép lại dịch mã cách hiệu Plasmid dùng phương pháp pLG mang gen lacZ mã hóa đầu tận carboxyl có hoạt tính β-galactosidase Tuy nhiên, β-galactosidase chưa tổng hợp thiếu promoter trình tự SD plasmid Do đó, promoter di động (portable promoter) gắn phía trước gen dung hợp điều chỉnh biểu mức độ cao protein dung hợp có hoạt tính β-galactosidase Các plasmid có đoạn promoter đặt tối ưu nhận biết cách biến nạp vi khuẩn Lac - thu hoạt tính βgalactosidase đĩa thị lactose (lactose indicator) Các plasmid sau dùng để tái cấu trúc gen eukaryote không hợp mà biểu mức độ cao Mức độ biểu thấp gen tạo dòng RNA không ổn định, kết thúc chưa hoàn chỉnh, dịch mã không hiệu quả, protein không ổn định V Tinh protein Thể vùi phương pháp hòa tan thể vùi 1.1 Thể vùi Protein có mức độ biểu cao E coli thường tạo hạt nhỏ không hòa tan tế bào chất (thể vùi), quan sát kính hiển ngược pha tách khỏi dịch tan tế bào sống phương pháp ly tâm Các tế bào biểu mức độ cao protein ngoại lai cô lại ly tâm phá vỡ kỹ thuật học, siêu âm, dùng lysozyme kết hợp với chất tẩy Các thể vùi (inclusion) tạo tiểu thể ly tâm rửa với Triston X-100 EDTA urea Để thu chất hòa tan, protein hoạt động, thể vùi rửa phải hòa tan sau phải tái cuộn xoắn Mỗi protein cần phương pháp hòa tan khác thường xác định theo kinh nghiệm Các điều kiện khác (ví dụ: guanidine HCl [5-8 M], urea [6-8 M], SDS, alkaline pH, acetonitrile/propanol) sử dụng để hòa tan thể vùi Trong nhiều trường hợp, cần pha loãng đơn giản dịch chiết hòa tan đệm thích hợp đủ Nếu protein chứa cầu nối disulfide, người ta cần phải tiến hành oxy hóa khử glutathione Một cần bổ sung đồng dung môi (co-solvent) PEG, chất tẩy rửa Triton X-100, Tween 20 Zwittergent 3-16 Sau hòa tan thành công, thử nghiệm phương pháp tái cuộn xoắn khác bao gồm pha loãng thẩm tách Hiệu suất tạo protein hoạt động protein có liên kết disulfite giống protein gốc phụ thuộc vào nồng độ, độ tinh kích thước chuỗi polypeptide; độ pH cường lực ion dung môi; tỷ lệ tái cuộn xoắn chúng Các nhân tố khác bao gồm số lượng liên kết disulfite chất protein Trong số trường hợp, protein hòa tan khó tái cuộn xoắn người ta thấy việc bổ sung chaperonins giúp ích cho trình Chaperonins protein cần để đảm bảo cuộn xoắn xác in vivo protein, với khả thuận lợi chaperonin tái tổ hợp chúng dùng để xúc tác cho trình tái cuộn xoắn xác in vitro protein Nguyên nhân tạo thành thể vùi chưa biết đầy đủ, tất protein biểu mức độ cao tạo thành thể vùi Tế bào vật chủ thể vai trò quan trọng Cấu trúc xác protein tái tổ hợp ảnh hưởng tạo thành thể vùi Một nghiên cứu thực với γ -interferon người tái tổ hợp cho thấy vài thay đổi amino acid ảnh hưởng đến chuyển hóa biểu protein hòa tan không hòa tan E coli 1.2 Phương 1.2.1 Làm tan tế bào pháp hòa tan thể vùi Ly tâm thu tiểu thể tế bào E coli, tái huyền phù tiểu thể phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) lysozyme, đặt nhiệt độ phòng (RT) khoảng 20 phút (thỉnh thoảng khuấy) Sau đó, bổ sung deoxycholic acid, đặt 37 oC khuấy dịch tan trở nên sền sệt, bổ sung DNase I để 30 phút RT 1.2.2 Tinh rửa thể vùi - Phương pháp Ly tâm dịch tan thu bước trên, tái huyền phù tiểu thể Triston X-100 EDTA, giữ RT phút Ly tâm 15 phút lấy tiểu thể tái huyền phù nước Trộn dung dịch với đệm 2× SDS gel-loading dye phân tích điện di polyacrylamide gel để xác định protein quan tâm có tiểu thể không - Phương pháp Ly tâm dịch tan, tái huyền phù tiểu thể nước Sau đó, ly tâm lại tái huyền phù tiểu thể Tris.HCl có bổ sung urea Ly tâm tái huyền phù tiểu thể nước Trộn dung dịch với đệm 2× SDS gel-loading dye phân tích điện di polyacrylamide gel để xác định điều kiện rửa thích hợp cho protein 1.2.3 Hòa tan thể vùi Treo tiểu thể rửa đệm dung ly chứa PMSF urea, để RT Bổ sung dung dịch có KH2PO4, EDTA NaCl để 30 phút RT, trì pH 10,7 KOH Điều chỉnh pH tới 8,0 HCl để 30 RT Ly tâm thu tiểu thể tái huyền phù đệm 1× SDS gel-loading dye Phân tích điện di để xác định mức độ hòa tan Các đuôi lực Khái niệm đuôi lực xuất thiết kế di truyền với mục đích giúp cho tinh protein enzyme hiệu Gen protein quan tâm dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho số trình tự amino acid đơn giản hóa trình tinh protein, cách biến đổi tính chất kiểu dự đoán Một trường hợp dung hợp di truyền số gốc arginine với C-terminus urogastrone Gen sản xuất protein liên kết mạnh với khuôn trao đổi ion cho cation Đuôi polyarginine sau loại bỏ cách dùng enzyme bất động carboxypeptidase A Hình 7.12 Tinh protein đích sắc ky lực Cho hỗn hợp protein tái tổ hợp qua cột sắc ký có chứa phối tử liên kết đặc hiệu với protein mang đuôi lực (ví dụ: His, Histidine GST, glutathione-S-transferase) Các chất bẩn rửa trôi khỏi cột, protein liên kết cột sau rửa giải dạng tinh Đuôi lực có nhiều ưu điểm tinh protein Trong IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography), His liên kết chọn lọc cao với Ni 2+ kim loại chuyển tiếp khác bất động phối tử, protein có gắn đuôi lực rửa giải chọn lọc imidazole Protein gắn đuôi GST liên kết với glutathione phối tử, rửa giải với dung dịch glutathione Các protein có đuôi dung hợp GST mang hoạt tính enzyme tinh điều kiện tự nhiên Ngược lại, protein gắn đuôi His tinh điều kiện tự nhiên biến tính Hình 7.13 Phân tích SDS-PAGE và nhuộm Coomassie Blue sản phẩm protein sau tinh sắc ky lực 1: Chuẩn khối lượng phân tử protein 2: Protein hòa tan tổng số 3: Protein dung hợp (protein đích GST) rửa giải khỏi cột glutathione sepharose 4: Protein dung hợp cắt PresCission Protease cho băng GST protein đích 5: Protein đích tinh sau cho qua IMAC Khó khăn chủ yếu dung hợp lực để tinh protein phải loại bỏ thành công đuôi lực tác nhân sử dụng Vấn đề giải phần biến nạp di truyền điểm đặc hiệu cao cho protease cho cắt bỏ liên kết acid không bền chỗ nối protein tái tổ hợp đuôi lực Nhiều phương pháp phân cắt gợi ý Sử dụng protease đặc hiệu thích hợp cả, ứng dụng điều kiện “nhẹ nhàng”, chủ yếu thrombin, enterokinase Factor Xa Tất protein hoạt động 37 oC phân cắt vị trí bên protein quan tâm, tính đặc hiệu từ nhiễm bẩn protease Cuối cùng, bước sắc ký yêu cầu để loại bỏ đuôi lực phân cắt protease Trong phát triển gần lĩnh vực này, người ta sử dụng dạng tái tổ hợp protease 3C từ rhinovirus người Protease có kích thước nhỏ (20 kDa) có tính đặc hiệu hạn chế Nó biểu protein tái tổ hợp dung hợp với glutathione-S-transferase Điều có vài ưu điểm, thân protease tinh sắc ký lực glutathione-Sepharose Nếu protein đích biểu dung hợp với glutathione-S-transferase tinh cột glutathione-Sepharose Sau xử lý với protease, protein đích phân tách khỏi đuôi glutathione-S-transferase protease cách chuyển qua cột glutathione-Sepharose thứ hai Một cách khác, phản ứng phân cắt đặt cột glutathione-Sepharose thứ cách bổ sung protease vào đệm cột, tránh cần thiết cho cột thứ hai Protease có sẵn dạng thương mại tên PreCission Protease Amersham Pharmacia Biotech sản xuất (Hình 7.12 7.13) Tài liệu tham khảo/đọc thêm Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short Protocol in Molecular Biology Vol and 5th ed John Wiley & Sons, Inc USA Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory Press, USA Ohman DE 1989 Experiments in Gene Manipulation Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA Primrose SB, Twyman R and Old RW 2001 Principles of Gene Manipulation 6th ed Blackwell Science, Oxford, UK Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook Humana Press Inc New Jersey, USA Rosenberg IM 1996 Protein Analysis and Purification-Benchtop Techniques Birkhäuser, Boston, USA Surzycki S 2000 Basic Techniques in Molecular Biology Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany Walker JM 2002 The Protein Protocols Handbook 2nd ed Humana Press Inc Totowa, New Jersey, USA