Đang tải... (xem toàn văn)
Bằng phương pháp chiết siêu âm với cồn acid, chúng tôi đã chiết được alkaloid toàn phần từ lá trinh nữ hoàng cung (TNHC), từ đó định lượng được crinamidin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này có độ nhạy cao, cho kết quả chính xác và lặp lại, hiện nay HPLC đang được ứng dụng rất phổ biến trong nhiuều lĩnh vực, đặc biệt là trong kiểm nghiệm phân tích thành phần hoạt chất trong dược liệu. ĐẶT VẤN ĐỀ Trinh nữ hoàng cung từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng trong việc điều trị u xơ tử cung và phì đại tuyến tiền liệt. Trong nước và trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học đã chứng minh công dụng này của cây TNHC. Hơn nữa, tại hội nghị phát triển dược liệu tại Bình Dương vào tháng 05 năm 2010, TNHC đã được công nhận là một trong ba sản phẩm quốc gia từ dược liệu. Chính vì vậy việc kiểm tra và theo dõi sự thay đổi hàm lượng hoạt chất trong lá TNHC theo thời gian và thổ nhưỡng là hết sức cần thiết. Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài với mong muốn ứng dụng kỹ thuật phân tích hiện đại vào công tác kiểm tra chất lượng thuốc, góp phần nâng cao chất lượng thành phẩm đến tay người bệnh. THỰC NGHIỆM A. Chuẩn bị mẫu 1. Mẫu thử Lá TNHC thu hái tại các tỉnh Bình Định, Tây Ninh, Đồng Nai và Tp.Hồ Chí Minh. 2. Quy trình chiết alkolid toàn phần từ lá trinh nữ hoàng cung Lá TNHC thu hái, rửa sạch, xắt nhỏ, phơi khô trong bóng râm, xay nhuyễn. Cân chính xác khoảng 10g bột lá cho vào bình nón 250 ml, thêm 100 ml hỗn hợp EtOH 96% và HCl 1% tỉ lệ 50 : 50 rồi siêu âm trong 1 giờ, lọc qua giấy lọc, (thực hiện 3 lần như trên). Gộp các dịch lọc lại sau đó kiềm hóa bằng NH4OH ññ ñeán pH » 9 10. Dịch lọc đã kiềm hóa cho vào bình lắng gạn 250 ml, chiết bằng CH2Cl2 đến khi thu được toàn bộ alkaloid dạng base.
KHO ST S THAY I HM LNG CRINAMIDIN TRONG L TRINH N HONG CUNG (Crinum latifolium L Amaryllidaceae) THEO THI GIAN V THEO TH NHNG BNG PHNG PHP SC Kí LNG HIU NNG CAO Nguyn Hu Lc Thy, Phan Thanh Dng, Trn Th Qunh Trõm TểM TT Bng phng phỏp chit siờu õm vi cn acid, chỳng tụi ó chit c alkaloid ton phn t lỏ trinh n hong cung (TNHC), t ú nh lng c crinamidin bng phng phỏp sc ký lng hiu nng cao (HPLC) Phng phỏp ny cú nhy cao, cho kt qu chớnh xỏc v lp li, hin HPLC ang c ng dng rt ph bin nhiuu lnh vc, c bit l kim nghim phõn tớch thnh phn hot cht dc liu T VN Trinh n hong cung t lõu ó c nhõn dõn ta s dng vic iu tr u x t cung v phỡ i tuyn tin lit Trong nc v trờn th gii ó cú nhiu cụng trỡnh nghiờn cu khoa hc ó chng minh cụng dng ny ca cõy TNHC Hn na, ti hi ngh phỏt trin dc liu ti Bỡnh Dng vo thỏng 05 nm 2010, TNHC ó c cụng nhn l mt ba sn phm quc gia t dc liu Chớnh vỡ vy vic kim tra v theo dừi s thay i hm lng hot cht lỏ TNHC theo thi gian v th nhng l ht sc cn thit Xut phỏt t thc t nờu trờn, chỳng tụi thc hin ti vi mong mun ng dng k thut phõn tớch hin i vo cụng tỏc kim tra cht lng thuc, gúp phn nõng cao cht lng thnh phm n tay ngi bnh THC NGHIM A Chun b mu Mu th - Lỏ TNHC thu hỏi ti cỏc tnh Bỡnh nh, Tõy Ninh, ng Nai v Tp.H Chớ Minh Quy trỡnh chit alkolid ton phn t lỏ trinh n hong cung Lỏ TNHC thu hỏi, sch, xt nh, phi khụ búng rõm, xay nhuyn Cõn chớnh xỏc khong 10g bt lỏ cho vo bỡnh nún 250 ml, thờm 100 ml hn hp EtOH 96% v HCl 1% t l 50 : 50 ri siờu õm gi, lc qua giy lc, (thc hin ln nh trờn) Gp cỏc dch lc li sau ú kim húa bng NH4OH ủủ ủeỏn pH - 10 Dch lc ó kim húa cho vo bỡnh lng gn 250 ml, chit bng CH2Cl2 n thu c ton b alkaloid dng base Bt lỏ TNHC (10 gam) 100 ml EtOH 96% : HCl 1% (50:50) Siờu õm gi Lc Bó dc liu Dch chit cn acid NH4OH pH -10 CH2Cl2 Lc k, tỏch lp Dch kim Dch CH2Cl2 Cụ dung mụi(t hot) Cn alkaloid ton phn ( 45 mg) S Quy trỡnh chit alkaloid ton phn t lỏ TNHC X lý mu bng k thut chit pha rn (SPE) - Cn alkaloid c chit theo s c hũa tan 0,5-1ml MeOH, thờm 20 ml H3PO4 0,5%, siờu õm - phỳt, cho qua SPE ó hot húa, gii bng H 3PO4 0,5% cho vo bỡnh nh mc dung tớch 50 ml v in ti vch Bc 1: Dựng khong ml MeOH hot húa ct, hỳt n khụ Bc 2: Np mu Bc 3: Dựng H3PO4 0,5% gii ton b alkaloid mu ct, thu c dch trong, mu vng nht Mu i chiu - Cõn chớnh xỏc khong 5mg crinamidin, cho vo bỡnh nh mc 5ml, hũa tan v in ti vch bng MeOH, sau ú pha loóng 25 ln Thm dũ iu kin trin khai HPLC - Thc hin trờn ct sc ký ct Phenomenex C8 (250 mm x 4,6 mm; 5àm) - La chn sc ký nhiu bc súng 214 nm, 224 nm, 254 nm, 285 nm, nhng ch cú sc ký bc súng 214 nm cho cỏc nh tỏch rừ nht v din tớch cao nht - Thm dũ pha ng: Tin hnh thm dũ trờn nhiu h pha ng MeOH - m phosphat pH 2,3; MeOH - H3PO4 0,25%; MeOH - H3PO4 0,5% vi cỏc t l khỏc Bng Cỏc pha ng c thm dũ H dung mụi MeOH (ml) 20 15 18 15 17,5 18 20 22,5 15 80 85 85 82,5 82 80 77,5 m phosphat (ml) H3PO4 0,25% (ml) H3PO4 0,5% (ml) Acid formic 2% (ml) Nhn xột 82 85 + ++ - - ++ - (+): nh tỏch, chõn nh khụng p; (++): nh tỏch rừ, p (-): nh tỏch khụng rừ; (- -): nh khụng tỏch Sau tin hnh thm dũ, iu kin sc ký c la chn nh sau: - H thng HPLC hiu Waters 2695 (M), u dũ Waters 2996 Photodiode Array Detector, h thng bm mu t ng, phn mm x lý Empower - Ct sc ký: Phenomenex C8 (250 mm x 4,6 mm; àm) - Pha ng: MeOH - acid H3PO4 0,5% (18 : 82) - Bc súng phỏt hin: UV - 214 nm - Tc dũng: ml/ phỳt - Th tớch bm: 10 àl Sau xỏc nh c iu kin trin khai HPLC, tin hnh nh tớnh v nh lng crinamidin lỏ trinh n hong cung - nh tớnh: trờn sc ký cho thy dch chit t lỏ TNHC cú peak cú thi gian lu trựng vi thi gian lu ca cht i chiu crinamidin Mu i chiu crinamidin :nh lng - Dch chit t lỏ TNHC Hm lng Crinamidine cú 100 gam lỏ TNHC c tớnh theo cụng thc: P= St 50 100 ì Cc ì a ì ì ì 100 Sc m 100 h St: Din tớch nh ca mu th Sc: Din tớch nh ca cht i chiu Cc: nng ca mu chun (mg/ ml) a: tinh khit ca mu chun (%) m: lng cõn (gam) h: m tng i ca bt lỏ TNHC (%) P: hm lng Crinamidine cú 100 gam lỏ TNHC B Thm nh quy trỡnh nh lng Tớnh c hiu Khi thờm mt lng cht chun vo mu th, trờn sc ký , din tớch nh ca nh ca Crinamidin mu th tng so vi lỳc cha cho cht chun Cht i chiu Mu th Mu th thờm cht i chiu .Quy trỡnh t yờu cu v tớnh c hiu Tớnh tuyn tớnh Bng Kt qu kho sỏt tớnh tuyn tớnh Dung dch Nng (àg/ ml) Din tớch nh X1 0,212 15211 X2 1,696 110961 X3 3,392 223389 X4 8,480 584723 X5 X6 21,200 42,400 1450347 2973211 Hỡnh ng biu din mi tng quan gia nng v din tớch nh ca crinamidin Kt qu cho thy cú s tuyn tớnh gia nng v din tớch nh ca crinamidin vi khong tuyn tớnh 0,212 42,4 àg/ml theo phng trỡnh hi quy tuyn tớnh = 70177x h s tng quan r2 = 0,9998 ỳng Bng Kt qu kho sỏt ỳng T l phc hi trung bỡnh nm gii hn cho phộp, quy trỡnh t yờu cu v ỳng Mc thờm vo 80% 100% 120% Trung bỡnh Hm lng chun thờm vo (àg) 7,23 9,04 10,85 Hm lng chun tỡm thy (àg) 7,23 8,69 10,73 T l phc hi (%) 100,00 96,17 98,01 98,06 lp li Bng Kt qu kho sỏt lp li Mu Hm lng Crinamidine (mg/100g lỏ) 9,38 8,69 9,25 8,75 9,36 8,80 Kt qu X = 9,04 SD = 0,32 RSD% = 3,59 Gii hn tin cy = 0,34 Khong tin cy = 9,05 0,34 RSD nm gii hn cho phộp, quy trỡnh t yờu cu v lp li C nh lng crinamidin lỏ TNHC theo thi gian v theo th nhng Bng Kt qu nh lng Crinamidine theo thỏng v ni trng Ni thu hỏi Thỏng thu hỏi Bỡnh nh Tõy Ninh ng Nai Mu 2 2 2 2 2 2 14,65 14,85 15,12 12,94 15,02 15,85 12,47 14,62 15,42 Tp.HCM m (%) 15,60 16,05 16,03 Hm lng Trung bỡnh Crinamidine (mg/100g lỏ) (mg/100g lỏ) 6,78 6,89 7,01 12,59 11,75 10,91 10,01 10,47 10,94 3,75 3,74 3,72 5,89 6,39 6,88 2,98 3,24 3,5 19,45 18,44 17,43 18,71 19,47 20,22 2,67 2,71 2,75 1,36 1,23 1,1 21,4 20,63 19,86 15,43 14,79 14,16 Nhn xột: qua thc nghim cho thy cú s tỏc ng ca khớ hu v th nhng n vic trng cõy TNHC Hm lng crinamidin thu hỏi ti cỏc tnh u tng cao vo thỏng 05, v lỏ TNHC thu hỏi ti Tp.HCM cú hm lng crinamidin cao nht KT LUN Kho sỏt s thay i hm lng crinamidin lỏ TNHC theo thi gian v theo th nhng bng phng phỏp HPLC giỳp cho quỏ trỡnh kim soỏt nguyờn liu u vo c cht ch hn, t ú sn xut c thnh phm thuc cha TNHC t tiờu chun cht lng v nõng cao hiu qu iu tr TI LIU THAM KHO Nguyn Tun Anh, Phm Th Ging, Trnh Vn Qu (2006), Tp kim nghim thuc, s 4, Tp 4(14), tr 10-14 ng Vn Hũa, Vừ Th Bch Hu, Nguyn c Tun, Vnh nh, Nguyn Th Hng Hng (2009), Giỏo trỡnh lý thuyt kim nghim thuc, B mụn Húa phõn tớch - Kim nghim, Trng i Hc Y Dc Tp.HCM, tr 96-125 Vừ Th Bch Hu, Lờ Th Tuyt Võn, ng Vn Hũa (1998), Xỏc nh alkaloid ton phn chit xut t lỏ ca mt s loi thuc chi Crinum H Thy Tiờn (Amaryllidaceae), Tp Dc hc, s 10, tr 18-19 Tt Li (2000), Nhng cy thuc v v thuc Vit Nam, Nh xut bn Y hc, tr 511-512 C.W Fennell, J Van Staden (2001), Crinum species in traditional and modern medicine, Journal of Ethnopharmacology 78, pp 15-26 Nguyen Thi Ngoc Tram, Tz V Titorenkova, V St Bankova, N.V Handjieva, S.S Popov (2002), Crinum L Amaryllidaceae, Fitoterapia 73, pp 183-208 The United States Pharmacopeia 32 (2009), pp 236 ... nhưỡng đến việc trồng TNHC Hàm lượng crinamidin thu hái tỉnh tăng cao vào tháng 05, TNHC thu hái Tp.HCM có hàm lượng crinamidin cao KẾT LUẬN Khảo sát thay đổi hàm lượng crinamidin TNHC theo thời... tính định lượng crinamidin trinh nữ hoàng cung - Định tính: sắc ký đồ cho thấy dịch chiết từ TNHC có peak có thời gian lưu trùng với thời gian lưu chất đối chiếu crinamidin Mẫu đối chiếu crinamidin. .. Bảng Kết khảo sát độ Tỷ lệ phục hồi trung bình nằm giới hạn cho phép, quy trình đạt yêu cầu độ Mức thêm vào 80% 100% 120% Trung bình Hàm lượng chuẩn thêm vào (µg) 7,23 9,04 10,85 Hàm lượng chuẩn