93 nguyen nhat minh phuong 310 316

7 181 0
93 nguyen nhat minh phuong 310 316

Đang tải... (xem toàn văn)

Thông tin tài liệu

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ENZYME XYLANASE TỪ LÚA MÌ NẢY MẦM.Enzyme nội sinh 1→4β–Dxylanase, gọi tắt là xylanase, là enzyme đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình thủy phân arabinoxylan. Để hiểu sâu hơn về tính chất của xylanase, xylanase được phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học từ hạt lúa mì nảy mầm 24 ngày.

Tạp chí Khoa học 2009:11 310-316 Trường Đại học Cần Thơ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA ENZYME XYLANASE TỪ LÚA MÌ NẢY MẦM Nguyễn Nhật Minh Phương1, Evelien De Baker2, Gebruers K.2, Jan A Delcour2 ABSTRACT Endo-(1→4)-β–D-xylanases (EC 3.2.1.8), shortly called xylanases, are the most important enzymes involved in the hydrolysis of arabinoxylan To obtain more insight into the properties of the xylanases, the xylanases were isolated from germinated wheat kernels Different wheat xylanase isoforms were purified in one pool from a crude extract of wheat germinated for 24 days Soluble wheat proteins were fractionated by ammonium sulfate precipitation and anion exchange chromatography Then the wheat xylanases were selectively isolated by affinity chromatography with anti-barley xylanase antibodies The N-terminal sequences of the different isoforms of wheat xylanases were determined by Edman degradation Based on the alignment of the N-termini with the amino acid sequence of wheat xylanase, theoretical molecular masses ranging from approximately 60 kDa to 20 kDa and theoretical pI values ranging from 4,69 to 5,75 were calculated for the different xylanase isoforms Keywords: Xylanase, arabinoxylan, wheat, Anion exchange chromatography, Affinity chromatography, SDS-PAGE Title: Isolation and characterization of endogenous wheat xylanases from germinated wheat TÓM TẮT Enzyme nội sinh 1→4-β–D-xylanase, gọi tắt xylanase, enzyme đóng vai trò quan trọng trình thủy phân arabinoxylan Để hiểu sâu tính chất xylanase, xylanase phân lập xác định số đặc điểm sinh học từ hạt lúa mì nảy mầm 24 ngày Các dạng đồng đẳng xylanase khác tinh chế từ dịch chiết Protein hòa tan tủa phân đoạn với ammonium sulfate sắc ký trao đổi ion Sau xylanase phân lập có lựa chọn sắc ký lực với kháng thể xylanase từ lúa mạch Trình tự xếp acid amin chuỗi polypeptide đầu N tận dạng đồng đẳng xylanase định phương pháp Edman Dựa vào trình tự xếp acid amin đầu N xylanase, trọng lượng phân tử lý thuyết nằm khoảng 60 kDa đến 20 kDa điểm đẳng điện pI từ 5,75 đến 4,69 xác định cho dạng đồng đẳng xylanase từ lúa mì Từ khóa: Xylanase, lúa mạch, lúa mì, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực, SDS-PAGE GIỚI THIỆU Arabinoxylan thuộc polysaccharide không tiêu hóa nằm thành tế bào loại ngũ cốc lúa mì, lúa mạch, yến mạch, lúa mạch đen, bắp, lúa gạo v.v…(Fincher Khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Phòng thí nghiệm Hoá học Sinh hóa thực phẩm, Bộ môn Hệ thống phân tử vi sinh, Khoa Kỹ thuật sinh học, Đại học Leuven, Vương Quốc Bỉ 310 Tạp chí Khoa học 2009:11 310-316 Trường Đại học Cần Thơ Stone, 1986; Andersson Åman, 2001) Mặc dù arabinoxylan chiếm phần nhỏ hạt ngũ cốc arabinoxylan có ảnh hưởng đáng kể đến chức lúa mì trình kỹ thuật sinh học biết trình làm bánh mì, phân tách gluten - tinh bột, trình làm bia công nghệ chế biến thức ăn gia súc Thủy phân hoàn toàn arabinoxylan yêu cầu nhiều loại enzyme nội sinh ngoại sinh làm việc cách hiệp lực với (Biely, 1985; Poutanen công sự, 1991; Biely công sự, 1992) Theo quan điểm kỹ thuật sinh học, enzyme nội sinh 1→4-β–D-xylanase (gọi tắt xylanase) enzyme thủy phân arabinoxylan quan trọng Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 mạch xylose để tạo oligosaccharide, xylobiose xylose (Dekker Richards, 1976) có khả làm thay đổi tính chất lý hóa arabinoxylan (Biely công sự, 1992) Xylanase biết nhiều đến ngày có nguồn gốc từ vi sinh vật Vi sinh vật sử dụng enzyme để thủy phân thành tế bào thực vật phóng thích loại carbohydrate chuyển hóa nguồn lượng cho chúng (Simpson công sự, 2003) Hầu hết xylanase có nguồn gốc từ vi sinh tìm thấy gia đình enzyme thủy phân glycoside 10, 11 chúng ứng dụng trình kỹ thuật sinh học khác Trong số sử dụng chế biến ngũ cốc để cải thiện chất lượng sản phẩm từ ngũ cốc Ngược lại xylanase có nguồn gốc từ thực vật nghiên cứu Một số tinh chế từ bột lúa mì, lúa mạch nẩy mầm, bắp, đu đủ keo Xylanase từ lúa mạch có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng chúng công nghệ chế biến bia, từ tính chất sinh hóa, lí hoá chức hiểu rõ Ngược lại với xylanase có nguồn gốc từ lúa mạch, kiến thức xylanase từ lúa mì có nhiều giới hạn, tính chất, chức chúng hiểu biết nhiều Trong hạt lúa mì, hoạt độ xylanase thấp Trong khứ, Corder Henry (1989) chứng minh hoạt độ xylanase gia tăng suốt trình nẩy mầm hạt lúa mì Vì nghiên cứu này, dạng đồng đẳng khác xylanase từ lúa mì phân lập từ hạt lúa mì nẩy mầm Việc phân lập có tính chất cần thiết để hiểu sâu tính chất, chức xylanase đáp ứng cho nghiên cứu sau PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.1 Phương tiện Lúa mì thu hoạch từ Clovis Matton (Avelgem, Bỉ) vào năm 2005 Viên Azurine cross-linked wheat Xylazyme-arabinoxylan từ Megazyme (Bray, Ái Nhĩ Lan) Tất môi trường điện di cung cấp từ Bio-Rad (Nazareth, Bỉ) Băng protein chuẩn có trọng lượng phân tử thấp (GE Healthcare, Uppsala, Thụy Điển) bao gồm phosphorylase b (94,0 kDa), bovine serum albumin (67,0 kDa), ovalbumin (43,0 kDa), carbonic anhydrase (30,0 kDa), soybean trypsin inhibitor (20,1 kDa), α-lactalbumin (14,4 kDa) Tất hóa chất khác cung cấp từ Sigma-Aldrich (Bornem, Bỉ) 311 Tạp chí Khoa học 2009:11 310-316 Trường Đại học Cần Thơ 2.2 Phương pháp Xác định hoạt độ xylanase phương pháp so màu quang phổ Xylazymearabinoxylan (Megazyme, Bray, Ái Nhĩ Lan) bước sóng 590 nm Hàm lượng protein định phương pháp Bradford (1976), sử dụng bovine serum albumin (BSA) làm đường chuẩn đo bước sóng 595 nm (Ultraspec III UV/visible spectrophotometer -GE Healthcare, Uppsala, Thụy Điển) Lúa mì nẩy mầm 24 ngày sấy thăng hoa nghiền thành bột Protein trích ly dung dịch 50 mM sodium phosphate pH 7,0, °C chất ức chế enzyme protease bổ sung vào dịch chiết Theo sau, protein tủa phân đoạn °C với ammonium sulfate với mức độ bão hòa khác 0-20 % (F020), 20-40 % (F20-40), 40-60 % (F40-60), 60-80 % (F60-80) 80 % (F>80) Hỗn hợp ly tâm, phần lắng thẩm tách, sấy thăng hoa chuẩn bị cho bước tinh chế Dịch chiết enzyme xylanase thô tinh chế sắc ký trao đổi ion âm cột Q-sepharose (Anion exchange chromatography) sắc ký lực với kháng thể (Affinity chromatography) Kiểm tra độ tinh khiết protein nhận diện enzyme xylanase điện di gel SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) kiểm tra với kháng thể anti-barley xylanase Xác định trình tự acid amin đầu N tận phương pháp Edman KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Kết tủa với ammonium sulfate Hầu hết protein kết tủa tập trung mẫu tủa phân đoạn với ammonium sulfate có mức độ bão hoà 20-40 % 40-60 % Protein kết tủa phục hồi 23 % tổng số protein từ dịch chiết thô Protein bị bị biến tính trở nên không hoà tan bị tổn thất trình tủa phân đoạn Hoạt độ đặc trưng xylanase, diễn tả hoạt độ xylanase (mEU) hàm lượng protein (mg), cao mẫu 20-40 % khoảng 2364,2 mEU/mg (bảng 1) Kiểm tra độ tinh khiết enzyme xylanase mẫu 20-40 % gel SDS-PAGE với kháng thể antibarley xylanase cho thấy xylanase có trọng lượng phân tử khoảng 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa 60 kDa Mẫu 20-40 % chọn cho bước phân lập enzyme xylanase 94.0 kDa 67.0 kDa 43.0 kDa 30.0 kDa 20.1 kDa 14.4 kDa Marker F20-40 F40-60 Hình 1: Nhận diện enzyme xylanase với kháng thể anti-barley xylanase gel SDS-PAGE mẫu 20-40 % 40-60 % 312 Tạp chí Khoa học 2009:11 310-316 Trường Đại học Cần Thơ 3.2 Sắc ký trao đổi ion âm Sắc ký trao đổi ion kỹ thuật phù hợp dựa khác tính tích điện protein để phân tách protein hỗn hợp protein Phương pháp thường sử dụng bước trình tinh chế enzyme Hỗn hợp protein mẫu 20- 40% thông qua sắc ký trao đổi ion cột QSepharose Sắc ký đồ thu hồi hoạt độ xylanase thể hình Các phân đoạn thu hồi có hoạt độ xylanase cao gom chung với (F-AEC) kiểm tra độ tinh khiết cách nhuộm với bạc nhận diện enzyme với kháng thể gel SDS-PAGE (hình 3) Hoạt độ đặc trưng xylanase gia tăng gần lần sau phân tách sắc ký trao đổi ion so với mẫu sau kết tủa với ammonium sulfate mức độ bão hoà 20- 40% gần 60 lần so với dịch chiết thô (bảng 1) Từ hai gel SDS-PAGE (hình 3), rõ ràng nhiều protein bị nhiễm mẫu sau sắc ký trao đổi ion Tuy nhiên, băng protein thể rõ so với mẫu sau tủa phân đoạn với ammonium sulfate mức độ bão hoà 20- 40% Tất dạng đồng đẳng xylanase diện mẫu F20-40 hiện mẫu F-AEC 1.8 25 20 AU (280 nm) 1.4 1.2 15 1.0 0.8 10 0.6 0.4 Xylanase activity (EU/ml) 1.6 0.2 0.0 100 200 300 400 500 600 700 900 800 Volume (ml) UV xylanase activity Hình 2: Sắc ký đồ mẫu F20-40 phương pháp sắc ký trao đổi ion đồ thị biểu diễn hoạt độ xylanase 67.0 kDa 67 kDa 43.0 kDa 43 kDa 30.0 kDa 30 kDa 20.1 kDa 20.1 kDa 14.4 kDa F20-40 F-AEC Marker (a) 14.4 kDa F20-40 F-AEC Marker (b) Hình 3: (a) Gel SDS-PAGE nhuộm với bạc (b) nhận diện enzyme với kháng thể anti-barley xylanase mẫu F20-40 F-AEC 313 Tạp chí Khoa học 2009:11 310-316 Trường Đại học Cần Thơ 3.3 Sắc ký lực với kháng thể anti-barley xylanase Để tinh chế enzyme xylanase cách có lựa chọn từ dịch chiết xylanase tinh chế phần, cột lực bao gồm kháng thể anti-barley xylanase liên kết cộng hóa trị với protein A sử dụng Kháng thể biết phản ứng đặc biệt với protein mà có trình tự acid amin giống Kháng thể anti-barley xylanase cột lực phản ứng với enzyme xylanase lúa mì Điều ngạc nhiên trình tự acid amin xylanase lúa mạch lúa mì giống (Simpson cộng sự, 2003) Hỗn hợp protein sau phân tách kỹ thuật sắc ký trao đổi ion (F-AEC) tiếp tục tinh cột lực Nhờ vào tính đặc biệt phản ứng kháng thể với enzyme xylanase, có protein giữ lại cột tất protein khác chảy thông qua cột lực Sắc ký đồ bao gồm đỉnh thể hình Tất protein phân đoạn, thu hồi có protein đỉnh gom chung với (F-AB) xác định hoạt độ xylanase Hàm lượng protein F-AB giảm đáng kể so với F-AEC Tuy nhiên, hoạt độ đặc trưng xylanase F-AB gia tăng so với F-AEC 37 lần (bảng 1) Nhận diện enzyme xylanase với kháng thể anti-barley xylanase cho thấy băng protein Băng đỉnh gel chứa kháng thể bị rò rỉ từ cột lực Các băng lại có trọng lượng phân tử xấp xỉ 60 kDa, 40 kDa 30 kDa Cụ thể có băng khoảng 40 kDa, băng thấp 30 kDa băng khoảng 20 kDa (hình 5) 0.06 AU (280 nm) 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 Volum e (m l) Hình 4: Sắc ký đồ mẫu F-AEC phương pháp sắc ký lực với kháng thể antibarley xylanase Bảng 1: Tinh chế enzyme xylanase tủa phân đoạn với ammonium sulfate, sắc ký trao đổi ion âm sắc ký lực với kháng thể anti-barley xylanase Dịch chiết F20-40 F-AEC F-AB a Hàm lượng protein Hoạt độ xylanase (mg) 8625,0 545,7 88,8 0,7 (EU) 1886,3 1290,2 1166,4 318,8 Hoạt độ đặc Hệ số tinh trưng xylanase a (mEU/mg) 218,7 2364,2 13135,1 486190,0 (lần) 11 60 2223 Hoạt độ đặc trưng phân đoạn chia cho hoạt độ đặc trưng dịch chiết 314 Phục hồi (%) 100 68,4 61,8 0,17 Tạp chí Khoa học 2009:11 310-316 Trường Đại học Cần Thơ 67.0 kDa 43.0 kDa 30.0 kDa 20.1 kDa 14.4 kDa F-AB Marker Hình 5: Nhận diện enzyme xylanase sau sắc ký lực với kháng thể Sự khác băng protein đánh số từ 1-5 phản ứng Edman 3.4 Trình tự acid amin đầu N chuỗi polypeptide Hỗn hợp xylanase sau phân tách sắc ký lực với kháng thể thực phản ứng phân giải Edman để xác định trình tự acid amin đầu N tận để xác định có phải protein tinh enzyme xylanase Mẫu F-AB cô đặc nhiều lần với Microcon Các dạng đồng đẳng xylanase khác phân đoạn điện di gel SDS-PAGE cố định màng polyvinylidene fluoride (PVDF) cho việc giải trình tự acid amin Sự khác băng protein đánh số hình Trình tự acid amin đầu N bảng Những trình tự so sánh với trình tự acid amin miêu tả tài liệu Simpson cộng (2003) Trình tự acid amin thứ DVSMDGSLVDYAPFGSSTT với trọng lượng phân tử khoảng 60259,9 pI 5,47 Trọng lượng phân tử khớp với trọng lượng phân tử 60 kDa hình Hai trình tự acid amin thứ thứ DHKARFRQLKDKTDKAR DKTDKARKRDVILKLGAGAAASV Trọng lượng phân tử 43816,4 42535,9 với điểm đẳng điện 5,75 5,37 cho bảng Kết trùng khớp với trọng lượng phân tử hình Băng protein thứ bao gồm 19 acid amin LDNAFPFGTCINTSVIQKP có trọng lượng phân tử 39687,6 pI 5,05 Trong hình xylanase khoảng 30 kDa Lý cho không trùng khớp giải thích phần acid amin đầu C bị loại bỏ suốt trình nẩy mầm mà điều không xác định phản ứng Edman Caspers cộng (2001) miêu tả tượng xylanase lúa mạch suốt trình nẩy mầm Đối với băng protein thứ 5, trình tự acid amin PEPALFVNDYNVERAN có trọng lượng phân tử 22221,0 pI 4,69 Trọng lượng phân tử không trùng với trọng lượng hình khoảng 28 kDa Lý cho khác biệt chưa rõ chưa có tài liệu miêu tả tượng 315 Tạp chí Khoa học 2009:11 310-316 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 2: Trình tự acid amin băng protein mẫu F-AB định phản ứng Edman Trọng lượng phân tử điện đẳng điện pI Trọng lượng phân tử Băng DVSMDGSLVDYAPFGSSTT 60259,9 Băng DHKARFRQLKDKTDKAR 43816,4 Băng DKTDKARKRDVILKLGAGAAASV 42535,9 Băng LDNAFPFGTCINTSVIQKP 39687,6 Băng PEPALFVNDYNVERAN 22221,0 Trình tự acid amin pI 5,47 5,75 5,37 5,05 4,69 KẾT LUẬN Dựa vào phương pháp tủa phân đoạn với amonium sulfate, kỹ thuật sắc ký trao đổi ion sắc ký lực với kháng thể, enzyme xylanase enzyme đóng vai trò quan trọng trình thủy phân đường arabinoxylan phân lập tinh Có dạng đồng đẳng enzyme xylanase với trọng lượng phân tử khoảng 60, 40, 30 20 kDa điểm đẳng điện pI từ 5,47 đến 4,69 Đây bước khởi đầu quan trọng việc hiểu phần đặc điểm enzyme xylanase, tiền đề cho bước nghiên cứu để hoàn thiện tính chất lí, sinh hoá enzyme việc áp dụng chúng trình kỹ thuật sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Andersson R Åman, P., 2001 Cereal arabinoxylan: occurrence, structure and properties In: Advanced dietary fibre technology Ed McCleary, B.V and Prosky, L Blackwell Science Ltd, Oxford, UK 301-314 Biely P., 1985 Microbial xylanolytic systems Trends Biotechnology, 3: 286-290 Biely P., Vrsanska` M Kuca`r S., 1992 Identification and mode of action of endo(1→4)-β-xylanases In ‘Xylans and xylanases’ (J Visser et al., eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands 81–95 Caspers M.P.M, Lok F., Sinjorgo K.M.C, van Zeijl M.J., Nielsen K.A Cameron-Mills V., 2001 Synthesis, processing and export of cytoplasmic endo-b-(1,4)-xylanase from barley aleurone during germination Plant Journal, 26: 191-204 Corder A.M Henry R.J., 1989 Carbohydrate-degrading enzymes in germinating wheat Cereal chemistry, 66: 435-439 Dekker R.F.H Richards G.N., 1976 Hemicellulases: their occurrence, purification, properties and mode of action Adv Carbohydr Chem Biochem., 32: 277-352 Fincher G.B Stone B.A., 1986 Cell walls and their components in cereal grain technology In: Advances in cereal sciences and technology, vol VIII Ed Pomeranz, Y American Association of Cereal Chemists, Inc., St Paul, MN, USA 207-295 Poutanen K., Tenkanen M., Korte H Puls J., 1991 Accessory enzymes involved in the hydrolysis of xylans In ‘Enzymes in biomass conversion’, American Chemical Society, Washington DC, U.S.A 426–436 Simpson D.J., Fincher G.B., Huang A.H.C Verena Cameron-Mills, 2003 Structure and function of cereal and related higher plant (1→4)-β-xylan endohydrolases Journal of cereal science, 37: 111-127 316 ...Tạp chí Khoa học 2009:11 310- 316 Trường Đại học Cần Thơ Stone, 1986; Andersson Åman, 2001) Mặc dù arabinoxylan chiếm phần nhỏ... (14,4 kDa) Tất hóa chất khác cung cấp từ Sigma-Aldrich (Bornem, Bỉ) 311 Tạp chí Khoa học 2009:11 310- 316 Trường Đại học Cần Thơ 2.2 Phương pháp Xác định hoạt độ xylanase phương pháp so màu quang... kháng thể anti-barley xylanase gel SDS-PAGE mẫu 20-40 % 40-60 % 312 Tạp chí Khoa học 2009:11 310- 316 Trường Đại học Cần Thơ 3.2 Sắc ký trao đổi ion âm Sắc ký trao đổi ion kỹ thuật phù hợp dựa

Ngày đăng: 22/10/2017, 11:09

Hình ảnh liên quan

Hình 1: Nhận diện enzyme xylanase với kháng thể anti-barley xylanase trên gel SDS-PAGE trong mẫu 20-40 % và 40-60 %  - 93 nguyen nhat minh phuong 310 316

Hình 1.

Nhận diện enzyme xylanase với kháng thể anti-barley xylanase trên gel SDS-PAGE trong mẫu 20-40 % và 40-60 % Xem tại trang 3 của tài liệu.
Hình 2: Sắc ký đồ của mẫu F20-40 trong phương pháp sắc ký trao đổi ion và đồ thị biểu diễn hoạt độ xylanase  - 93 nguyen nhat minh phuong 310 316

Hình 2.

Sắc ký đồ của mẫu F20-40 trong phương pháp sắc ký trao đổi ion và đồ thị biểu diễn hoạt độ xylanase Xem tại trang 4 của tài liệu.
Hình 3: (a) Gel SDS-PAGE được nhuộm với bạc và (b) nhận diện enzyme với kháng thể anti-barley xylanase của mẫu F20-40 và F-AEC  - 93 nguyen nhat minh phuong 310 316

Hình 3.

(a) Gel SDS-PAGE được nhuộm với bạc và (b) nhận diện enzyme với kháng thể anti-barley xylanase của mẫu F20-40 và F-AEC Xem tại trang 4 của tài liệu.
Bảng 1: Tinh chế enzyme xylanase bởi tủa phân đoạn với ammonium sulfate, sắc ký trao đổi ion âm và sắc ký ái lực với kháng thể anti-barley xylanase  - 93 nguyen nhat minh phuong 310 316

Bảng 1.

Tinh chế enzyme xylanase bởi tủa phân đoạn với ammonium sulfate, sắc ký trao đổi ion âm và sắc ký ái lực với kháng thể anti-barley xylanase Xem tại trang 5 của tài liệu.
Hình 4: Sắc ký đồ của mẫu F-AEC trong phương pháp sắc ký ái lực với kháng thể anti- anti-barley xylanase  - 93 nguyen nhat minh phuong 310 316

Hình 4.

Sắc ký đồ của mẫu F-AEC trong phương pháp sắc ký ái lực với kháng thể anti- anti-barley xylanase Xem tại trang 5 của tài liệu.
Hình 5: Nhận diện enzyme xylanase sau sắc ký ái lực với kháng thể. Sự khác nhau của những băng protein được đánh số từ 1-5 trong phản ứng Edman  - 93 nguyen nhat minh phuong 310 316

Hình 5.

Nhận diện enzyme xylanase sau sắc ký ái lực với kháng thể. Sự khác nhau của những băng protein được đánh số từ 1-5 trong phản ứng Edman Xem tại trang 6 của tài liệu.
Bảng 2: Trình tự acid amin của 5 băng protein trong mẫu F-AB được quyết định bởi phản ứng Edman - 93 nguyen nhat minh phuong 310 316

Bảng 2.

Trình tự acid amin của 5 băng protein trong mẫu F-AB được quyết định bởi phản ứng Edman Xem tại trang 7 của tài liệu.

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan