BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ MỸ LINH PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ THÂN CÂY DÂU TẰM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ MỸ LINH PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ THÂN CÂY DÂU TẰM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thu Hằng PGS TS Đỗ Thị Hà HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đề tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ thầy cô, anh chị, bạn em sinh viên Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thu Hằng, người thầy giành thời gian, tâm huyết bảo thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Đỗ Thị Hà nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên để hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Dược liệu, trường Đại Học Dược Hà Nội, anh chị nhân viên khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu tạo điều kiện giúp đỡ thời gian qua Cuối cùng, muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè – người gắn bó, ủng hộ khích lệ trong suốt trình học tập trường thời gian thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2017 Học viên Hoàng Thị Mỹ Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.Về thực vật 1.2.Thành phần hóa học 1.3 Tác dụng sinh học 11 1.4 Công dụng 15 1.5 Độc tính cấp 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Hóa chất, dung môi 16 2.1.3 Máy móc, thiết bị dụng cụ 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Chiết xuất dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết lõi thân vỏ thân dâu tằm 17 2.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết lõi thân vỏ thân dâu tằm 18 2.2.3 Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ thân dâu tằm 18 2.2.4 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro hợp chất phân lập 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết lõi thân vỏ thân dâu tằm 19 2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro dịch chiết methanol, phân đoạn dịch chiết lõi thân vỏ thân dâu tằm chất phân lập từ thân dâu tằm 19 2.3.3 Phân lập hợp chất từ thân dâu tằm 20 2.3.4 Xử lý kết thực nghiệm 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Chiết xuất dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết lõi thân vỏ thân dâu tằm 21 3.2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết lõi thân vỏ thân dâu tằm 23 3.3 Phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat vỏ thân dâu tằm 24 3.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 27 3.4.1 Hợp chất Me01 27 3.4.2 Hợp chất Me02 29 3.4.3 Hợp chất Me04 29 3.5 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase hợp chất phân lập ……………… 31 CHƯƠNG BÀN LUẬN 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BHA beta hydroxy acid CK creatin kinase COX cyclooxygenase d doublet DC dịch chiết DPPH 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl HDL high density lipoprotein (lipoprotein tỷ trọng cao) IC50 inhibitory concentration of 50% (nồng độ ức chế 50% đối tượng thử) J số tương tác LDL-C low density lipoprotein cholesterol (lipoprotein tỷ trọng thấp) LPS/IFN-r lipopolysaccharid (LPS)/Interferon (IFN) MDA malonyldialdehyd MIC minimum inhibitory concentration (nồng độ ức chế tối thiểu) PĐ phân đoạn PGE prostaglandin E2 ppm phần triệu RBC red blood cell (số lượng hồng cầu) s singlet SKLM sắc ký lớp mỏng TBARS thiobarbituric acid reactive substances (chất phản ứng acid thiobarbituric) VLDL-C very low density lipoprotein cholesterol (lipoprotein tỷ trọng thấp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các hợp chất polyphenol thân cành dâu tằm 1.2 Các hợp chất triterpenoid thân cành dâu tằm 1.3 Thành phần hóa học phận khác dâu tằm 3.1 Kết chiết xuất dịch chiết methanol phân đoạn 23 từ dịch chiết lõi thân vỏ thân dâu tằm 3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro 23 dịch chiết methanol phân đoạn dịch chiết lõi thân vỏ thân dâu tằm 3.3 Kết đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro acid ursolic, oxyresveratrol kuwanon G 31 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 2.1 Ảnh chụp thân dâu tằm 16 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 18 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất dịch chiết methanol 22 phân đoạn dịch chiết lõi thân vỏ thân dâu tằm 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập hợp chất từ phân 27 đoạn ethyl acetat vỏ thân dâu tằm 3.3 Cấu trúc hóa học hợp chất Me01: Acid ursolic 28 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất Me02: Oxyresveratrol 29 3.5 Cấu trúc hóa học hợp chất Me04: Kuwanon G 31 4.1 Sơ đồ tóm tắt trình nghiên cứu phát triển thuốc từ 34 dược liệu với cách tiếp cận phân lập theo định hướng tác dụng sinh học ĐẶT VẤN ĐỀ Trong trình sinh tổng hợp acid uric, xanthin oxidase coi enzym chìa khóa xúc tác phản ứng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin phản ứng oxy hoá xanthin thành acid uric Do đó, chất ức chế xanthin oxidase - điển hình allopurinol sử dụng phổ biến lâm sàng để điều trị bệnh gút bệnh có liên quan đến tăng acid uric máu [116] Tuy nhiên, nhược điểm hợp chất tác dụng không mong muốn, đặc biệt phản ứng mẫn không hiệu điều trị gút cấp tác dụng chống viêm [111] Vì vậy, việc tìm kiếm hợp chất có hoạt tính ức chế xanthin oxidase khắc phục nhược điểm kể allopurinol cần thiết, hợp chất tự nhiên đối tượng đáng ý quan tâm nghiên cứu năm gần Cây Dâu tằm có tên khoa học Morus alba L., thuộc họ Dâu tằm (Moraceae), loại trồng phổ biến nhiều nơi để làm thức ăn cho tằm, lấy quả, làm thuốc Các phận dâu tằm (tang diệp), (tang thầm), cành (tang chi), vỏ rễ (tang bạch bì) vị thuốc có giá trị y học cổ truyền, dùng để chữa nhiều bệnh đau nhức đầu, hoa mắt chóng mặt, cao huyết áp, ho hen, đau nhức xương khớp, phù thũng, bụng trướng, mắt có màng,… [4], [10] Nhiều nghiên cứu giới chứng minh tác dụng sinh học phận dâu tằm (lá, quả, rễ,…) tác dụng chống oxy hóa [33], [38], [45], [137], hạ glucose máu [137], [13], [14], [53], [101], hạ lipid máu [49], [67], [82], [151], kháng khuẩn [112], [130], [63], kháng virus [48], [84], chống viêm [50], bảo vệ gan [69], [108], chống ung thư [52], [90] … Đáng ý, dịch chiết cành dâu tằm có tác dụng hạ acid uric huyết tăng thải trừ acid uric nước tiểu chuột nhắt trắng có tăng acid uric máu [125] Một nghiên cứu Việt Nam công bố cao chiết cồn tang chi (cành non) có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro [15] Thân phận có Me02-AcetoneD6-C13CPD&DEPT DEPT90 128 126 124 122 120 118 116 114 112 110 108 106 104 102 ppm 126 124 122 120 118 116 114 112 110 108 106 104 102 ppm 126 124 122 120 118 116 114 112 110 108 106 104 102 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 128 C13CPD 128 Phụ lục Dữ liệu phổ khối (MS) phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) hợp chất Me04 Display Report - Selected Window Selected Analysis Analysis Name: Me04.d Cot150x3mm.m Method: Sample Name: Me04 Analysis Info: MSD Trap Report v (A4-Opt2) Instrument: LC-MSD-Trap-SL 2195410AE0000514 Operator: Page of Print Date: 3/2/2017 2:08:23 PM Acq Date: 3/2/2017 2:06:07 PM 7.424 7.252 6.777 6.760 6.691 6.569 6.556 6.213 6.081 6.064 6.035 5.981 5.968 5.951 5.210 5.181 5.168 4.447 4.428 3.317 3.211 3.151 3.142 2.086 2.058 2.054 2.050 2.045 2.041 1.978 1.955 1.732 1.700 1.608 1.524 1.479 1.388 1.286 13.012 12.977 ME04-AcetoneD6-1H Current Data Parameters NAME 13HD_ME04 EXPNO PROCNO F2 - Acquisition Parameters Date_ 20170118 Time 12.14 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT Acetone NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2767999 sec RG 57.21 DW 50.000 usec DE 6.50 usec TE 303.1 K D1 1.00000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 500.2030889 MHz NUC1 1H P1 10.00 usec PLW1 22.00000000 W F2 - Processing parameters SI 65536 SF 500.2000086 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 12 11 10 2.47 2.92 1.05 0.75 2.72 3.24 2.84 0.79 0.60 0.32 13 1.08 1.00 1.22 0.97 1.32 1.26 2.33 1.91 1.72 0.66 1.25 14 2.14 15 ppm 7.5 1.08 7.424 7.252 1.00 7.0 1.22 1.32 6.569 6.556 1.26 2.33 6.0 1.91 6.213 6.081 6.064 6.035 5.981 5.968 5.951 5.5 5.210 5.181 5.168 1.72 5.0 0.66 4.5 1.25 4.447 4.428 ME04-AcetoneD6-1H 6.5 0.97 6.777 6.760 6.691 ppm 3.6 3.4 3.317 3.2 2.47 2.92 3.211 3.151 3.142 3.0 2.8 2.4 2.2 2.0 1.8 1.732 1.700 0.75 1.6 2.72 3.24 1.524 1.479 2.84 1.4 0.79 1.608 0.60 1.388 1.286 1.2 1.083 1.071 0.32 ME04-AcetoneD6-1H 2.6 1.05 2.086 2.058 2.054 2.050 2.045 2.041 1.978 1.955 1.0 ppm Current Data Parameters NAME 13HD_ME04 EXPNO PROCNO 47.56 38.57 30.26 30.11 30.05 29.95 29.80 29.65 29.49 29.34 25.81 24.47 23.05 17.68 183.11 165.59 164.87 162.07 161.45 161.25 160.80 157.34 157.06 133.90 133.61 132.05 124.36 122.85 121.37 115.57 113.18 108.01 107.91 107.56 105.44 103.59 103.47 102.75 98.25 209.29 206.56 ME4-AcetoneD6-C13CPD F2 - Acquisition Parameters Date_ 20170124 Time 17.02 INSTRUM spect PROBHD mm PABBO BB/ PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT Acetone NS 256 DS SWH 29761.904 Hz FIDRES 0.454131 Hz AQ 1.1010048 sec RG 198.57 DW 16.800 usec DE 6.50 usec TE 303.1 K D1 2.00000000 sec D11 0.03000000 sec TD0 ======== CHANNEL f1 ======== SFO1 125.7879670 MHz NUC1 13C P1 10.00 usec PLW1 88.00000000 W ======== CHANNEL f2 ======== SFO2 500.2020008 MHz NUC2 1H CPDPRG[2 waltz16 PCPD2 80.00 usec PLW2 22.00000000 W PLW12 0.34375000 W PLW13 0.22000000 W F2 - Processing parameters SI 32768 SF 125.7752854 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.40 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm 210 209.29 206.56 205 200 190 185 180 175 170 165 165.59 164.87 160 162.07 161.45 161.25 160.80 157.34 157.06 ME4-AcetoneD6-C13CPD 195 183.11 ppm 135 133.90 133.61 132.05 130 122.85 121.37 120 115 115.57 113.18 110 108.01 107.91 107.56 105 105.44 103.59 103.47 102.75 100 98.25 ME4-AcetoneD6-C13CPD 125 124.36 ppm 50 47.56 45 35 30 30.26 30.11 30.05 29.95 29.80 29.65 29.49 29.34 25.81 25 24.47 23.05 20 17.68 ME4-AcetoneD6-C13CPD 40 38.57 ppm ME4-AcetoneD6-C13CPD&DEPT DEPT90 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 210 200 C13CPD 210 200 ME4-AcetoneD6-C13CPD&DEPT DEPT90 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 135 130 C13CPD 135 130 ME04-Acetone-HSQC ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 ppm ME04-Acetone-HSQC ppm 100 105 110 115 120 125 130 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 135 ppm ME04-Acetone-HSQC ppm 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 ppm ... chiết phân đoạn Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro Phân đoạn dịch chiết có tác dụng mạnh Phân lập hợp chất Các hợp chất tinh khiết Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro. .. hợp chất từ phân đoạn dịch chiết lựa chọn mục 2.2.2  Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro hợp chất phân lập 2.2.4 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro hợp. .. thân dâu tằm theo định hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase với hai mục tiêu sau: Phân lập 2-3 hợp chất từ thân dâu tằm theo định hướng tác dụng ức chế xanthin oxidase Đánh giá tác dụng ức chế