Đang tải... (xem toàn văn)
I. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae41. Tổng quan về Vibrio cholerae42. Phạm vi áp dụng5II. Thử nghiệm sinh hóa trong qui trình định tính Vibrio cholerae51. Nguyên tắc52. Môi trường và hóa chất53. Quy trình phân tích114. Các bước tiến hành115. Kết quả18
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2016 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM DANH SÁCH THÀNH VIÊN VÀ NHIỆM VỤ MỤC LỤC I Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae .4 Tổng quan Vibrio cholerae Phạm vi áp dụng II Thử nghiệm sinh hóa qui trình định tính Vibrio Cholerae Nguyên tắc .5 Môi trường hóa chất Thành phần môi trường Quy trình phân tích 10 Các bước tiến hành 10 Kết 16 I Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae Tổng quan Vibrio cholerae Là vi khuẩn Gram âm, hình que hai đầu không tạo thành hình dấu phẩy, không sinh bào tử, di động nhờ lông roi Sống kị khí tùy ý, có khả lên men glucose không sinh không sinh H2S Vibrio cholerae có phản ứng oxidase(+), ADH(-), LDC(+), lên men sucrose, tăng trưởng môi trường chứa 0-3% NaCl, không phát triển môi trường chứa 6, 8, 10% muối T0op=370C, pHop=8.6, sống kị khí tùy ý, có khả phát triển tốt môi trường kiềm Vibrio cholerae bị tiêu diệt nhiệt độ 560C 30 phút Vibrio cholerae sinh độc tố ruột nội độc tố đường tiêu hóa, kích thích nghiêm trọng màng nhày tạo dịch dày, gây tiêu chảy nặng, nước, choáng, chí gây tử vong với tỉ lệ lên tới 25-50% Biện pháp điều trị tốt bổ sung nước chất điện giải thay Vibrio cholerae vi khuẩn gây bệnh dịch tả (Bệnh tả bệnh truyền nhiễm cấp tính phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) gây ra, lây truyền đường tiêu hoá Bệnh có biểu lâm sàng lỏng nôn nhiều lần, nhanh chóng dẫn đến nước - điện giải, suy tim mạch tử vong không điều trị kịp thời Hình ảnh vi khuẩn Vibrio cholerae Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo TCVN 7905 - 1: 2008 ( ISO 218721:2007) Dùng để phát Vibrio cholerae thực phẩm thức ăn chăn nuôi II Thử nghiệm sinh hóa qui trình định tính Vibrio Cholerae Nguyên tắc Phát Vibrio cholerae thực phẩm thực cách cân lượng mẫu xác định nuôi ủ môi trường lỏng chọn lọc Những khuẩn lạc giống Vibrio cholerae thử nghiệm phản ứng sinh hóa Môi trường hóa chất Môi trường hoá chất APW ( Alkaline Phosphat Water) TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose) Mục đích Tăng sinh chọn lọc: phục hồi sức sống vi sinh vật bị tổn thương nhằm gia tăng tăng mật độ tương đối vi sinh vật cần phát hiện, ức chế phát triển vi sinh vật không mong muốn Phânlập: Môi trường thạch Thiosulfate CitrateBile Salts Sucrose môi trường chọn lọc dùng để phân lập loài Vibrio từ mẫu xét nghiệm phân có lẫn với vi khuẩn khác Các loài Vibrio phân biệt đặc điểm khuẩn lạc sinh môi trường Các kiểu khuẩn lạc khác sinh từ loài Vibrio khác nhau, thể qua lên men sucrose Khi dùng thạch TCBS, nên dùng chất nuôi cấy đặc, loài Vibrio dễ chết đột ngột môi trường có để ngăn chặn điều Mẫu xét nghiệm tươi tốt nhất, vi sinh vật nhạy cảm với điều kiện khô, ánh sáng pH NA/TSA TSI/KIA Đĩa giấy Oxidase Dung dịch NaCl KOH 3% Arginine dehydrolase Ornithine decarboxylase Lysine decarboxylase TW (Tryptone Water) ONPG Kowac’s HCl NaOH (KOH) 10% acid Phục hồi Khẳng định sơ bộ: -Môi trường thạch KIA (Kligler Iron Agar) sử dụng để nuôi cấy trực tiếp cho trực khuẩn gram âm lên men đường glucose, đặc điểm phân loại bước đầu trực khuẩn gram âm Môi trường đồng thời thử tính lên men đường lactose, sinh trình lên men carbohydrat sinh H2S Tất đặc điểm sử dụng cho trực khuẩn gram âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột - Đĩa giấy Oxidase dùng để thử nghiệm Oxidase: Xác định diện enzyme oxidase V.cholerae -Dung dịch NaCl dùng để thử nghiệm tính chịu mặn V.cholerae Thử String test để khẳng định sơ Thử nghiệm sinh hoá để khẳng định Thuốc thử Indol Chỉnh pH Thành phần môi trường • APW ( Ancalin Peptone Water) Thành phần Khối lượng Peptone 10g Natri clorua (NaCl) 10g Nước cất lít • TCBS ( Thiosunfat- Citrat- Bile- muối- Sacaroza): môi trường phân lập Thành phần Khối lượng Pepton 10g Cao nấm men 5g Natri xitrat 10g Natri thiosunfat (Na2S2O3) 10g Mật bò 5g Sacaroza 20g Natri clorua 10g Sắt (III) xitrat (FeC6H5O7) 1g Natri cholate 3g Xanh brom thymol 0.04g Xanh thymol 0.04g Thạch 15g Nước cất vô trùng 1lít • NA/TSA Thành phần Khối lượng Dịch chiết thịt 5,0 g Pepton 3,0 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g Thạch Từ g đến 18 g Nước 1000 ml • TSI Thành phần Khối lượng Pepton 20,0 g Dịch chiết thịt 3,0 g Dịch chiết nấm men 3,0 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g Lactoza 10,0 g Sacaroza 10,0 g Glucoza 1,0 g Sắt (III) xitrat 0,3 g Đỏ phenol 0,024 g Thạch Từ g đến 18 g Nước 000 ml • ODC Thành phần Khối lượng L-Ornithin monohydroclorua 5,0 g Dịch chiết nấm men 3,0 g Glucoza 1,0 g Bromocresol tía 0,015 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g Nước 000 ml • LDC Thành phần Khối lượng L-lysin monohydroclorua 5,0 g Dịch chiết nấm men 3,0 g Glucoza 1,0 g Bromocresol tía 0,015 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g Nước 000 ml • ADH Thành phần Khối lượng L-Arginin monohydro clorua 5,0 g Dịch chiết nấm men 3,0 g Glucoza 1,0 g Bromocresol tía 0,015 g Natri clorua (NaCl) 10,0 g Nước 000 ml Quy trình phân tích Các bước tiến hành BƯỚC 1: Tăng sinh Cân 25g hay 25ml mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, thêm 225ml APW, dập mẫu 60 giây, ủ 37oC 16-24 10 Tăng sinh lần 1: Trong môi trường lỏng chọn lọc Cấy phần mẫu thử vào môi trường tăng sinh nhiệt độ môi trường Ủ huyền phù ban đầu 37 oC 6h ± 1h sản phẩm đông lạnh sâu 41.5 oC 6h ± 1h sản phẩm tươi, khô sản phẩm ướp muối Tăng sinh lần 2: Trong môi trường lỏng chọn lọc Chuyển 1ml dịch cấy thu tân sinh lần lấy từ bề mặt cho vào ống Ủ 37 ± 0.5 oC 24 → nhằm phục hồi sức sống vi sinh vật bị tổn thương, nhằm gia tăng mật độ tương đối vi sinh vật cần thiết, ức chế phát triển vi sinh vật không mong muốn Vibrio cholerae có mặt lượng nhỏ thường kèm với lượng lớn đáng kể với loài vi sinh vật khác thuộc họ Vibrionacea họ khác cần phải có hai bước tăng sinh chọn lọc liên tiếp để phát vi sinh vật BƯỚC 2: Phân lập Từ môi trường tăng sinh, cấy ria lên môi trường thạch TCBS, ủ 37 oC 24 Trên môi trường thach TCBS khuẩn lạc V cholerae tròn, lớn có màu vàng → khuẩn lạc có màu vàng lên men sucrose sinh khí CO 2, môi trường có tính acid ( chất thị bromthymol blue) BƯỚC 3: Phục hồi môi trường dinh dưỡng NA/TSA Đánh dấu khuẩn lạc điển hình nghi ngờ từ đĩa môi trường phân lập TCBS Nếu đĩa có khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc nghi ngờ, lấy tất khuẩn lạc điển hình nghi ngờ cấy ria lên NA/TSA có bổ sung 1.5% NaCl Ủ 37±1oC 24 BƯỚC 4: Khẳng định sinh hóa kháng huyết Từ khuẩn lạc chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào môi trường thử nghiệm sau: Các phép thử nhận dạng giả định Phép thử Phản ứng tiêu biểu 11 Vibrio cholerae Tính di động + Oxidase + Thử nghiệm tính di động: Nguyên tắc: Xác định khả di động Vibrio cholerae Dùng que cấy thẳng lấy vi sinh vật sang ống nghiệm thạch bán lỏng NA, đâm thẳng từ xuống ống môi trường, 37 oC 24 Phản ứng dương tính Vibrio cholerae lan khỏi đường cấy, xa hay gần tùy theo khả di động vi khuẩn mạnh hay yếu Phản ứng âm tính Vibrio cholerae mọc đường cấy Thử nghiệm oxidase: Nguyên tắc: Xác định diện hệ enzyme oxidase Vibrio cholerae Đặt giấy lọc lên nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2-3 giọt thuốc thử oxidase Dùng que cấy bạch kim (platin) que cấy nhựa dùng lần que cấy gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí nhỏ thuốc thử oxidase V.cholerae làm vết ria có màu tím thẩm xanh thẩm sau 30 giây đến phút 12 Các phép thử nghiệm khẳng định Phép thử Phản ứng tiêu biểu ADH - ODC + LDC + ONPG + TSI Vàng/vàng, không sinh H2S khí Indol + Thử nghiệm khả chịu mặn - 0% NaCl + - 2% + - 6% - - 8% - - 10% - Thử nghiệm decarboxylase • ADH: enzyme arginine dehydrolase • ODC: enzyme ornithine decarboxylase • LDC: enzyme lysine decarboxylase 13 Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào ống canh thang ornithine, lysine, arginine ống đối chứng acid amin Mỗi ống phủ 1-2 ml dầu khoáng vô trùng Ủ ống nhiệt độ 37oC 24 Phản ứng dương tính môi trường trở nên đục có màu tím Phản ứng âm tính toàn ống canh thang có màu vàng ổn định ngày (tương ứng màu ống đối chứng) Vibrio cholerae cho phản ứng lysine ornithine (+) phản ứng arginine âm tính Thử nghiêm ONPG: Xác định diện enzyme-β-galactosidase vi sinh vật Các vi khuẩn lên men lactose tổng hợp tế bào enzyme galactosidase có vai trò xúc tác thủy phân lactose permease có vai trò vận chuyển lactose vào bên tế bào Lấy vi khuẩn phát triển môi trường TSI từ môi trường không chọn lọc khác chứa 1% lactose vào ống nghiệm chứa 0.25ml nước muối sinh lý hòa tan Thêm giọt toluen vào ống lắc đều, để yên phút Thêm 0.25ml ONPG, ủ ống nghiệm nhiệt độ 37 oC V.cholerae cho phản ONPG dương tính môi trường chuyển sang vàng, âm tính môi trường không chuyển màu Thử nghiệm môi trường TSI/ KIA Nguyên tắc: nhằm xác định vi sinh vật sử dụng nguồn carbonhydrate nào, có sinh hay không, có sinh H2S hay không Cấy chuyển khuẩn lạc từ môi trường TSA vào ống nghiêm TSI KIA Nới lỏng nắp ống đẻ tạo điều kiện hiếu khí Nuôi ủ 37oC 18-24 Trên môi trường TSI, Vibrio cholerae làm phần thạch nghiêng thạch đứng môi trường chuyển sang màu vàng 14 không sinh không sinh H 2S Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ thạch đứng có màu vàng không sinh không sinh khí H 2S, Vibrio cholerae lên men đường glucose không lên men đường lactose Thời gian ủ không 24 giờ, cấy bề mặt nghiêng màu đỏ Vibrio cholerae chuyển sang màu vàng sau 24 Thử nghiệm indol: Cấy khuẩn nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường muối trypton-tryptophan Ủ 37oC 24 ± Sau ủ thêm ml thuốc thử Kowac’s Việc hình thành vòng màu đỏ phản ứng dương tính (hình thành indol) Vòng màu vàng chanh chứng tỏ phản ứng âm tính Thử nghiệm kháng huyết thanh: Nhỏ giọt kháng huyết lên lam kính giọt nước muối sinh lý lên vị trí khác chuyển vi khuẩn từ TSA lên giọt dung dịch phân tán 15 vi khuẩn Kết luận dương tính có tượng ngưng kết giọt có kháng huyết tượng ngưng kết giọt nước muối Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết Vibrio cholerae theo Bảng 4.1 Bảng 4.2 Bảng 4.1 Phân biệt Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae non - O1 Kháng nguyên Chủng có kết sinh hoá tương tự Vibrio cholerae Chủng có kết sinh hoá tương tự Vibrio cholerae Chủng có kết sinh hoá tương tự Vibrio cholerae Kháng huyết Dung dịch muối Kết luận đa giá O1 sinh lý + Vibrio cholerae O1 - - Vibrio cholerae non-O1 + + Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm Bảng 4.2 Phân biệt kiểu huyết chủng Vibrio cholerae O1 Kháng nguyên Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O1 Kháng huyết Inaba + Kháng huyết Ogawa - Dung dịch muối sinh lý Kết luận - Chủng Inaba - + - Chủng Ogawa + + - - - - Chủng Hikojima Chủng không đặc hiệu Kết Phát hay không phát Virbio cholerae 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng 16 ... cholerae non-O1 + + Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm Bảng 4.2 Phân biệt kiểu huyết chủng Vibrio cholerae O1 Kháng nguyên Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O1 Vibrio. .. tự Vibrio cholerae Chủng có kết sinh hoá tương tự Vibrio cholerae Chủng có kết sinh hoá tương tự Vibrio cholerae Kháng huyết Dung dịch muối Kết luận đa giá O1 sinh lý + Vibrio cholerae O1 - - Vibrio. .. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae .4 Tổng quan Vibrio cholerae Phạm vi áp dụng II Thử nghiệm sinh hóa qui trình định tính Vibrio Cholerae
