WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM KIM ANH NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM KIM ANH NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS Nguyễn Thị Thuận Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2014 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM LỜI CẢM ƠN Để đạt đƣợc kết nhƣ ngày hôm nay, xin cho phép gửi lời cảm ơn tới ngƣời hƣớng dẫn, giúp đỡ bên suốt thời gian thực khóa luận Với lòng biết ơn sâu sắc, xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Thị Thuận, giảng viên môn Hóa Dƣợc – trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn cho thực đề tài Cùng với tri thức tâm huyết mình, cô truyền đạt cho vốn kiến thức quý báu, lòng say mê công việc, tác phong làm việc nghiêm túc, khoa học Em xin cảm ơn cô! Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô anh chị kỹ thuật viên môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, anh chị khoa Vật lý đo lƣờng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành đƣợc khóa luận Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè nguồn cổ vũ tinh thần lớn lao, bên cạnh động viên, khích lệ suốt thời gian qua Hà Nội, 5/2014 Sinh viên Phạm Kim Anh WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM MỤC LỤC CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Trang Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Vài nét vitamin B1, B6, B12 1.1.1.1 Vitamin B1 (Thiamin) 1.1.1.2 Vitamin B6 (Pyridoxin) 1.1.1.3 Vitamin B12 (Cobalamin) 1.1.2 Một số chế phẩm chứa vitamin B1, B6, B12 thị trƣờng 1.1.3 Một số phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B đƣợc sử dụng 1.2 Cơ sở lý thuyết chung phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 1.2.1 Nguyên lý chung TLC 1.2.2 Pha tĩnh TLC 1.2.3 Pha động TLC 1.2.4 Các bƣớc tiến hành định lƣợng TLC 1.2.4.1 Chuẩn bị mỏng 1.2.4.2 Đƣa mẫu phân tích lên mỏng 1.2.4.3 Khai triển sắc ký với pha động phù hợp 1.2.4.4 Phát vết sắc ký đồ 1.2.5 Ứng dụng TLC 10 1.3 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) 10 1.4 Vài nét bán định lƣợng (Semiquantitative) 12 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 1.4.1 Khái niệm bán định lƣợng 12 1.4.2 Bán định lƣợng HPTLC với phần mềm VideoScan 12 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu, dung môi hóa chất dụng cụ 14 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.1.2 Dung môi, hóa chất, thuốc thử 15 2.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký điều kiện phát 16 2.2.2 Đánh giá phƣơng pháp 17 2.2.2.1 Tính chọn lọc – đặc hiệu 17 2.2.2.2 Đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính 17 2.2.2.3 Độ lặp lại 18 2.2.2.4 Độ 18 2.2.3 Ứng dụng phƣơng pháp số chế phẩm thuốc lƣu hành thị trƣờng 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 Chƣơng THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Chuẩn bị mẫu trắng, dung dịch chuẩn thử 21 3.1.1 Pha mẫu trắng dung dịch chuẩn gốc 21 3.1.2 Pha dung dịch chuẩn 21 3.1.3 Pha dung dịch thử 22 3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 22 3.2.1 Khảo sát thành phần pha động 22 3.2.2 Lựa chọn bƣớc sóng phát 24 3.2.3 Khảo sát thể tích dung dịch mẫu đƣa lên mỏng điều kiện sắc ký khác 24 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 26 3.3.1 Bán định lƣợng B1 B6 26 3.3.1.1 Độ đặc hiệu – chọn lọc 26 3.3.1.2 Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính 27 3.3.1.3 Độ lặp lại độ 29 3.3.2 Bán định lƣợng B12 32 3.3.2.1 Độ đặc hiệu – chọn lọc 32 3.3.2.2 Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính 33 3.3.2.3 Độ lặp lại độ 35 3.4 Ứng dụng bán định lƣợng vitamin số chế phẩm thuốc 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT AOAC : Hiệp hội nhà hoá phân tích thống (Association of Official Analytical Chemists) CT CPDP : Công ty cổ phần dƣợc phẩm CT TNHH : : Công ty trách nhiệm hữu hạn EtOH : Ethanol HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HPTLC : Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography) Pyridoxin HCl : Pyridoxin hydroclorid r : Hệ số tƣơng quan Rf : Hệ số lƣu giữ RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) Thiamin HCl : Thiamin hydroclorid TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) USP : Dƣợc điển Mỹ (United States Pharmacopoea) UV : Tử ngoại (Ultra Violet) VIS : Khả kiến (Visible) WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1: Các phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B thƣờng dùng ƣu nhƣợc điểm Bảng 1.2: So sánh số tham số TLC HPTLC 11 Bảng 2.1: Các chế phẩm đƣợc nghiên cứu khóa luận 14 Bảng 2.2: Các chế phẩm đƣợc áp dụng phƣơng pháp phân tích 15 Bảng 3.1: Kết phân tích vitamin B1, B6 dãy dung dịch chuẩn 28 Bảng 3.2: Kết khảo sát độ lặp lại – B1, B6 30 Bảng 3.3: Kết khảo sát độ – B1, B6 31 Bảng 3.4: Kết phân tích vitamin B12 dãy dung dịch chuẩn 34 Bảng 3.5: Kết khảo sát độ lặp lại – B12 36 Bảng 3.6: Kết khảo sát độ – B12 37 Bảng 3.7: Phần trăm hàm lƣợng vitamin chế phẩm so với nhãn 38 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1: Một hệ thống máy móc HPTLC 11 Hình 3.1: Sắc ký đồ triển khai pha động 23 Hình 3.2: Sắc ký đồ triển khai pha động 23 Hình 3.3: Vị trí chấm mẫu mỏng HPTLC silica gel 60 F254 kích thƣớc 20 x 10 cm 25 Hình 3.4: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B1, B6 soi dƣới đèn UV bƣớc sóng 366 nm 26 Hình 3.5: Sắc ký đồ vết đƣờng chuẩn B1 B6 thu đƣợc với phần mềm VideoScan 27 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn vitamin B1 28 Hình 3.7: Đƣờng chuẩn vitamin B6 29 Hình 3.8: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại độ B1 B6 bƣớc sóng 366 nm 30 Hình 3.9: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B12 quan sát dƣới ánh sáng khả kiến 32 Hình 3.10: Sắc ký đồ vết đƣờng chuẩn B12 thu đƣợc với phần mềm VideoScan 33 Hình 3.11: Đƣờng chuẩn vitamin B12 34 Hình 3.12: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại độ B12 ánh sáng khả kiến 35 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, thị trƣờng có nhiều loại thuốc chứa hỗn hợp vitamin, hay gặp dạng kết hợp vitamin nhóm B Theo thống kê từ danh mục thuốc đƣợc cấp số đăng ký Cục Quản lý Dƣợc Việt Nam, từ tháng 7/2009 đến tháng 1/2014 có gần 500 chế phẩm thuốc multivitamin đƣợc cấp số đăng ký lƣu hành thị trƣờng, khoảng 150 thuốc có thành phần kết hợp loại vitamin: B1, B6, B12 [2] Vitamin nhóm chất dễ bị phân hủy nhiều tác nhân lý hóa (nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, ion kim loại ) làm giảm hàm lƣợng thuốc theo thời gian điều kiện bảo quản Vì vậy, công tác kiểm tra chất lƣợng thuốc chứa vitamin nói riêng thuốc nói chung cần đƣợc quan tâm Các phƣơng pháp hay đƣợc dùng để định lƣợng hỗn hợp vitamin HPLC [3], quang phổ UV – VIS [4], [13] Phƣơng pháp TLC đƣợc sử dụng chủ yếu với mục đích định tính, thử tinh khiết Tuy nhiên, từ xuất HPTLC, kỹ thuật cải tiến TLC việc sử dụng HPTLC để định lƣợng/bán định lƣợng hoạt chất trở nên phổ biến Áp dụng kỹ thuật HPTLC để định lƣợng/bán định lƣợng vitamin hỗn hợp có số ƣu điểm nhƣ: tính đặc hiệu cao, đơn giản, dễ thực hiện, định lƣợng đƣợc đồng thời nhiều vitamin hỗn hợp, tiết kiệm thời gian, hóa chất Vì vậy, để đóng góp thêm phƣơng pháp kiểm tra sơ chất lƣợng thuốc hỗn hợp vitamin cho nhà sản xuất, kinh doanh thuốc, thực đề tài “Nghiên cứu bán định lƣợng số vitamin hỗn hợp phƣơng pháp HPTLC” với mục tiêu: Xây dựng phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B1, B6, B12 hỗn hợp HPTLC Đánh giá phƣơng pháp vừa xây dựng WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 29 Đƣờng chuẩn vitamin B6 Diện tích píc (mAU) 140000 y = 63984x + 21618 r = 0.980 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 Nồng độ (mg/ml) Hình 3.6: Đường chuẩn vitamin B6 - Kết cho thấy đƣờng chuẩn dung dịch vitamin B1 B6 tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát với hệ số tƣơng quan (r) lần lƣợt 0,995 0,980 Nhƣ vậy, khoảng nồng độ khảo sát phù hợp để bán định lƣợng vitamin B1, B6 hỗn hợp vitamin 3.3.1.3 Độ lặp lại độ - Thiết kế thí nghiệm mỏng (hình 3.7): Xây dựng đƣờng chuẩn: vết dung dịch chuẩn hỗn hợp (vết số – 5) Đánh giá độ lặp lại: vết dung dịch thử: T1 – T6 (vết số – 11) Đánh giá độ đúng: vết dung dịch thử có thêm chuẩn hỗn hợp theo tỷ lệ 1:1 thể tích: T1+C – T6+C (vết số 12 – 17) - Kết đƣợc thể hình 3.8 bảng 3.2: WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 30 Xây dựng đƣờng chuẩn Đánh giá độ lặp lại Đánh giá độ Hình 3.8: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại độ – B1, B6 bước sóng 366 nm Bảng 3.2: Kết khảo sát độ lặp lại – B1, B6 Vitamin B1 Vitamin B6 Mẫu Diện tích pic (mAU) Nồng độ(*) (mg/ml) Diện tích pic (mAU) Nồng độ(*) (mg/ml) T1 19075 0,4801 85516 1,0198 T2 21111 0,5109 87799 1,0446 T3 20943 0,5027 87333 1,0267 T4 20224 0,4805 87127 1,0034 T5 19231 0,4709 85922 1,0007 T6 19342 0,4986 87032 1,0734 TB RSD (%) 0,4906 1,0281 3,19 2,43 ( ) * : tính từ phương trình hồi qui hiệu chỉnh cho lượng cân WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 31 Nhận xét: độ lệch chuẩn tƣơng đối phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B1 = 3,19 ≈ 3; riêng áp dụng phân tích vitamin B6 có độ lặp lại cao với RSD = 2,43 < Nhƣ phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B1, B6 hỗn hợp HPTLC có độ lặp lại cao - Kết khảo sát độ phƣơng pháp đƣợc trình bày bảng 3.3: Bảng 3.3: Kết khảo sát độ – B1, B6 Vitamin B1 Mẫu Vitamin B6 Diện Nồng độ Độ Diện Nồng độ Độ tích pic chuẩn (C) đúng(**) tích pic chuẩn (C) đúng(**) (mAU) tìm lại (%) (mAU) tìm lại (%) (mg/ml) T1 + C 19655 0,4905 96,6 87807 1,0703 101,3 T2+ C 20223 0,4748 93,5 89706 1,0939 103,5 T3+ C 20460 0,4860 95,8 89830 1,1051 104,6 T4+ C 20043 0,4840 95,4 87826 1,0457 98,9 T5+ C 20631 0,5219 102,8 87248 1,0464 99,0 T6+ C 20289 0,5080 100,1 89558 1,1013 104,2 TB ( (mg/ml) 97,4 101,9 **): So với nồng độ thực biết chuẩn (hệ số thu hồi) Kết bảng cho thấy: WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 32 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM - Độ phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B1 nằm khoảng 93,5% đến 102,8% - Độ phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B6 nằm khoảng 98,9% đến 104,6% Nhƣ độ phƣơng pháp bán định lƣợng phân tích vitamin B1, B6 hỗn hợp nằm khoảng giới hạn 92 – 105%, độ chấp nhận AOAC phƣơng pháp định lƣợng khoảng nồng độ chất phân tích ≥ 1% (tƣơng ứng nồng độ ≥ 0,1 mg/ml) [9] 3.3.2 Bán định lƣợng B12 3.3.2.1 Độ đặc hiệu – chọn lọc Quan sát sắc ký đồ sau triển khai mỏng có vết: mẫu trắng, mẫu trắng có thêm B1, mẫu trắng có thêm B6, mẫu trắng có thêm B12 mẫu trắng có thêm B1, B6, B12 (là sắc ký đồ dùng để xác định độ đặc hiệu phƣơng pháp bán định lƣợng B1, B6) ánh sáng khả kiến (hình 3.9): Mẫu trắng Mẫu trắng có thêm vitamin B1 Mẫu trắng có thêm vitamin B6 Mẫu trắng có thêm vitamin B12 Mẫu trắng có thêm B1, B6, B12 B 12 Hình 3.9: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu - B12 quan sát ánh sáng khả kiến WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 33 Nhận xét: Trên sắc ký đồ xuất vết màu hồng B12 có Rf = 0,56 mẫu trắng thêm B12 mẫu trắng thêm vitamin, mẫu lại không xuất vết Vậy phƣơng pháp bán định lƣợng ánh sáng khả kiến chọn lọc với vitamin B12 3.3.2.2 Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính - Thiết lập đƣờng chuẩn: Chấm vết dung dịch chuẩn hỗn hợp với thể tích mẫu đƣa lên mỏng lần lƣợt từ – µl Sấy cho dung môi pha mẫu bay hết, sau tiến hành sắc ký điều kiện chọn - Hiện vết vitamin B12 ánh sáng khả kiến, xử lý ảnh chụp phần mềm VideoScan Kết đƣợc trình bày hình 3.10 bảng 3.4 B12 Hình 3.10: Sắc ký đồ vết đường chuẩn B12 thu với phần mềm VideoScan WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 34 Bảng 3.4: Kết phân tích vitamin B12 dãy dung dịch chuẩn Thể tích dd chuẩn Nồng độ tƣơng ứng (µl) (mg/ml) 0,0283 12440 0,0377 14561 0,0417 16570 0,0500 18850 0,0584 20610 Diện tích píc (mAU) - Thiết lập đƣờng chuẩn vitamin B12 dựa kết thu đƣợc (hình 3.11): Diện tích píc (mAU) Đƣờng chuẩn vitamin B12 25000 y = 281117x + 4456 r = 0.986 20000 15000 10000 5000 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 Nồng độ (mg/ml) Hình 3.11: Đường chuẩn vitamin B12 - Nhận xét: Kết cho thấy đƣờng chuẩn dung dịch vitamin B12 tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát với hệ số tƣơng quan r = 0,986 Nhƣ vậy, WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 35 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM khoảng nồng độ khảo sát phù hợp để bán định lƣợng vitamin B12 hỗn hợp vitamin 3.3.2.3 Độ lặp lại độ - Thiết kế thí nghiệm mỏng tƣơng tự nhƣ thí nghiệm xác định độ lặp lại độ phƣơng pháp B1 B6: Xây dựng đƣờng chuẩn: vết dung dịch chuẩn hỗn hợp (vết số – 5) Đánh giá độ lặp lại: vết dung dịch thử: T1’ – T6’ (vết số – 11) Đánh giá độ đúng: vết: T1’+C – T6’+C (vết số 12 – 17) - Hiện vết sắc ký đồ ánh sáng khả kiến xử lý kết (hình 3.11 bảng 3.5, bảng 3.6): Xây dựng đƣờng chuẩn Đánh giá độ lặp lại Đánh giá độ Hình 3.12: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại độ B12 ánh sáng khả kiến WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 36 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM Bảng 3.5: Kết khảo sát độ lặp lại – B12 Mẫu Diện tích pic (mAU) Nồng độ(*) (mg/ml) T1’ 14127 0,0321 T2’ 14640 0,0336 T3’ 13676 0,0318 T4’ 14214 0,0324 T5’ 14000 0,0295 T6’ 12275 0,0328 TB 0,0320 RSD (%) 4,34 ( ) * : tính từ phương trình hồi qui hiệu chỉnh cho lượng cân Nhận xét: - Phƣơng pháp bán định lƣợng áp dụng cho vitamin B12 có độ lặp lại trung bình với RSD = 4,34 < 10% WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 37 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM Bảng 3.6: Kết khảo sát độ – B12 Nồng độ chuẩn (C) (mAU) tìm lại (mg/ml) T1’ + C 15280 0,0426 102,2 T2’ + C 15343 0,0412 98,9 T3’ + C 14846 0,0411 98,6 T4’ + C 15268 0,0422 101,2 T5’ + C 14475 0,0373 89,5 T6’ + C 14432 0,0431 103,5 TB ( Độ đúng(**) (%) Diện tích pic Mẫu 99,0 **): So với nồng độ thực biết chuẩn (hệ số thu hồi) - Độ phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B12 nằm khoảng 89,5% đến 103,5% (so với độ chấp nhận AOAC cho phƣơng pháp định lƣợng từ 90 – 108% nồng độ chất phân tích ≥ 0,1%, tƣơng ứng nồng độ ≥ 0,01 mg/ml [9]) Nhƣ vậy, với B1, B6 B12, phƣơng pháp đề xuất đảm bảo độ chọn lọc độ xác cần thiết để bán định lƣợng thành phần chế phẩm Trên sở này, phƣơng pháp đƣợc áp dụng để khảo sát thêm vài chế phẩm mua đƣợc thị trƣờng 3.4 Ứng dụng bán định lƣợng vitamin số chế phẩm thuốc WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 38 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM - Kết bán định lƣợng vitamin chế phẩm đƣợc khảo sát thể bảng 3.7: Bảng 3.7: Phần trăm hàm lượng vitamin chế phẩm so với nhãn Chế phẩm Nebamin (viên nén bao đƣờng) Tervit – H (viên nén bao phim) Neurobion (thuốc tiêm) Thành Hàm lƣợng Hàm lƣợng phát % so với hàm phần nhãn lƣợng nhãn B1 50 mg 55,8336 mg 111,7 B6 250 mg 280,1075 mg 112,0 B12 250 µg 208 µg 83,2 B1 250 mg 258,8702 mg 103,6 B6 250 mg 269,5438 mg 107,8 B12 250 µg 223 µg 89,2 B1 100 mg/3ml 98,7014 mg/3ml 98,7 B6 100 mg/3ml 102,3583 mg/3ml 102,4 B12 5000 µg/3ml 4586 µg/3ml 91,7 - Qua khảo sát thấy phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B1, B6 B12 hỗn hợp áp dụng đƣợc cho chế phẩm thuốc 3B thị trƣờng có chứa loại vitamin (các chế phẩm khảo sát cho vết B1, B6 B12 sắc ký đồ tách rời không lẫn với vết tạp khác có chế phẩm), bán định lƣợng đƣợc đồng thời nhiều chế phẩm mỏng, cho phép tiết kiệm thời gian kinh phí thực WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 39 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM - Hàm lƣợng B12 tìm lại đƣợc chế phẩm thấp B12 dễ bị phân hủy nhiều tác nhân: ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, tác nhân hóa học điều kiện khí hậu nƣớc ta lại có nhiệt độ, độ ẩm cao Mặt khác hàm lƣợng chất thuốc thƣờng nhỏ, khoảng vài phần trăm so với vitamin B1 B6 Vì vậy, dù có biện pháp ngăn ngừa tác nhân có hại nhƣ dùng bao bì kín tránh ẩm ánh sáng, bao viên, lựa chọn tá dƣợc gây tƣơng tác vitamin (nhất B12) bị phân hủy làm giảm hàm lƣợng WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 40 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận: Trong khóa luận này, qua trình nghiên cứu thực nghiệm, hoàn thành đƣợc mục tiêu: Xây dựng phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B1, B6, B12 hỗn hợp HPTLC Đánh giá đƣợc phƣơng pháp vừa xây dựng: - Phƣơng pháp có độ chọn lọc cao với vitamin B1, B6, B12 - Đƣờng chuẩn tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát - Phƣơng pháp có độ xác tốt với độ đúng: 93,5% - 102,8% bán định lƣợng vitamin B1; 98,9% - 104,6% bán định lƣợng vitamin B6; 89,5% - 103,5% bán định lƣợng vitamin B12 độ lặp lại: RSD = 3,63% bán định lƣợng vitamin B1, RSD = 2,50% bán định lƣợng vitamin B6, RSD = 4,34% bán định lƣợng vitamin B12 Đề xuất: Do thời gian điều kiện có hạn nên khóa luận khảo sát mẫu thuốc chứa hỗn hợp vitamin B1, B6, B12, xin đề xuất: - Sử dụng phƣơng pháp xây dựng tiếp tục khảo sát chế phẩm thuốc multivitamin chứa loại vitamin dạng bào chế khác - Tiếp tục nghiên cứu, phát triển phƣơng pháp xây dựng để bán định lƣợng đồng thời vitamin khác (B2, B3, B9, C, A, D, E, ) hỗn hợp WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, Nhà xuất Y học, tập II, tr 47 – 233 Cục Quản lý Dƣợc Việt Nam (2014), Danh mục thuốc nước thuốc nước cấp số đăng ký cập nhật đến tháng 1/2014, Hà Nội Nguyễn Thị Song Hà (2003), Đánh giá chất lượng số chế phẩm vitamin nghiên cứu bào chế nâng cao độ ổn định viên chứa vitamin: B1, B6, B12, Luận án Tiến sĩ Dƣợc học, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Hội đồng Dƣợc Điển Việt Nam (2010), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Trần Tích, Trần Tử An, Nguyễn Văn Tuyền, Tống Thanh Vƣợng (2004), “Định lƣợng vitamin B1, B2, B6, PP chế phẩm thuốc tiêm Bencozym phƣơng pháp điện di mao quản”, Tạp chí Dược học, số 5, tr 20 – 22 Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, Nhà xuất Y học, tập II, tr 333 – 337 Viện Kiểm nghiệm An Toàn Vệ sinh Thực Phẩm Quốc Gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Tiếng Anh: Anderson, D (2007), Dorland's Illustrated Medical Dictionary, 31 edition, Elsevier Science Ltd, United Kingdom WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM AOAC International (2013), AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods or Dietary Supplements and Botanicals, USA 10 Chinese Pharmacopoeia Commission (2009), TLC Atlas of Chinese Crude Drugs in Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, People’s Medica Publishing, Beijing 11 European Medicines Agency (2009), Guideline on bioanalytical method validation, London 12 Hội đồng dƣợc điển Anh (2010), BP 2010, Vol III, 3175 – 3178 13 Hội đồng dƣợc điển Mỹ (2005), USP 28, 178 - 1908 14 ManMohan Srivastava (2011), High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), Dayalbagh Educational Institute, 43 – 45 15 Neeraj Kaul, Himani Agrawal, Bharat Patil, Abhijit Kakad, Dhaneshwar S.R (2005), Application of stability – indicating HPTLC method for quantitative determination of metadoxine in pharmaceutical dosage form, Il Farmaco, 60(4), 352 16 Panahi, H.A.; Kalal, H.S.; Rahimi, A.; Moniri, E (2010), “Isolation and quantitative analysis of B1, B2, B6 and B12 vitamins using high – performance thin layer chromatography”, Pharmaceutical Chemistry Journal, 45(8), 125 17 Ponder, E.L.; Fried, B.; Sherma, J (2004), “Thin – layer chromatographic analysis of hydrophilic vitamins in standards and from Helisoma trivolvis snails”, Acta chromatographica, 14(6), 70 – 81 18 Riley, C.M.; Fell, A.F (1996), Development and Validation of analytical methods, Elsevier Science Ltd, 97 – 289 19 Sherma, J.; Fried, B (2003), Handbook of Thin – Layer Chromatography, edition, Marcel Dekker, Inc., New York WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 20 Tippkotter, N et al (2009), “A semi – quantitative dipstick assay for microcystin”, Anal Bioanal Chem, 394(8), 863 – 869 21 US Department of Health and Human Services, CDER, FDA, CVM (2013), Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, Biopharmaceutics, USA WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON ... đề tài Nghiên cứu bán định lƣợng số vitamin hỗn hợp phƣơng pháp HPTLC với mục tiêu: Xây dựng phƣơng pháp bán định lƣợng vitamin B1, B6, B12 hỗn hợp HPTLC Đánh giá phƣơng pháp vừa xây dựng WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON... niệm bán định lƣợng - Bán định lƣợng xác định cách gần hàm lƣợng chất, kết bán định lƣợng rơi vào khoảng kết định lƣợng kết định tính [8] - Phân tích bán định lƣợng tƣơng tự nhƣ phân tích định. .. để định lƣợng /bán định lƣợng hoạt chất trở nên phổ biến Áp dụng kỹ thuật HPTLC để định lƣợng /bán định lƣợng vitamin hỗn hợp có số ƣu điểm nhƣ: tính đặc hiệu cao, đơn giản, dễ thực hiện, định lƣợng