BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHAN THỊ TÚ UYÊN Mã sinh viên 1201689 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CYANID TRONG THỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI-2017 TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHAN THỊ TÚ UYÊN MÃ SINH VIÊN 1201689 XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CYANID TRONG THUỶ SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Trần Nguyên Hà TS Trần Cao Sơn Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn vô chân thành sâu sắc tới TS Trần Nguyên Hà TS Trần Cao Sơn ngƣời thầy dìu dắt từ ngày làm nghiên cứu khoa học ngƣời trực tiếp định hƣớng, tận tình bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, anh chị Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật - Hà Nội, đặc biệt cán khoa Độc học - Dị nguyên tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ thời gian vừa qua Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, môn, phòng ban, thầy cô giáo cán nhân viên trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội - ngƣời dạy bảo giúp đỡ suốt năm học tập trƣờng Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em dành cho lời động viên quý báu suốt thời gian hoàn thành khoá luận Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất tình cảm, quan tâm giúp đỡ thầy cô, gia đình bạn bè dành cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 16 tháng 03 năm 2017 Sinh viên Phan Thị Tú Uyên MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Thực trạng ô nhiễm môi trƣờng biển nƣớc thải công nghiệp luyện kim 1.2 Tổng quan cyanid 1.2.1 Các dạng tồn cyanid 1.2.2 Tính chất hóa học cyanid 1.2.3 Nguồn phát sinh cyanid 1.2.4 Độc tính cyanid 1.2.5 Ảnh hƣởng cyanid môi trƣờng biển 1.3 Các phƣơng pháp xác định cyanid 1.3.1 Phƣơng pháp truyền thống 1.3.2 Cảm biến sinh học 10 1.3.3 Phƣơng pháp đo huỳnh quang 11 1.3.4 Phƣơng pháp sắc ký 12 1.4 Tổng quan sắc ký lỏng hiệu cao 14 1.4.1 Nguyên tắc 14 1.4.2 Máy HPLC 15 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 17 2.2 Nguyên vật liệu- trang thiết bị 17 2.2.1 Nguyên vật liệu 17 2.2.2 Dụng cụ 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.3.1 Khảo sát điều kiện để xây dựng phƣơng pháp xác định cyanid hải sản HPLC 19 2.3.2 Thẩm định phƣơng pháp xây dựng 20 2.3.3 Ứng dụng phƣơng pháp 20 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phƣơng pháp thu thập bảo quản mẫu 20 2.4.2 Phƣơng pháp HPLC 20 2.4.3 Phƣơng pháp xử lý mẫu 21 2.4.4 Thẩm định phƣơng pháp 22 2.4.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 25 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Khảo sát phƣơng pháp phân tích cyanid 26 3.1.1 Thiết lập điều kiện sắc ký 26 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 29 3.2 Thẩm định phƣơng pháp 33 3.2.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 33 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống 34 3.2.3 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 35 3.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 35 3.2.5 Độ lặp lại độ thu hồi 37 3.3 Ứng dụng phƣơng pháp 40 3.4 Bàn luận 40 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị 41 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội cộng đồng phân tích thức (Association of Official Analytical Communities) APHA Tổ chức sức khoẻ cộng đồng Mỹ (American Public Health Association) ATSRD Hiệp hội đăng kí chất độc hại bệnh dịch (Agency for Toxic Substances and Disease Registry) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm LCt50 Nồng độ sản phẩm thời gian gây chết 50% nhóm cá thể tham gia nghiên cứu (Lethal concentration-time, 50%) LD50 Liều gây chết 50% cá thể tham gia nghiên cứu (Lethal Dose, 50%) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantification) MeOH Methanol pKa Hằng số điện ly acid R Hệ số hồi quy tuyến tính RSD (%) Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) TB Trung bình UV Tử ngoại (Ultraviolet) QCVN Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC Hình 2.1 Bộ chƣng cất hồi lƣu cyanid Hình 3.1 Sắc ký đồ chƣơng trình gradient Hình 3.2 Sắc ký đồ chƣơng trình gradient Hình 3.3 Sắc ký đồ theo chế độ dung môi đẳng dòng Hình 3.4 Kết khảo sát thể tích dung dịch MgCl2 Hình 3.5 Kết khảo sát thể tích CuSO4 thêm vào Hình 3.6 Khảo sát thời gian chƣng cất Hình 3.7 Sơ đồ xử lý mẫu Hình 3.8 Sắc đồ cyanid mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu cá thêm chuẩn nồng độ 0,02 µg/mL (tƣơng ứng 0,1 mg/kg) Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu mực thêm chuẩn nồng độ 0,02 µg/mL (tƣơng ứng 0,1 mg/kg) Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu tôm thêm chuẩn nồng độ 0,02 µg/mL (tƣơng ứng 0,1 mg/kg) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lƣợng cyanid tự số thực vật Bảng 3.1 Chƣơng trình gradient Bảng 3.2 Chƣơng trình gradient Bảng 3.3 Kết khảo sát lựa chọn acid Bảng 3.4 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống Bảng 3.5 Số liệu xây dựng đƣờng chuẩn cyanid Bảng 3.6 Giá trị LOD LOQ phƣơng pháp với mẫu khác Bảng 3.7 Kết tính độ lặp lại độ thu hồi cá Bảng 3.8 Kết tính độ lặp lại độ thu hồi mực Bảng 3.9 Kết tính độ lặp lại độ thu hồi tôm ĐẶT VẤN ĐỀ Ô nhiễm môi trƣờng biển vấn đề nóng bỏng nhân loại Trong năm 2016 Việt Nam phải gánh chịu tổn thất nặng nề ô nhiễm môi trƣờng biển gây mà nguyên nhân nƣớc thải từ nhà máy sản xuất gang thép Nƣớc thải công nghiệp đặc biệt ngành công nghiệp nặng nhƣ luyện kim, khí thƣờng chứa nhiều hóa chất độc hại dầu bôi trơn, thƣờng không đƣợc tái sử dụng mà qua xử lý thải môi trƣờng Nếu trình xử lý không đảm bảo gây hậu nghiêm trọng kinh tế lẫn môi trƣờng Cyanid hợp chất có độc tính cao ngƣời loài sinh vật khác có mặt thành phần nƣớc thải từ công nghiệp luyện kim Môi trƣờng sống chứa lƣợng cyanid vƣợt ngƣỡng cho phép làm thủy sản nhiễm độc Nguồn thực phẩm không đảm bảo để lại hậu đáng tiếc đến tay ngƣời tiêu dùng Tuy nhiên giới nhƣ Việt Nam lại chƣa giám sát hàm lƣợng cyanid thủy sản chƣa có ngƣỡng giới hạn nồng độ cyanid thủy sản Ở Việt Nam có quy định hàm lƣợng cyanid cho phép nƣớc ăn uống 0,07 mg/L (theo QCVN 6-1 Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia nƣớc khoáng thiên nhiên nƣớc đóng chai) [3] Do khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp Dƣợc sĩ, đề tài “Xác định hàm lượng cyanid thủy sản phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” đƣợc thực với mục tiêu sau đây:  Xây dựng thẩm định phƣơng pháp xác định hàm lƣợng cyanid thủy sản  Ứng dụng phƣơng pháp việc xác định hàm lƣợng cyanid thủy sản vùng biển số tỉnh miền Trung - Thể tích tiêm : 20 L - Bƣớc sóng kích thích 340 nm, bƣớc sóng phát 370 nm 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Các khảo sát đƣợc tiến hành cho kết nhƣ sau:  Kết khảo sát loại acid dùng để acid hóa (HCl/ H2SO4) Tiến hành: cân 10 g mẫu trắng đồng nhất, thêm mL chuẩn cyanid 10 µg/mL tƣơng ứng mg/kg trộn cho vào bình chƣng cất Tiến hành lần lƣợt với 20 mL HCl 6M H2SO4 50% thêm vào bình chƣng cất Thực theo quy trình trình bày mục 2.4.3 Kết khảo sát chọn loại acid đƣợc đƣa bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết khảo sát lựa chọn acid Hàm lƣợng cyanid (mg/kg) STT H2SO4 50% Hiệu suất (%) HCl 6M Hiệu suất (%) Mẫu 1,287 64,4 1,698 84,9 Mẫu 1,608 80,4 1,754 87,7 Mẫu 1,415 70,7 1.802 90,1 Từ kết đƣa bảng 3.3 cho thấy thêm dung dịch H2SO4 50% vào bình chƣng cất hiệu suất thu hồi thấp không ổn định sử dụng dung dịch HCl 6M Nguyên nhân dung dịch H2SO4 50% vào bình chƣng cất sinh nhiệt làm tăng nhiệt độ dịch cất khiến cyanid bay hơi, không hấp thụ hoàn toàn đƣợc vào dung dịch NaOH Vì chọn chọn HCl 6M để thêm vào chƣng cất  Kết khảo sát thể tích dung dịch MgCl2 Tiến hành: cân 10 g mẫu trắng cho vào bình chƣng cất, thêm mL dung dịch chuẩn cyanid 10 µg/mL thêm vào lần lƣợt mL, mL, mL, mL, mL dung dịch MgCl2 510 mg/L Thực theo quy trình trình bày mục 2.4.3 29 Kết khảo sát lƣợng dd MgCl2 đƣợc đƣa hình 3.4 Hàm lượng cyanide (mg/kg) 90.6 Hiệu suất (%) 90.3 89.05 85.95 84.25 1.685 1.812 1.781 1.806 1.719 mL mL mL mL mL Hình 3.4 Kết khảo sát thể tích dung dịch MgCl2 Từ kết đƣa hình 3.4 cho thấy thêm mL MgCl2 vào bình chƣng cất hiệu suất thu hồi cao Khi tăng thêm lƣợng MgCl2 vào hiệu suất thu hồi không đáng kể Nguyên nhân MgCl2 chất xúc tác phản ứng cần lƣợng đủ dƣ để phản ứng xảy hoàn toàn Vì nhóm nghiên cứu chọn thêm vào chƣng cất mL dd MgCl2  Khảo sát lƣợng CuSO4 thêm vào Tiến hành: cân 10 g mẫu trắng cho vào bình chƣng cất thêm mL dung dịch chuẩn cyanid 10 µg/mL, thêm vào lần lƣợt mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL CuSO4 Thực quy trình nhƣ trình bày mục 2.4.3 Kết khảo sát lƣợng dd CuSO4 đƣợc đƣa hình 3.5 30 100 90 91.25 80.15 85.2 83.25 80 70 60 50 Hàm lượng cyanide (mg/kg) 40 Hiệu suất (%) 30 20 10 1.603 1.665 1.704 1.825 mL 10 mL 15 mL 20 mL Hình 3.5 Kết khảo sát thể tích CuSO4 thêm vào Nhƣ thấy với thể tích CuSO4 cho vào 20 mL cho hiệu suất thu chƣng cất cao Vì chọn thể tích CuSO4 thêm vào 20 mL tối ƣu  Khảo sát thời gian chƣng cất Tiến hành: cân 10g mẫu trắng cho vào bình chƣng cất thêm mL dung dịch chuẩn cyanid 10 µg/mL tiến hành nhƣ quy trình trình bày mục 2.4.3 với thời gian chƣng cất lần lƣợt 25, 30, 35, 40, 45 phút Kết khảo sát thời gian chƣng cất đƣợc đƣa hình 3.6 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 25 phút 30 phút 35 phút 40 phút 45 phút Hàm lượng cyanide mg/kg 1.463 1.799 1.764 1.718 1.801 Hiệu suất % 73.15 89.95 88.2 85.9 90.05 Hình 3.6 Khảo sát thời gian chưng cất 31 Từ kết đƣa hình 3.6 cho thấy thời gian chƣng cất 30 phút tối ƣu Tuy thời gian chƣng cất 45 phút hiệu suất cao nhƣng không đáng kể mà thời gian chƣng cất lại nhiều 1,5 lần Vì chọn thời gian chƣng cất 30 phút tối ƣu Từ kết tối ƣu điều kiện phân tích, quy trình phân tích hàm lƣợng cyanid hải sản hoàn chỉnh đƣợc đƣa nhƣ sau: 20 mL HCl 6M Hình 3.7 Sơ đồ xử lý mẫu 32 3.2 Thẩm định phƣơng pháp 3.2.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc Chuẩn bị mẫu trắng cá, tôm, mực; mẫu trắng thêm chuẩn mẫu chuẩn pha dung môi phân tích nồng độ 0,05 µg/mL, xử lý mẫu theo sơ đồ 3.7 thu đƣợc sắc ký đồ nhƣ hình 3.8 Nền cá Nền mực Nền tôm a Mẫu trắng 10.00 8.00 8.00 8.00 6.00 6.00 6.00 4.00 4.00 4.00 EU EU 10.00 EU 10.00 2.00 2.00 0.00 0.00 0.00 -2.00 -2.00 -2.00 -4.00 -4.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 2.00 -4.00 0.00 2.00 4.00 Minutes 6.00 8.00 10.00 12.00 0.00 2.00 4.00 Minutes 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes b Mẫu chuẩn 7.903 8.231 100.00 45.00 90.00 7.778 40.00 110.00 35.00 40.00 30.00 80.00 35.00 70.00 25.00 30.00 25.00 EU EU EU 60.00 20.00 50.00 20.00 15.00 40.00 15.00 30.00 10.00 10.00 20.00 5.00 5.00 10.00 0.00 0.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 0.00 2.00 4.00 6.00 Minutes c Mẫu thêm chuẩn 33 8.00 10.00 12.00 45.00 7.688 8.137 7.903 35.00 30.00 30.00 40.00 25.00 25.00 35.00 20.00 30.00 25.00 EU EU EU 20.00 15.00 15.00 20.00 10.00 15.00 10.00 10.00 5.00 5.00 5.00 0.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 0.00 2.00 4.00 Minutes Minutes 6.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Hình 3.8 Sắc đồ cyanid mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn Sắc đồ đƣa hình 3.8 cho thấy mẫu trắng tín hiệu thời gian lƣu chất phân tích Thời gian lƣu của: Mẫu cá: chuẩn (8,231 phút) mẫu thêm chuẩn (8,237 phút) Mẫu mực: chuẩn (7,903 phút) mẫu thêm chuẩn (7,903 phút) Mẫu tôm: chuẩn (7,778 phút) mẫu thêm chuẩn (7,688 phút) Kết luận: thời gian lƣu không chênh lệch 5% phƣơng pháp có tính đặc hiệu cao, thích hợp phân tích hàm lƣợng cyanid mẫu thủy sản 3.2.2 Tính thích hợp hệ thống Tiêm lần dung dịch chuẩn cyanid dẫn xuất với OPA taurin vào máy HPLC Kết phân tích (Bảng 3.4) cho thấy độ lặp lại tốt với peak cyanid thời gian lƣu Bảng 3.4 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống STT Thời gian lƣu 7,909 7,903 7,778 7,903 7,688 8,037 TB 7,870 RSD(%) 1,537 RSD(%) < phƣơng pháp thích hợp để phân tích cyanid 34 3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn Dãy chuẩn đƣợc pha mẫu trắng xử lý theo sơ đồ hình 3.7, chỉnh pH NaOH HCl M Pha dãy chuẩn làm việc nồng độ 0,1; 0,2; 0,4; µg/mL phân tích máy HPLC Xây dựng đƣờng phụ thuộc diện tích peak nồng độ tƣơng ứng Bảng 3.5 Số liệu xây dựng đường chuẩn cyanid Diện tích píc (cps) Nồng độ tính lại (µg/mL) Bias (%) 0,1 1103910 0,109028 9,027859 0,2 2163822 0,185221 -7,3897 Nồng độ (µg/mL) Đƣờng chuẩn 30000000 y = 1E+07x - 412769 R² = 0.999 25000000 20000000 15000000 10000000 0,4 4879515 0,380441 -4,88983 14064961 1,040745 4,074489 5000000 0 27194390 1,984566 0.5 1.5 -0,7717 Kết cho cho thấy khoảng nồng độ tín hiệu cyanid tỷ lệ tuyến tính với nồng độ với R2> 0,99 với độ chệch