BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LÊ MÃ SINH VIÊN: 1201310 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG RUBIADIN TRONG DƯỢC LIỆU BA KÍCH BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LÊ MÃ SINH VIÊN: 1201310 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG RUBIADIN TRONG DƯỢC LIỆU BA KÍCH BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.TS.Lê Thị Kim Vân 2.ThS.Tống Thị Thanh Vượng Nơi thực hiện: 1.Viện Dược liệu 2.Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài“Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rubiadin dược liệu Ba kích HPLC”, làm việc nghiêm túc, nỗ lực thân, em nhận nhiều giúp đỡ từ phía trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu, thầy cô, gia đình bạn bè Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Viện Dược liệu tạo nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS.Tống Thị Thanh Vượng – GV Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Thị Kim Vân – Khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược liệu, người tận tình hướng dẫn em trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến anh chị khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược liệu hỗ trợ em trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt thầy cô trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ em trình học tập, nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2017 Nguyễn Thị Lê MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU BA KÍCH 1.1 Ba kích 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Mô tả .2 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Nơi sống thu hái 1.1.5 Thành phần hóa học 1.1.6 Tác dụng dược lý 1.2 Tình hình nghiên cứu đánh giá Dược liệu Ba kích 1.2.1 Tiêu chuẩn Dược điển .8 1.2.2 Tại Việt Nam 11 1.2.3 Trên giới 11 1.3 Rubiadin .13 1.3.1 Công thức cấu tạo 13 1.3.2 Tác dụng dược lý 13 1.3.3 Sự phân bố rubiadin chi Morinda 14 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất 16 2.3 Nội dung nghiên cứu 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu .17 2.4.1 Định tính nhóm chất hóa học 17 2.4.2 Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần Ba kích phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 20 2.4.3 2.5 Xác định hàm lượng rubiadin phương pháp HPLC .21 Phương pháp xử lý số liệu 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Xác định có mặt số nhóm chất Ba kích số hoạt chất nhóm anthranoid 27 3.1.1 Kết xác định số nhóm chất phản ứng hóa học .27 3.1.2 Xác định có mặt số hoạt chất nhóm anthranoid TLC 28 3.2 Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần Ba kích 30 3.2.1 Chuẩn bị dung dịch sắc ký 30 3.2.2 Xây dựng đường chuẩn 30 3.2.3 Xác định hàm lượng anthranoid toàn phần 31 3.3 Xác định hàm lượng rubiadin Ba kích HPLC 31 3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký chuẩn bị dung dịch sắc ký .31 3.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng rubiadin Ba kích theo AOAC 36 3.3.3 3.4 Xác định hàm lượng Rubiadin Ba kích .42 Bàn luận .43 3.4.1 Mẫu nghiên cứu 43 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 44 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT PHầN VIếT TắT ACN AOAC PHầN VIếT ĐầY Đủ Acetonitril Hiệp hội nhà hóa học phân tích (Association of analytical chemists) BHC Benzene hexachloride (C6H6C6) DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) DDT Dichloro diphenyl trichlorothane (C14H9C15) EtOH Ethanol HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High-Performance Liquid Chromatography) HSCCC Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (High speed countercurrent chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) 10 LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Qualification) 11 MeOH Methanol 12 ELSD Tán xạ bay 13 RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relactive Standard Deviation) 14 SKĐ Sắc ký đồ 15 S/N Tín hiệu/nhiễu đường (Signal/Noise) 16 STT Số thứ tự 17 TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) 18 TT 19 UV-VIS Thuốc thử Phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Kết định tính số nhóm chất Ba kích 27 3.2 Gia trị Rf chất chuẩn 29 3.3 Độ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn rubiadin 30 3.4 Hàm lượng anthranoid toàn phần mẫu thử tính theo 31 rubiadin 3.5 So sánh hàm lượng rubiadin chiết nồng độ EtOH khác 31 3.6 So sánh hàm lượng rubiadin chiết thời gian khác 32 3.7 Kết khảo sát hệ pha động 35 3.8 Thời gian lưu mẫu chuẩn mẫu thử 37 3.9 Kết khảo sát độ thích hợp hệ thống sắc ký 38 3.10 Kết khảo sát độ lặp lại 39 3.11 Diện tích pic dãy dung dịch chuẩn 39 3.12 Kết xác định khả thu hồi phương pháp 41 3.13 Kết giá trị LOD, LOQ 42 3.14 Kết định lượng rubiadin mẫu thử 43 3.15 Tỉ lệrubiadin so với anthranoid toàn phần tính theo chuẩn rubiadin 43 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ STT Tên ảnh, đồ thị Trang 3.1 Sắc ký mỏng sau khai triển 29 3.2 Đồ thị tương quan nồng độ chuẩn rubiadin độ hấp thụ 30 3.3 SKĐ rubiadin chuẩn với pha động MeOH:H3PO4 0,1% (85:15) 33 3.4 SKĐ rubiadin chuẩn với pha động MeOH:H3PO4 0,1% (80:20) 33 3.5 SKĐrubiadin chuẩn pha loãng trog dịch chiết dược liệu với pha 34 động MeOH:H3PO4 0,1% (70:30) 3.6 SKĐ rubiadin chuẩn pha loãng trog dịch chiết dược liệu với pha 34 động MeOH:ACN:H3PO4 0,1% (42,5:42,5:15) 3.7 SKĐ rubiadin chuẩn với pha động MeOH:ACN:H3PO4 0,1% 35 (56,7:26,3:15) 3.8 SKĐ mẫu thử với pha động MeOH:ACN:H3PO4 0,1% 35 (56,7:26,3:15) 3.9 Hình ảnh chồng phổ sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử 36 3.10 SKĐ rubiadin chuẩn 37 3.11 SKĐ rubiadin mẫu thử 37 3.12 Đồ thị tương quan diện tích pic nồng độ 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Ba kích loại dược liệu quý y học cổ truyền Rễ Ba kích sử dụng rộng rãi với mục đích ôn thận, tráng dương, kiện cân cốt, khử phong hàn thấp Nhiều nghiên cứu tác dụng dược lý dịch chiết rễ Ba kích tiến hành, chứng minh tác dụng chống viêm, chống loãng xương, điều hòa đường huyết, giảm huyết áp Ở Việt Nam, Ba kíchphân bố rộng rãi tỉnh phía Bắc, đặc biệt Quảng Ninh Trong năm gần đây, Quảng Ninh chủ trương phát triển Ba kích trở thành dược liệu đặc trưng tỉnh: mở rộng khu vực trồng Ba kích phát triển thương phẩm Ba kích Tuy nhiên thị trường dược liệu, Ba kích có nhiều nguồn như: Ba kích nhập từ Trung Quốc, Ba kích Quảng Ninh, Ba kích Bắc Cạn , khó để kiểm soát chất lượng dược liệu Với mong muốn tìm hiểu chất lượng dược liệu Ba kích, tiến hành đề tài: “Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rubiadin dược liệu Ba kích HPLC” Đề tài thực với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng rubiadin Ba kích - Sơ xác định hàm lượng anthranoid toàn phần hàm lượng rubiadin Ba kích - So sánh hàm lượng rubiadin so với anthranoid toàn phần rubiadin Ba kích Quảng Ninh so với mẫu Ba kích khác thị trường CHƯƠNG I: TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU BA KÍCH 1.1 Ba kích 1.1.1 Tên khoa học - Morinda officinalis How.,họ Cà Phê Rubiaceae [3][4][6] - Tên khác: Ba kích thiên, dây ruột gà, chồi hoàng kim, sáy cày[3][4][6] 1.1.2 Mô tả Ba kích loại thân thảo, sống lâu năm, leo thân quấn, dài hàng mét Thân non màu tím, có lông, sau nhẵn Cành non có cạnh, mọc đối, hình mác bầu dục, thuôn nhọn, dày cứng, cuống ngắn, lúc non có lông dày mặt dưới, màu xanh lục, sau già lông có màu trắng mốc; kèm mỏng, ôm sát vào thân Hoa nhỏ, màu trắng sau vàng, tập trung thành tán đầu cành; đài hoa hình chén hay hình ống gồm đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa hàn liền phía thành ống ngắn, nhị 4, bầu hạ Quả hình cầu, rời dính liền thành khối, chín màu đỏ, mang đài lại đỉnh Mùa hoa: tháng 5-6 Mùa quả: tháng 7-10 [3][4][6] 1.1.3 Bộ phận dùng Bộ phận dùng: Rễ phơi sấy khô (Radix morindae) [3][4][6] Đặc điểm: Rễ cong queo Thịt đứt thành đoạn, để lộ lõi nhỏ bên trong, vỏ màu hồng nhạt, thịt màu hồng hay tím, mặt vỏ có nhiều vân dọc Cắt ngang thấy lớp vỏ mỏng, dính chặt vào thịt, thịt dày, có lõi lõi sắn Lớp gỗ rắn chắc, màu vàng nâu vàng trắng, đường kính 1-5mm [3][4][6] 1.1.4 Nơi sống thu hái Mọc hoang ven rừng thứ sinh trung du miền núi Gặp nhiều Quảng Ninh, Hà Tây, Ninh Bình, Vĩnh Phúc, Lạng Sơn, Hà Giang, Hòa Bình Có nhiều nơi Quảng Ninh, Hà Tây, Vĩnh Phúc trồng để đảm bảo nhu cầu nước [3][4][6] Nồng độ (µg/ml)) 1,700 1,360 0,919 0,527 0,136 Diệnn tích pic (mAU.s) 108873 89725 56298 33229 10458 ĐỒ THỊ DIỆN TÍCH PIC 120000 y = 64034x + 267.1 R² = 0.997 100000 80000 60000 40000 20000 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 NỒNG ĐỘ Hình 3.12: Đồ thị tương quan diệnn tích pic nnồng độ Nhận xét:Đường ng thẳng biểu diễn mối quan hệ tuyếnn tính gi nồng độrubiadin diệnn tích pic y = 64034x + 267,18 Như v khoảng ng kh khảo sát diện tích pic nồng độrubiadin rubiadin có mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ vớii R R=0,999 e Độ củaa phương pháp Dung dịch thử: Chuẩn Chu bị mục 2.4.3 Dung dịch thử thêm chuẩn: chu Cân xác 1,5g bột dược ợc li liệu vào bình định mức, c, thêm 50ml dung dịch d gồm: dung dịch chuẩnrubiadin cho lư lượng rubiadin thêm vào ng 30% lượng lư rubiadin mẫu thử EtOH 96o vừa đủ, tiến hành chuẩn bị mẫuu theo bước bư mực 2.4.3, khai triển sắc ký Kếết ghi bảng 3.12 40 Bảng 3.12: Kết xác định khả thu hồi phương pháp STT Lượng Lượng Lượng Lượng Độ thu rubiadin rubiadin rubiadin rubiadin hồi (%) thêm thu mẫu tìm lại (µg) (µg) thử (µg) (µg) 0 54,906 54,891 0 17 72,722 55,890 16,832 99,01 17 72,183 55,038 17,146 100,96 17 73,197 55,967 17,230 101,35 17 72,397 55,462 16,935 99,62 17 73,662 56,413 17,249 101,46 Trung bình (%) 100,48 RSD (%) 1,10 Nhận xét: Từ kết cho thấy khả tìm lại chất chuẩn nằm khoảng 98,0% đến 102% đáp ứng yêu cầu độ phương pháp phân tích giá trị RSD