BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU MÃ SINH VIÊN: 1201588 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHENOL TRONG THỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU MÃ SINH VIÊN: 1201588 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHENOL TRONG THỦY SẢN BẰNG SẮC KHÍ KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Trần Nguyên Hà TS Trần Cao Sơn Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trần Nguyên Hà TS Trần Cao Sơn người thầy dìu dắt từ ngày đầu làm nghiên cứu khoa học người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, giúp đỡ hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, anh chị Khoa Độc học dị nguyên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thời gian vừa qua Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng ban, Bộ môn Hóa phân tích độc chất, thầy cô giáo cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - người dạy bảo tận tình giúp đỡ suốt năm học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em bên cạnh giúp đỡ, động viên để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tốt Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Lê Thị Thu i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phenol 1.1.1 Giới thiệu chung phenol 1.1.2 Tính chất hóa lý phenol 1.2 Nguồn gốc, độc tính phenol 1.3 Độc tính phenol thủy sản 1.3.1 Ảnh hưởng phenol thủy sản 1.3.2 Một số khuyến cáo liều lượng cho phép phenol 1.4 Một số phương pháp xác định hợp chất phenol 10 1.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 10 1.4.2 Phương pháp phân tích hợp chất phenol 12 1.5 Giới thiệu sắc ký khí khối phổ 15 1.5.1 Sắc ký khí 15 1.5.2 Detector khối phổ sắc ký khí 15 1.5.3 Một số phương pháp xác định hợp chất phenol GCMS 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 ii 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 18 2.2.1 Nguyên vật liệu 18 2.2.2 Trang thiết bị 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.3.1 Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách phenol thủy sản 20 2.3.2 Khảo sát xây dựng điều kiện phân tích phenol GCMS/MS 20 2.3.3 Thẩm định phương pháp 21 2.3.4 Đánh giá hàm lượng phenol số mẫu thủy sản 21 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu xử lý mẫu sơ 21 2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu 22 2.4.3 Phương pháp sắc ký khí - khối phổ hai lần (GC-MS/MS) 22 2.4.4 Thẩm định phương pháp phân tích GC-MS/MS 23 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 26 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Tối ưu hóa điều kiện tách xác định phenol GC-MS/MS 27 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện MS 27 3.1.2 Tối ưu điều kiện sắc ký khí 28 3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 29 iii 3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện cất kéo nước 32 3.2.3 Điều kiện làm phenol 33 3.3 Thẩm định phương pháp 38 3.3.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 38 3.3.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 40 3.3.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 41 3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 42 3.4 Kết xác định phenol số mẫu thủy sản 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 Kết luận 46 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU KHAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 51 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa phân tích Chemists thức BSTFA Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide Bis(trimethylsilyl)trifluoroaceta mid ECD Electron-Capture Detector Detector cộng kết điện tử EFSA European Food Safety Authority Ủy ban an toàn thực phẩm Châu Âu EPA Environmental Protection Agency Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ FID Flame Ionization Detector Detector ion hóa lửa PFB Pentafluorobenzyl Bromide Pentafluorobenzyl bromid GC Gas Chromatography Sắc ký khí LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng LLE Liquid - liquid Extraction Chiết lỏng - lỏng LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiên LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng MRM Mutiple Reaction Monitoring Giám sát đa phản ứng MTBFTSA N-(tert-butyldimethylsilyl)-N- N-(tert-butyldimethylsilyl)-N- methyltrifluoroacetamide metyltrifluoroacetamid MS Mass Spectrometry Khổi phổ S/N Signal to Noise Tín hiệu/nhiễu đường SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn SPME Solid Phase Micro-Extraction Vi chiết pha rắn TMCS Chlorotrimethylsilane Chlorotrimethylsilan UV-Vis Ultraviolet Visible Phổ tử ngoại – khả kiến v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các thông số vật lý phenol Bảng 1.2: Một số khuyến cáo giới hạn phenol Bảng 1.3: Một số phương pháp xác định hợp chất phenol mẫu môi trường 12 Bảng 1.4: Một số phương pháp phân tích hợp chất phenol GC-MS 16 Bảng 2.1: Quan hệ kỹ thuật khối phổ số điểm IP đạt 23 Bảng 3.1: Các mảnh ion mẹ ion phenol sau bắn phá 27 Bảng 3.2: Kết khảo sát thời gian tạo dẫn xuất phenol với MTBFTSA 30 Bảng 3.3: Kết khảo sát nhiệt độ tạo dẫn xuất phenol với MTBSTFA 31 Bảng 3.4: Kết khảo sát điều kiện chiết làm phenol 34 Bảng 3.5: Tỷ lệ ion phenol 39 Bảng 3.6: Giá trị LOD LOQ phenol 40 Bảng 3.7: Phương trình đường chuẩn hệ số tương quan tuyến tính phenol mẫu trắng thêm chuẩn 41 Bảng 3.8: Độ lặp lại độ thu hồi phenol nồng độ 10 ng/mL, 100 ng/mL, 500 ng/mL 42 Bảng 3.9: Kết xác định hàm lượng phenol mẫu thủy sản có phenol 43 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hóa phenol thể người động vật Hình 1.2: Cơ chế phản ứng chung tạo dẫn xuất trimethylsilyl 15 Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký khí - khối phổ 16 Hình 3.1: Phổ khối phenol sau bắn phá ion 28 Hình 3.2: Sắc ký đồ TIC ion dung dịch phenol chuẩn 500 ng/mL 29 Hình 3.3: Đồ thị thể hiệu suất phản ứng tạo dẫn xuất phenol với MTBSTFA thời gian khác 31 Hình 3.4: Sắc ký đồ thu thực phản ứng tạo dẫn xuất phenol với MTBSTFA nhiệt độ 70, 80, 90ºC 32 Hình 3.5: Quy trình cất kéo nước mẫu 33 Hình 3.6: Đồ thị thể diện tích pic thu phân tích phenol sử dụng phương pháp chiết làm khác so với phenol chuẩn 100 ng/mL 35 Hình 3.7: Sắc ký đồ khảo sát điều kiện chiết làm phenol cột SPE C18, HLB, chiết QuEChERS dung dịch phenol chuẩn 100 ng/mL 36 Hình 3.8: Quy trình xử lý mẫu xác định hàm lượng phenol thủy sản 37 Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn 100 ng/mL 38 Hình 3.10: Sắc ký đồ thể tỷ lệ ion mẫu thêm chuẩn phenol 500 ng/mL 39 Hình 3.11: Sắc ký đồ phenol LOD ng/mL 40 Hình 3.12: Đường chuẩn phenol mẫu trắng thêm chuẩn nống độ từ 10 ng/mL đến 50 ng/mL 41 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với trình công nghiệp hóa, đại hóa đất nước Việt Nam phải đối mặt với vấn đề ô nhiễm môi trường nước ngày nghiêm trọng Ô nhiễm môi trường nước thay đổi thành phần chất lượng nước không đáp ứng cho mục đích sử dụng khác nhau, vượt tiêu chuẩn cho phép có ảnh hưởng xấu đến đời sống người Trong thời gian gần cố ô nhiễm môi trường biển làm cá chết hàng loạt vùng biển ven bờ tỉnh miền Trung dư luận đặc biệt quan tâm gây ảnh hưởng đến sức khỏe, kinh tế sinh thái biển nặng nề Từ kết phân tích đánh giá đưa nhận định: “Đã có nguồn thải lớn chứa phenol cyanid kết hợp phức sắt dạng keo xả môi trường biển xuất phát từ khu vực Vũng Áng, Hà Tĩnh di chuyển theo dòng hải lưu tới Thừa Thiên Huế Phức sắt dạng keo hấp thụ phenol, cyanid chất độc khác làm giàu độc chất chí tới hàm lượng gây độc cấp tính” Như vậy, thấy phenol tác nhân hóa học gây cố cá chết hàng loạt bốn tỉnh miền Trung Phenol hóa chất công nghiệp quan trọng chúng tham gia vào nhiều ngành công nghiệp than cốc, lọc dầu, luyện kim, sản xuất nhựa, dược phẩm, thuốc trừ sâu Sự diện phenol chí nồng độ thấp nước thải công nghiệp ảnh hưởng xấu đến sinh vật nước sống người Do đó, Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) Liên minh châu Âu (EU) đưa phenol số hợp chất phenol danh sách chất gây ô nhiễm hàng đầu Hiện nay, Việt Nam chưa có quy định phương pháp chuẩn để xác định hàm lượng phenol thực phẩm Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định hàm lượng phenol thủy sản phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS/MS)” với mục tiêu: Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng phenol thủy sản sắc ký khí khối phổ (GC-MS/MS) Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng phenol thủy sản đến 500 ng/mL Kết hàm lượng phenol mẫu bảng 3.9 tính sau tiến hành pha loãng dịch cất thu từ đến 20 lần tùy thuộc vào nồng độ thực bước theo quy trình hình 3.8 từ bước chiết QuEChERS 3.5 Bàn luận Như vậy, khác với số tài liệu kham khảo xử lý mẫu chiết pha rắn, tiến hành chiết QuEChERS cho thấy hiệu suất cao khoảng 92,8% có ưu điểm so với phương pháp khác như: - Nhanh - Dễ thực - Rẻ tiền - Hiệu - Ổn định - An toàn Khi áp dụng phương pháp 65 mẫu thủy sản thực từ tỉnh miền Trung gửi Viện kiểm nghiện an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia số có hàm lượng phenol cao, vượt mức MRL ảnh hưởng đến sức khỏe người 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã khảo sát lựa chọn điều kiện tách làm phenol mẫu: - Cất kéo nước phenol từ mẫu thủy sản nhiệt độ 190ºC thu 100 mL dịch cất - Chiết làm phenol QuEChERS - Tạo dẫn xuất với tác nhân MTBFTSA nhiệt độ 80ºC 60 phút Đã lựa chọn điều kiện phân tích phenol GC-MS/MS - Tách sắc ký khí sử dụng cột DB5-MS - Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ đầu 50°C giữ phút, tăng 25°C/phút lên 250°C giữ phút - Phân tích MS/MS với EI 70 eV, chế độ MRM Đã thẩm định phương pháp xác định hàm lượng phenol thủy sản với kết sau: - Phương pháp có tính chọn lọc đáp ứng yêu cầu; sau bắn phá phenol qua MS/MS lựa chọn ion con, ion sử dụng để định lượng ion dùng để khẳng định có mặt phenol mẫu - Khoảng tuyến tính với R2 = khoảng nồng độ từ 10 đến 500 ng/mL - Giới hạn định lượng phenol 10 ng/mL (tương ứng 0,04 mg/kg thủy sản) thấp mức giới hạn cho phép phenol dung nạp qua thực phẩm - Độ lặp lại phương pháp có độ lệch chuẩn tương đối từ 1,3 đến 5,7% mẫu thủy sản - Độ thu hồi đạt từ 87 đến 90,5% đáp ứng yêu cầu theo AOAC Đánh giá xác định hàm lượng phenol 65 mẫu thủy sản Kiến nghị - Áp dụng phương pháp PTN trang bị hệ thống GC-MS/MS - Xác định hàm lượng phenol thủy sản mẫu nguy khác 46 TÀI LIỆU KHAM KHẢO Tiếng việt: Trần Tử An (2007), Hóa phân tích tập 2, Nhà xuất Y học Hà Nội, Hà Nội Bộ Y tế, Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT (2007), Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm Bộ Tài nguyên Môi trường (2015), Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia chất lượng nước biển Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích Hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, str 15-58 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6216: 1996 (1996), Chất lượng nước - xác định số phenol - phương pháp trắc phổ dùng 4- aminoantipyrin sau chưng cất Tiếng anh: Adem Asan, Ibrahim Isildak (2003), “Determination of major phenolic compounds in water by reversed-phase liquid chromatography after pre-column derivatization with benzoyl chloride”, Journal of Chromatography A, 988 (2003), pp 145-149 Afilah Abd Gami, Mohd Yunus Shukor, Khalilah Abdul Khalil, Farrah Aini Dahalan, Ariff Khalid, Siti Aqlima Ahmad (2014), “Phenol and phenolic compounds toxicity”, Journal of environmental microbiology and toxicology, Vol 2, No 1, pp 11-23 Agency for Toxic Substances and Disease Registry (2008), “Toxicological profile for phenol”, Public Health Service, US Department of Health and Human Services Agency for Toxic Substances and Disease Registry (2011), “ToxGuideTM for Phenol”, Public Health Service, US Department of Health and Human Services 10 Alina O Mate, Florentina Gatea, G L Radu (2015), “Analysis of phenolic compounds in some medicinal herbs by LC-MS”, Journal of Chromatographic Science 2015, pp 1-8 47 11 An American National Standard (1995), “Standard test methods for phenolic compounds in water”, Annual Book of ASTM Standards, Vol 11.01 12 Antonella Canini, Daniela Alesiani, Giuseppe D’Arcangelo, Pietro Tagliatesta (2007), “Gas chromatography-mass spectrometry analysis of phenolic compounds from Carica papaya L leaf”, Journal of Food Composition and Analysis, 20 (2007), pp 584-590 13 Agnes Kovács, Anikó Kende, Mária Mortl, Gábor Volk, Tamás Rikker, Kornél Torkos (2008), “Determination of phenols and chlorophenols as trimethylsilyl derivatives using gas chromatography-mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1194 (2008), pp 139-142 14 Canadian Council of Ministers of the Environment (1999), “PHENOLS mono- and dihydric phenols”, Canadian Water Quality Guidelines for the Protection of Aquatic Life 15 Cristina Mahugo Santana, Zoraida Sosa Ferrera, M Esther Torres Padrón and José Juan Santana Rodríguez (2009), “Methodologies for the extraction of phenolic compounds from environmental samples: New Approaches”, Molecules (2009) 14, pp 298-320 16 Enviroment Canada, Health Canada (1999), “Priority substances list assessment report: phenol”, Canadian Environmental Protection Act 17 European Food Safety Authority (2013), “Scientific opinion on the toxicological evaluation of phenol”, EFSA Journal 2013, 11(4):3189 18 Furong Zhou, Xiujuan Li, Zhaorui Zeng (2005), “Determination of phenolic compounds in wastewater samples using a novel fiber by solid-phase microextraction coupled to gas chromatography”, Analytica Chimica Acta 538 (2005), pp 63-70 19 Francis Orata (2012), Masinde Muliro University of Science and Technology, Kenya, “Derivatization reactions and reagents for gas chromatography analysis” 48 20 J Bladek and M Sliwakowski, Military Universit of Technology, Warsaw, Poland (2000), “PHENOLS: Solid-Phase Extraction”, pp 3776-3782 21 J Michałowicz, W Duda (2006), “Phenols - Sources and Toxicity”, University of Lódź, Faculty of Biology and Environment Protection, Banacha, pp 90-237 22 Lotte Ask Reitz el, Anna Ledin (2002), “Determination of phenols in landfill leachate-contaminated groundwaters by solid-phase extraction”, Journal of Chromatography A, 972 (2002), pp 175-182 23 M.Á González-Curbelo, B Socas-Rodríguez, A.V Herrera-Herrera, J GonzálezSálamo, J Hernández-Borges, M.Á Rodríguez-Delgado (2015), “Evolution and applications of the QuEChERS method”, Trends in Analytical Chemistry 24 M.-R Lee, National Chung-Hsing University, Taichung, Taiwan (2000), “PHENOLS - Gas Chromatography”, Republic of China, pp 3761-3762 25 M.S Butchiram, M Vijaya Kumar, K.S Tilak (2012), “Studies on the histopathological changes in selected tissues of fish Labeo rohita exposed to phenol”, Journal of Environmental Biology, Vol.34, pp 247-251 26 Nassr-Allah H Abdel-Hameid (2007), “Physiological and histopathological alterations induced by phenol exposure in Oreochromis aureus Juveniles”, Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 7, pp 131-138 27 N Cardellicchio, S Cavalli, V Piangerelli, S Giandomenico, P Ragone (1997), “Determination of phenols in environmental samples by liquid chromatographyelectrochemistry”, Fresenius J Anal Chem 358, pp 749-754 28 N C Saha, F Bhunia, A Kaviraj (1999), “Toxicity of phenol to fish and aquatic ecosystems”, Enviromental Contaimination and Toxicology 63, pp 195-202 29 The Commission of The European Communities (2012), Comission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results (2002/657/EC), Official Journal of the European Communities 49 30 Thomas Heberer, Hans-Juergen Stan (1997), “Detection of more than 50 substituted phenols as their t-butyldimethylsilyl derivatives using gas chromatography-mass spectrometry”, Analytica Chimica Acta 341, pp 21-34 31 United States Environmental Protection Agency (2000), “Method 528: Determination of phenols in drinking water by solid phase extraction and capillary column gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS)” 32 United States Enviromental Protection Agency (1984), “Method 604: Method for organic chemical analysis of municipal and industrial wastewater - Phenols” 33 United States Enviromental Protection Agency (2007), “Method 8041a: Phenols by gas chromatography” 34 Wilered Vermerris, Ralph Nicholson (2006), “Phenolic compound biochemistry”, Springer, pp 2-53 50 PHỤ LỤC Phổ khối dẫn xuất phenol sau bắn phá ion Sắc ký đồ tối ưu hóa điều kiện sắc ký: 51 Sắc ký đồ khảo sát điều kiện nhiệt độ tạo dẫn xuất phenol với MTBSTFA Sắc ký đồ khảo sát điều kiện làm phenol 52 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn phenol 100 ng/mL Sắc ký đồ thể hện tỷ lệ ion mẫu thêm chuẩn phenol 500 ng/mL 53 Sắc ký đồ phenol LOD 3ng/mL Sắc ký đồ độ lặp lại thu hồi phenol mẫu trắng thêm chuẩn phenol 10 ng/mL (n=6) 54 Sắc ký đồ độ lặp lại độ thu hồi phenol mẫu trắng thêm chuẩn phenol 100 ng/mL (n=6) 55 10 Sắc ký đồ độ lặp lại độ thu hồi mẫu trắn thêm chuẩn phenol 500 ng/mL (n=6) 56 11 Một số sắc ký đồ phân tích phenol số mẫu thực 57 58 59 ... cứu đề tài: Xác định hàm lượng phenol thủy sản phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS/MS)” với mục tiêu: Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng phenol thủy sản sắc ký khí khối phổ (GC-MS/MS)... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU MÃ SINH VIÊN: 1201588 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PHENOL TRONG THỦY SẢN BẰNG SẮC KHÍ KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Trần Nguyên... 1.5 Giới thiệu sắc ký khí khối phổ 1.5.1 Sắc ký khí Sắc ký khí kỹ thuật tách chất dựa vào phân bố chất hai pha, pha động chất khí pha tĩnh chất rắn (sắc ký khí rắn) chất lỏng (sắc ký khí lỏng)