TH Phân tích dụng cụ -Nhóm 1.Kháiniệm Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đời năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến liên kết hóa học với nhóm chức hữu Phương pháp ngày sử dụng rộng rãi phổ biến nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả định lượng tốt, thích hợp tách hợp chất khó bay dễ phân hủy nhiệt Phạm vi ứng dụng phương pháp HPLC rộng, phân tích hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, chất phụ gia th c ph m lĩnh v c th c ph m, dượcph m, môitrường… Phân loại định nghĩa Trong HPLC tùy thuộc vào chất trình sắc ký pha tĩnh cột tách mà phân thành loại sắc ký - Sắc ký pha thuận ( Normal phase : NP-HPLC) :là Sắc ký có thành phần pha tĩnh phân c c pha dộng mang tính không phân c c - Sắc ký pha đảo ( Reversae phase : RP- HPLC) Sắc ký có thành phân pha tĩnh không phân c c thành phần pha động phân c c GVHD : Ths Võ Thúy VI TH Phân tích dụng cụ -Nhóm - Sắc ký trao đổi ion ( Ion exchange: IE-HPLC) : Sắc ký trao đổi ion d a tượng trao đổi thuận nghịch ion linh động pha tĩnh rắn với ion DD phân tích, cho DD qua cột nạp đầy pha tĩnh Các pha tĩnh trường hợp gọi chất trao đổi ion - Sắc ký ghép cặp Ion (Ion Pair: IP-HPLC) : Sắc ký ghép cặp ion biên thể sắc ký pha đảo pha tĩnh pha động sắc ký pha đảo Điều khác biệt sắc ký ghép cặp ion phải tạo điều kiện để chất phân tích phải dạng ion hóa hoàn toàn (bằng cách điều chỉnh pH) - Sắc ký rây phân tử( Size exclution chromatography SEC-HPLC) : Sắc ký rây phân tử phương pháp chia tách phân tử dung dịch d a kích thước chúng Trong trường hợp pha động dung môi hữu cơ, kỹ thuật gọi sắc ký thấm qua gel, trường hợp pha động nước kỹ thuật gọi sắc ký lọc gel - Sắc ký tách đồng phân quang học (Chiral separation) : Phương pháp d a phản ứng hóa học hai đồng phân đối quang với hợp chất bất đối tạo thành hỗn hợp hai đồng phân lập thể không đối quang trước phân tách điện di Quá trình tách : Do s tương tác khác chất phân tích vật liệu nhồi cột mà trình tách xảy Hình : Quá trình phân tách chất sắc ký cột GVHD : Ths Võ Thúy VI TH Phân tích dụng cụ -Nhóm Một số ưu điểm HPLC: - Điều kiện phân tích dễ dàng: + Không cần bay mẫu GC, phân tích chất bên nhiệt - Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao gắn thu hồi phân đoạn (fraction collector) , thường dùng điều chế, tách tinh dầu, dược ph m… - Độ lặp lại cao - Thường không phân hủy mẫu Cách lựa chọn sắc ký: Loại sắc ký Dung môi sử dụng Chất phân tích Sắc ký pha đảo Sắc ký ghép cặp ion Sắc ký pha thuận Sắc ký trao đổi ion Sắc ký rây phân tử Sắc ký Chiral H2O/Đệm , ACN, MeOH Các chất trung hòa không ion hóa, tan hỗn hợp nước/dung môi hữu Giống RP thêm Các chất dạng ion có chất tạo cặp ion thể ion hóa Hexane, CH Cl Hỗn hợp chất không tan hỗn hợp dung môi hữu – nước H2O/Đệm Các ion vô cơ, protein, axit nucleic H2O, THF, DMF… Các chất có phân tử lượng lớn Hỗn hợp dung môi Các đồng phân quang học hữu – nước - Ở th c hành ta sử dụng sắc ký pha đảo để phân tách hỗn hợp Paracetamol, Cafein dược ph m GVHD : Ths Võ Thúy VI TH Phân tích dụng cụ -Nhóm II Câu hỏi chuẩn bị : Câu 1: Cấu tạo hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao Cấu tạo hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao gồm: Bình chứa pha động, phận khử khí, bơm cao áp, phận tiêm mẫu, cột sắc ký (pha tĩnh), đầu dò , hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý liệu điều khiển hệ thống, in liệu Bình chứa pha động : - Máy HPLC thường có đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng bình chứa dung môi lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn tổng tỉ lệ đường 100% -Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, sử dụng đường dung môi lúc mà thường sử dụng đường hệ pha động pha trộn đồng hơn, hệ pha động đơn giản giúp ổn định trình rửa giải - Tất dung môi dùng cho HPLC phải dung môi tinh khiết sử dụng cho HPLC Tất hóa chất dùng để chu n bị mẫu pha hệ đệm phải hóa chất tích khiết dùng cho phân tích - Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên peak tạp trình phân tích Bộ khử khí Degases Mục đích sử dụng khử khí nhằm lọai trừ bọt nhỏ sót lại dung môi pha động, tránh xảy số tượng có sau: -Tỷ lệ pha động đường dung môi không làm cho thời gian lưu peak thay đổi - Trong trường hợp bọt nhiều, khử khí lọai trừ hết bơm cao áp không hút dung môi, ảnh hưởng đến áp suất hoạt động hệ thống HPLC Trong trường hợp dẫn đến sai kết phân tích Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột th c trình chia tách sắc ký Bơm phải đạt áp suất cao khoảng 250-600bar tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm thay đồi Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu t động (autosamper) GVHD : Ths Võ Thúy VI TH Phân tích dụng cụ -Nhóm Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh coi trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Cột pha tĩnh thông thường làm thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột kiểu sắc ký Đầu dò - Là phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiệu ghi sắc ký đồ để định tính định lượng Tùy theo tính chất chất phân tích mà người ta l a chọn lọai đầu dò phù hợp - Tín hiệu đầu dò thu là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… - Trên sở đó, người ta sản xuất lọai đầu dò sau: +Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát UV + Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát chất hấp thụ quang Đây lọai đầu dò thông dụng +Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát chất hữu chứa huỳnh quang t nhiên dẫn suất có huỳnh quang +Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả quét chồng phổ để định tính chất theo độ hấp thụ c c đại chất + Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đo loại đường + Đầu dò điện hóa: đo dòng, c c phổ, độ dẫn + Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,… Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận ghi tín hiệu đầu dò phát Đối với hệ thống HPLC đại, phần phần mềm hệ thống ghi nhận, lưu thông số, sắc ký đồ, thông số liên quan đến peak tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý thông số liên quan đến kết phân tích In liệu Sau phân tích xong, liệu in qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển Câu 2: Cơ chế hoạt động van tiêm mẫu sắc kí lỏng Mẫu lỏng dung dịch tiêm thẳng vào pha động cao áp đầu cột mà không cần dừng dòng van tiêm cổng có vòng chứa mẫu (sample loop) Vòng chứa mẫu có dung tích khác GVHD : Ths Võ Thúy VI TH Phân tích dụng cụ -Nhóm Có cách tiêm mẫu: •Tiêm tay với vòng mẫu tích xác định dùng micro xilanh •Hệ bơm mẫu t động theo chương trình định sẵn Tiêm tay -Cắm xilanh vào cổng tiêm vị trí inject -Vặn van vị trí load Lúc pha động vãn bơm vào cột Tiêm mẫu giúp thể tích mẫu tiêm luôn giống -Vặn inject, lúc nhờ s di chuyển van cổng pha động nối với mẫu vừa tiêm vào loop đ y mẫu vào cột Bắt đầu trình chạy sắc ký -Rút xilanh khỏi cổng tiêm, rửa cổng tiêm Tiêm t động: Mẫu chu n bị sẵn chứa bình chứa, phần mềm cài đặt sẵn, hệ thống t tiêm mẫu chạy sắc ký Câu Nguyên tắc hoạt động đầu dò UV: Khi mẫu qua detector ánh sáng qua dòng pin phát tín hiệu lớn dòng cảm biến, mẫu có bước sóng qua detector, mẫu làm giảm lượng ánh sáng dòng cảm biến nguyên nhân làm thay đổi tín hiệu detector Tín hiệu chuyển dòng electron xuất sắc phổ máy tính Tín hiệu hiển thị tăng lên tập trung mẫu dòng pin Detector phản ứng lại để thay đổi theo dòng pin Câu Cách xác định LOD, LOQ Bước 1: Xác định phương trình hồi quy tuyến tính Bước 2: LOD = LOQ = LOQ = LOD Câu Cách xác đinh phương trình hồi quy tuyến tính D a vào sắc ký đồ tìm giá trị diện tích peak tương ứng với nồng độ Caffein có bình chu n Rồi từ ta lập bảng chứa giá trị: nồng độ Caffein (ppm) Speak Bấm máy tính: Mode  3: Stat  2: A+BX  nhập giá trị cột X nồng độ Caffein cột Y Speak , nhập tới giá trị cuối cột Y nhấn = nhấn AC Để tìm giá trị A ta nhấn Shief chọn 5: Reg  chọn 1: A  nhấn = ta giá trị A Để tìm giá trị B ta nhấn Shief chọn 5: Reg  chọn 2: B  nhấn = ta giá trị B Phương trình hồi quy tuyến tính paracetamol có dạng Y = A + BX: làm tương t Caffein GVHD : Ths Võ Thúy VI TH Phân tích dụng cụ -Nhóm Câu Tại sắc ký khí thường sử dụng phương pháp nội chuẩn sắc ký lỏng dùng phương pháp ngoại chuẩn? Trong sắc ký khí để có độ xác cao sử dụng kỹ thuật đường chu n, phải xử lý tương t tất mẫu chu n cần tiêm vào máy sắc ký thể tích mẫu Điều khó không thể, độ độ xác có ảnh hưởng sử dụng kỹ thuật tiêm mẫu tay Vì để khắc phục hạn chế đó, kỹ thuật nội chu n sử dụng cho sắc ký khí Sử dụng phương pháp nội chu n sắc ký khí phương pháp cho phép ta xác định xác nồng độ chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng đáng kể thể tích tiêm mẫu lần tiêm Ngoài ra, chất nội chu n dùng sắc ký khí với mục đích để loại bỏ sai số tiêm mẫu tay Chất nội chu n dùng phải tương t mặt hóa học với chất phân tích có nồng độ tương t nồng độ chất phân tích Mặt khác, so với phương pháp ngoại chu n phương pháp nội chu n cho kết với độ sai số nhiều Trong sắc ký khí thường sử dụng phương pháp nội chu n sắc ký lỏng dùng phương pháp ngoại chu n Câu 7: Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa thông số sắc ký đồ Mục đích trình tối ưu hóa có s tách hoàn toàn chất cần phân tích thời gian ngắn qua cột Để có tối ưu trình sắc ký người ta phải sử dụng nguồn sẵn thiết bị, phần mềm để mô kết thu từ s thay đổi thông số vật lí khác Quá trình tối ưu hóa đồng nghĩa với việc chọn l a: cột, chiều dài cột, đường kính cột, thành phần pha tĩnh cột, độ phân giải, tốc độ dòng thành phần pha động Tất yếu tố lại tương tác với Ví dụ phân giải R thời gian chu kỳ tỷ lệ nghịch với Nhưng th c tế việc thay đổi thông số cố định (như cột ,chiều dài cột , , đường kính cột , pha tĩnh nhồi cột …) khó khăn tổn phí lớn cần tối ưu hóa ta ưu tiên đến thông số thay đổi (thành phân pha động, độ phân giải hay nồng độ… ) GVHD : Ths Võ Thúy VI TH Phân tích dụng cụ -Nhóm III Tiến Hành Thí nghiệm xử lý kết đo Chuẩn bị dung dich chuẩn: Pha chu n hỗn hợp 25ml *CAF 10ppm *PAR 2ppm từ chất gốc 100ppm 118ppm Cách pha d a vào CT : NV1=NV2 Vậy cần hút 2,5ml CAF 100ppm hút 0,42 mL PAR 118ppm định mứt binh 25mL Pha chu n đơn: cung tương t ta rút chất cho vào binh định mức 25ml đinh mức tới vạch Lọc qua màng lọc 0.45 µm Khảo sát thành phần pha động: Khi cho dung dịch chu n hỗn hợp PAR, CAF vào HPLC tiến hành chạy với tỉ lệ pha động khác Từ sắc ký đồ ta thấy đươc tỷ lệ phân pha động thi tỉ lệ 50:50 cho sắc ký đồ PAR, CAF gần nghĩa thời gian lưu TR ngắn Vậy phân tách hỗn hợp tỷ lệ có độ tối ưu hóa cao Pha hỗn hợp chuẩn nồng độ khác từ dung dịch chuẩn gốc 100ppm, 118ppm Ký hiệu bình Nồng độ CAF sau định mức (ppm) Thể tích dung dịch CAF gốc 100ppm (mL) Nồng độ PAR sau đinh mức (ppm ) Thể tích dung dịch PAR gốc 118ppm (mL) 10 20 0,25 0,5 1,25 2,5 5 10 0,212 0,423 0,635 1,06 2,12 Xử lí hỗn hợp chu n tiến hành đo hệ thông HPLC Phân tích mẫu thuốc Tiến hành xử lí mẫu thuốc Padadol Extra (1 viên thuốc có khối lượng khoảng 0,6g) Sau lấy 0,255 g mẫu thuốc tiến hành định mức lấy dung dich mẫu xử lí lọc đánh siêu âm sau tiêm vào HPLC CAF: CAFFEIN –*PAR : PARACETAMOL * GVHD : Ths Võ Thúy VI TH Phân tích dụng cụ -Nhóm Xử Lí Kết Quả Đo Từ sắc ký đồ ta thu số liệu sau : Khối lượng viên thuốc m= 0.5967 (g) C Mẫu Mẫu Chuẩn huẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn thuốc Caffein (ppm) Speak Paracetamol Speak 10 20 0,311 63,07 188,47 427,41 927,47 1564,26 58,82 10 5,56 39,82 58,14 95,13 154,55 253,55 153,24 Đồ thị tuyến tính Diện tích peak CAF theo nồng độ: (ppm) S Đồ thị S-ppm CAF 1800 1600 1400 1200 y = 78,938x + 34,209 R² = 0,9897 1000 800 600 400 Đồ thị tuyến tính Diện tích peak PAR theo nồng độ (ppm) 200 0 GVHD : Ths Võ Thúy VI 10 15 20 25 ppm TH Phân tích dụng cụ -Nhóm Đồ thị tuyến tính Diện tích peak PAR theo nồng độ: (ppm) S Đồ Thị S-ppm PAR 300 y = 24,109x + 18,98 R² = 0,9874 250 200 150 100 50 0 10 12 ppm Kết tính toán: Khối lượng viên thuốc m=0,5976 đó: khối lượng PAR 500mg; khối lượng CAF 65mg Lập luận : Khi xử lý mẫu viên thuốc hòa tan lit dung dịch nồng độ ppm PAR CAF 500ppm 65ppm Tương đương 250ml thi có nông độ CPAR= CCAF = -Nhận xét thấy nồng độ ppm lớn hệ số pha loãng cao dụng cụ hổ trợ nên th c chia đôi khối lượng viên thuốc Cho khối lượng PAR, CAF phân bố đông 250mg PAR 37,5mg CAF Tính nồng độ ppm CAF, PAR 250 ml dung dich CPAR= =1000ppm CCAF = =130 ppm Để khoảng CPAR,CCAF vung tuyến tính 1ppm CPAR 10ppm 1ppm CCAF 20ppm nồng độ pha loãng 100 lần =100 Vxd= 1ml (định mức 100ml) Với khối lượng viên thuốc hòa tan thành 250 ml dd có nồng độ CPAR=10ppm CCAF=1,3ppm ta chon khối lượng viên thuốc nhỏ 0,2988(g) GVHD : Ths Võ Thúy VI 10 TH Phân tích dụng cụ -Nhóm Cân 0,2565 g thuốc Panadol extra hòa tan vào bình định mức 250ml Rút 1mL đinh mức thành 100mL Xử lý mẫu đê tiêm vào HPLC phân tách Nồng độ PAR CAF mẫu Thế S peak CAF đo mẫu vào pt đường tuyến tính S-ppm CAF y = 78,938x + 34,209 => CCAF= 0,311 ppm Thế S peak CAF đo mẫu vào pt đường tuyến tính S-ppm PAR y = 24,109x + 18,98 => CPAR = 5,56 ppm Hàm lượng PAR CAF mẫu: CAF= 0,311 PAR=5,56 GVHD : Ths Võ Thúy VI 10-6 = 0,015 (g) 10-6 = 0,278 (g) 11 ... g thuốc Panadol extra hòa tan vào bình định mức 250ml Rút 1mL đinh mức thành 100mL Xử lý mẫu đê tiêm vào HPLC phân tách Nồng độ PAR CAF mẫu Thế S peak CAF đo mẫu vào pt đường tuyến tính S-ppm... tích dụng cụ -Nhóm Có cách tiêm mẫu: •Tiêm tay với vòng mẫu tích xác định dùng micro xilanh •Hệ bơm mẫu t động theo chương trình định sẵn Tiêm tay -Cắm xilanh vào cổng tiêm vị trí inject -Vặn... load Lúc pha động vãn bơm vào cột Tiêm mẫu giúp thể tích mẫu tiêm luôn giống -Vặn inject, lúc nhờ s di chuyển van cổng pha động nối với mẫu vừa tiêm vào loop đ y mẫu vào cột Bắt đầu trình chạy