BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HÀ Mã sinh viên: 1201150 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ACID LACTIC CỦA Lactobacillus sporogenes KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HÀ Mã sinh viên: 1201150 KHẢO SÁT KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ACID LACTIC CỦA Lactobacillus sporogenes KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới cô giáo ThS Kiều Thị Hồng hết lòng hướng dẫn, tận tâm bảo giúp đỡ hoàn thành khoá luận Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đàm Thanh Xuân cho học giá trị, nhiệt tình dạy bảo giúp đỡ từ ngày đầu nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo kỹ thuật viên Bộ môn Công Nghiệp Dược Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia nhiệt tình bảo tạo điều kiện cho hoàn thành khoá luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, tháng 05 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Hà MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANG MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1.1 TỔNG QUAN Acid lactic .2 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Đặc điểm 1.1.3 Công dụng 1.2 Các phương pháp sản xuất acid lactic: 1.2.1 Phương pháp tổng hợp hóa học 1.2.2 Phương pháp vi sinh vật 1.3 Vi khuẩn sinh acid lactic: 1.3.1 Đặc điểm nhóm vi khuẩn sinh lactic 1.3.2 Chi Lactobacillus 1.3.3 Loài Lactobacillus sporogenes 1.3.4 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến phát triển vi khuẩn sinh acid lactic : 11 1.4 Các nghiên cứu Lactobacillus sporogenes khả sinh acid lactic vi khuẩn này: .13 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu: .15 2.1.1 Nguyên vật liệu: 15 2.1.2 Thiết bị sử dụng 17 2.2 Nội dung nghiên cứu: 17 2.2.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L sporogenes để thu calci lactat với hiệu suất cao 17 2.2.2 Khảo sát lựa chọn nhiệt độ điều kiện hô hấp thích hợp cho L sporogenes để thu calci lactat với hiệu suất cao 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 18 2.3.1 Phương pháp nhân giống nuôi cấy 18 2.3.2 Phương pháp tách chiết calci lactat từ dịch lên men 18 2.3.3 Phương pháp định tính calci lactat: 19 2.3.4 Phương pháp Schoorl- Regenbogen định lượng đường 20 2.3.5 Phương pháp tính hiệu suất tiêu thụ đường tạo calci lactat 20 2.3.6 Phương pháp tính toán xử lý số liệu: 21 Chương 3.1 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L sporognens để thu calci lactat với hiệu suất cao: 22 3.1.1 Khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L sporognens để thu calci lactat với hiệu suất cao 22 3.1.2 3.2 Định tính sản phẩm calci lactat thu thu 24 Khảo sát lựa chọn nhiệt độ điều kiện hô hấp thích hợp cho Lactobacillus sporogenes để thu calci lactat với hiệu suất cao 27 3.2.1 Khảo sát điều kiện hô hấp nuôi cấy L sporogenes 37oC để thu calci lactat với hiệu suất cao 27 3.2.2 Khảo sát điều kiện hô hấp nuôi cấy L sporogenes 50oC để thu calci lactat với hiệu suất cao 30 3.3 Bàn luận chung: 33 3.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L sporognens để thu calci lactat với hiệu suất cao 33 3.3.2 Khảo sát lựa chọn nhiệt độ điều kiện hô hấp thích hợp cho Lactobacillus sporogenes để thu calci lactat với hiệu suất cao 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT B coagulans Bacillus coagulans FDA Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) Glc Glucose L acidophilus Lactobacillus acidophilus L sporogenes Lactobacillus sporogenes MRS Môi trường quy ước dùng để nuôi cấy vi sinh vật sinh acid lactic (de Man, Rogosa, Sharpe) Vd Vừa đủ VK Vi khuẩn 𝑥̅ Giá trị trung bình  Độ lệch chuẩn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 So sánh đặc tính Lactobacillus sporogenes với chi Bacillus Lactobacillus 11 Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng đề tài 15 Bảng 2.2 Các môi trường sử dụng đề tài 16 Bảng 2.3 Bảng thiết bị sử dụng 17 Bảng 3.1 Lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ hai môi trường nuôi cấy: MRS MT 23 Bảng 3.2 Kết phân tích phổ hồng ngoại sản phẩm 25 Bảng 3.3 Lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ hai điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí nhiệt độ 37oC .28 Bảng 3.4 Hiệu suất tạo calci lactat hai điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí nhiệt độ 37oC 29 Bảng 3.5 Lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ hai điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí 50oC 31 Bảng 3.6 Hiệu suất tạo calci lactat hai điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí 50oC .32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Các phương pháp sản xuất acid lactic Hình 1.2 Quá trình lên men lactic đồng hình (homolactic) dị hình (heterolactic) Hình 1.3 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes 10 Hình 3.1 So sánh lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ hai môi trường nuôi cấy: MRS MT điều kiện kị khí 37oC .23 Hình 3.2 Phổ IR calci lactat .25 Hình 3.3 Tinh thể calci lactat khan kính hiển vi quang học .26 Hình 3.4 So sánh lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ hai điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí 37oC 28 Hình 3.5 So sánh lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ hai điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí 50oC 31 Hình 3.6 So sánh hiệu suất tạo calci lactat L sporogenes hai điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí 50oC 32 Hình 3.7 Ảnh SEM tinh thể calci lactat khan nghiên cứu Sun Hee Cheong 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Các sản phẩm lên men vi sinh vật đã, ngày ứng dụng phổ biến lĩnh vực đời sống Trong số sản phẩm công nghệ lên men, acid lactic muối lactat sản phẩm có lịch sử lâu đời ứng dụng rộng rãi [1] Phương pháp tổng hợp hóa học acid lactic thường tạo dạng racemic Trong phương pháp vi sinh tạo dạng acid L(+) lactic với hiệu suất cao thân thiện với môi trường [23] Lactobacillus sporogenes chủng vi khuẩn sinh acid lactic có nhiều đặc tính trội: có khả phát triển điều kiện nhiệt độ pH khắc nghiệt mà loại vi khuẩn sinh acid lactic phổ biến khác phát triển được, khả sản xuất acid lactic tinh khiết quang học cao sản xuất sinh khối vi sinh vật không từ nguồn carbon glucose mà từ cellulose xylose (những nguồn carbon rẻ tiền hơn)… [24], [43] Trên giới, Lactobacillus sporogenes ngày phổ biến dòng vi khuẩn sản sinh acid lactic phù hợp với sản xuất acid lactic công nghiệp [48] Tuy nhiên Việt Nam, nghiên cứu vi khuẩn chưa nhiều chưa có nghiên cứu khả sinh acid lactic Xuất phát từ lý đó, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ điều kiện hô hấp đến khả sinh acid lactic Lactobacillus sporogenes” tiến hành với mục tiêu sau: - Lựa chọn môi trường thích hợp nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để sinh acid lactic với hiệu suất cao - Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ điều kiện hô hấp đến khả sinh acid lactic Lactobacillus sporogenes Bảng 3.6 Hiệu suất tạo calci lactat hai điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí 50oC Điều kiện hô hấp Kị khí Lần thí nghiệm Lượng calcilactat thu được(g/100ml) Hiệu suất tạo calci lactat (%) Hiếu khí Lần Lần Lần Lần Lần Lần 10,46 11,23 11,49 5,68 5,32 4,37 92,68 91,92 97,78 85,64 75,65 77,39 Kết trung bình (X4) 94,12 79,56 Độ lệch chuẩn 3,19 5,34 Hiệu suất tạo calci lactat (%) TỈ lệ X4 hiếu khí/ X4 kị khí 84.53% 94.12 95 90 85 79.56 80 75 70 Kị khí Hiếu khí Điều kiện hô hấp Hình 3.6 So sánh hiệu suất tạo calci lactat L sporogenes hai điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí 50oC 32  Nhận xét: Kết bảng số liệu cho thấy sau nuôi cấy L sporogenes hai điều kiện hô hấp khác 50oC: Ở điều kiện kị khí, lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ 100% mẫu tiến hành thí nghiệm Hiệu suất tạo calci lactat dao động từ 91,92 – 97,78 %, đạt giá trị trung bình 94,12% với độ lệch chuẩn 3,19 Ở điều kiện hiếu khí, lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ dao động từ 46,22 – 59,84 %, đạt giá trị trung bình 54,17 % với độ lệch chuẩn 7,09 Hiệu suất tạo calci lactat dao động từ 75,65- 85,64%, đạt giá trị trung bình 79,56 với độ lệch chuẩn 5,34 So sánh với điều kiện kị khí, lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ 54,17 % lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ điều kiện kị khí, hiệu suất tạo calci lactat 84,53 % so với điều kiện kị khí Như vậy, 50oC với môi trường nuôi cấy MT, điều kiện kị khí điều kiện hô hấp thích hợp cho L sporogenes để thu calci lactat với hiệu suất cao (hình 3.6) 3.3 Bàn luận chung: 3.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L sporognens để thu calci lactat với hiệu suất cao 3.3.1.1 Khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho L sporognens để thu calci lactat với hiệu suất cao: Đề tài tiến hành thí nghiệm nuôi cấy L sporogenes với hai môi trường khảo sát môi trường MRS môi trường MT điều kiện không cấp khí (kị khí- có lắc để phân tán CaCO3) tủ ấm 37oC Kết thu cho thấy môi trường MRS môi trường thích hợp cho L spororgenes để thu calci lactat với hiệu suất cao: lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ để tạo calci lactat ít, đạt giá trị trung bình 8,51 % so với lượng glucose ban đầu chiếm 28,71 % lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ để tạo calci lactat sử dụng môi trường MT Như vậy, môi trường thích hợp nuôi cấy L spororgenes để thu calci lactat môi trường MT 33 Kết đề tài hoàn toàn phù hợp với kết hai nhà nghiên cứu Kenji Sakai Yutaka Ezaki: môi trường MRS môi trường phù hợp cho L sporogenes để sinh acid lactic với hiệu suất cao [33] Bên cạnh đó, bàn luận lý đề tài lựa chọn khảo sát hai môi trường nghiên cứu MRS môi trường MT lựa chọn nhiệt độ 37oC, điều kiện kị khí cho thí nghiệm tiến hành vì: Qua khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối L sporogenes, tác giả Dương Thị Huyền Trang sử dụng môi trường MRS để tiến hành thí nghiệm [12] Cũng theo nghiên cứu tác giả Nguyễn Thanh Quỳnh Trang khảo sát hình thành bào tử L sporogenes, môi trường MRS môi trường sử dụng để tiến hành thí nghiệm [13] Tác giả Lê Minh Phương Nguyễn Thị Thu Trang tiến hành nghiên cứu khả tạo magie lactat L acidophilus sử dụng môi trường MT môi trường nuôi cấy [8], [14] Trên giới, Lindan Ye cộng tiến hành nghiên cứu cho thấy L sporogenes có khả phát triển môi trường đơn giản môi trường MRS (môi trường quy ước dùng để nuôi cấy vi sinh vật sinh acid lactic) [36], [48] Từ nghiên cứu tác giả trên, đề tài định khảo sát hai môi trường nuôi cấy: MRS MT Tác giả Dương Thị Huyền Trang Nguyễn Thanh Quỳnh Trang nghiên cứu khảo sát hình thành sinh khối bào tử L sporogenes nhiệt 37oC có cung cấp khí (hiếu khí) Trong đó, tác giả Lê Minh Phương Nguyễn Thị Thu Trang nghiên cứu khảo sát khả sinh acid lactic L acidophilus tiến hành nhiệt độ 37oC điều kiện không cấp khí (kị khí- có lắc để phân tán MgCO3) Trên giới, nhiệt độ 37o biết đến nhiệt độ thích hợp cho số chi Lactobacillus, Baccillus [30], L sporogenes thuộc nhóm vi khuẩn kị khí tùy nghi (sinh trưởng phát triển điều kiện hiếu khí kị khí) [44] với dự đoán điều kiện hiếu khí, tức điều kiện nuôi cấy có cung cấp oxi, vi sinh vật sinh trưởng phát triển mạnh hơn, tạo nhiều sinh khối nên lượng sản phẩm calci lactat (sản phẩm bậc 2) thu chủ yếu sau pha cân hơn, lượng vi sinh vật 34 sử dụng chủ yếu để tạo sinh khối Điều kiện kị khí, vi sinh vật sinh trưởng phát triển yếu hơn, nhanh chóng đạt trạng thái cân sinh nhiều calci lactat Vì vậy, đề tài tiến hành thí nghiệm khảo sát 37oC điều kiện không cấp khí (kị khí), có lắc để phân tán CaCO3 3.3.1.2 Định tính sản phẩm calci lactat thu được: Đề tài tiến hành thí nghiệm định tính sản phẩm thu được: định tính ion lactat phương pháp hóa học, đo nhiệt độ nóng chảy tinh thể phân tích phổ hồng ngoại sản phẩm nhằm xác định liệu sản phẩm có phải calci lactat hay không để khẳng định lại tính xác kết đạt Kết định tính ion lactat dịch nuôi cấy L sporogenes phương pháp hóa học (mục 3.1.2) phù hợp với mô tả phản ứng định tính ion lactat mô tả DĐVN IV [2] Vì vậy, đề tài đến kết luận rằng, dịch nuôi cấy L sporogenes có tồn ion lactat hay L sporogenes có khả sinh acid lactic trình nuôi cấy Trong nghiên cứu “Nuôi cấy L spororgenes để tạo nguyên liệu probiotic”, tác giả Tô Ngọc Sắc tiến hành thí nghiệm định tính ion lactat dịch nuôi cấy L sporogenes phương pháp khác thu kết tương tự [9] Tác giả Trần Hạnh Triết với nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng phát triển vi khuẩn L sporogenes tiến hành định tính acid lactic dịch nuôi cấy L sporogenes phản ứng với thuốc thử Uffelman [15] kết luận L sporogenes có khả sinh acid lactic Trên giới, L sporogenes biết đến VK có khả sinh acid lactic [29], [30], [43], [48] Kết đạt đề tài phù hợp với nghiên cứu có khả sinh acid lactic vi khuẩn L sporogenes Kết đo nhiệt độ nóng chảy sản phẩm (mục 3.1.2- đo nhiệt độ nóng chảy sản phẩm) phù hợp với nhiệt độ nóng chảy calci lactat khan:  240oC [46] Định tính phổ hồng ngoại (IR): Kết định tính sản phẩm thu đề tài (hình 3.2 bảng 3.2) phù hợp với kết nghiên cứu có giới, phổ IR calci lactat khan bao gồm đỉnh hấp thụ mạnh đặc trưng cho liên kết O-H 35 3000 - 3500 cm-1, đỉnh hấp thụ với cường độ cao 1500 - 1750 cm-1 đỉnh hấp thụ 1300 - 1500 cm-1 đặc trưng cho nhóm chức carbonyl ion carboxylat phân tử lactat (liên kết C=O carboxylat) đỉnh hấp thụ 2950 3000 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-H [35], [45] Xác định hình thái tinh thể calci lactat khan kính hiển vi quang học: Kết thu đề tài (hình 3.3), tinh thể calci lactat khan tinh thể hình kim, màu trắng Kết hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Sun Hee Cheong [45]: Hình 3.7 Ảnh SEM tinh thể calci lactat khan nghiên cứu Sun Hee Cheong [45] Như vậy, sản phẩm thu từ thí nghiệm nuôi cấy L sporogenes muối calci lactat 3.3.2 Khảo sát lựa chọn nhiệt độ điều kiện hô hấp thích hợp cho Lactobacillus sporogenes để thu calci lactat với hiệu suất cao L sporogenes sinh trưởng phát triển phạm vi rộng nhiệt độ (3057oC), phát triển tối ưu nhiệt độ từ 30- 50oC đồng thời vi sinh vật kỵ khí tuỳ nghi, sinh trưởng phát triển điều kiện kị khí hiếu khí [15], [21], [40] Các kết đạt khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy cho L spororgenes cho thấy: dịch nuôi cấy L sporogenes môi trường MT nhiệt độ 37oC, kị khí cho kết thử định tính calci lactat (mục 3.1.2), nhiên sản phẩm calci lactat (sản phẩm kết tinh) thu Vì vậy, đề tài tiến hành thí nghiệm: Khảo sát điều kiện hô hấp: kị khí hiếu khí nuôi cấy 36 L sporogenes nhiệt độ: 37oC 50oC để thu sản phẩm calci lactat với hiệu suất cao Kết bảng số liệu thực nghiệm 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 đồ thị so sánh 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 cho thấy: Ở nhiệt độ 37oC, điều kiện hiếu khí điều kiện để nuôi cấy L sporogenes nhằm thu calci lactat với hiệu suất cao lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ điều kiện kị khí 39,29 % lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ điều kiện hiếu khí, hiệu suất tạo calci lactat điều kiện hiếu khí 46,31 %, đó, điều kiện kị khí không thu sản phẩm calci lactat kết tinh cho kết thử định tính ion lactat phương pháp hóa học (mục 3.1.2) Khác với kết nhiệt độ 37oC, nhiệt độ 50oC, điều kiện kị khí lại điều kiện để nuôi cấy L sporogenes nhằm thu calci lactat với hiệu suất cao lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ điều kiện hiếu khí 54,17 % lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ điều kiện kị khí, hiệu suất tạo calci lactat nuôi cấy L sporogenes điều kiện hiếu khí 84,53 % so với hiệu suất tạo calci lactat nuôi cấy L sporogenes điều kiện kị khí Mặc dù điều kiện hô hấp lựa chọn nhiệt độ 37oC 50oC khác thấy rõ ràng: nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy L sporogens nhằm thu calci lactat với hiệu suất cao nhiệt độ 50oC hiệu suất tạo calci lactat 50oC dù điều kiện hô hấp cao so với nhiệt độ 37oC Theo nghiên cứu Kedong Ma cộng việc sản xuất acid L(+) lactic với độ tinh khiết quang học cao từ L sporogenes, sử dụng bùn khoáng nguồn nitơ nhiệt độ thấp 37oC 45oC thuận lợi cho phát triển tế bào sản xuất acid L(+) lactic mặt thời gian lên men ngắn, nhiện hạn chế độ tinh khiết quang học sản phẩm tốn chi phí tiệt trùng môi trường trước nuôi cấy Mặt khác, nhiệt độ cao 55oC 60oC hạn chế tăng trưởng tế bào từ ảnh hưởng đến khả sinh acid lactic Tóm lại, 50oC nhiệt độ tối ưu cho phát triển tế bào sản xuất acid L(+) lactic L sporogenes [32] Kết hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu đề tài: nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy L sporogens nhằm thu calci lactat với hiệu suất cao nhiệt độ 50oC 37 Bên cạnh đó, đề tài lựa chọn điều kiện kị khí điều kiện thích hợp nuôi cấy L sporogenes để tạo calci lactat với hiệu suất cao vì: nghiên cứu tác giả T Payot, Z Chemaly, M Fick, tình trạng hiếu khí cho thấy ảnh hưởng tích cực lên tăng trưởng ảnh hưởng tiêu cực đến việc sản xuất calci lactat [41] Cũng nghiên cứu tác giả Dương Thị Huyền Trang, L sporogenes phát triển tốt nuôi cấy môi trường MRS 37oC điều kiện hiếu khí cho lượng sinh khối lớn [12] Có thể giải thích kết điều kiện hiếu khí, tức điều kiện nuôi cấy có cung cấp oxi, vi sinh vật sinh trưởng phát triển mạnh hơn, tạo nhiều sinh khối nên lượng sản phẩm calci lactat (sản phẩm bậc 2) thu chủ yếu sau pha cân hơn, lượng vi sinh vật chủ yếu dùng để tạo sinh khối Điều kiện kị khí, vi sinh vật sinh trưởng phát triển yếu hơn, nhanh chóng đạt trạng thái cân sinh nhiều calci lactat Như vậy, môi trường nuôi cấy MT 50oC điều kiện kị khí điều kiện nuôi cấy thích hợp cho L sporogens nhằm thu calci lactat với hiệu suất cao 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận: Sau thời gian thực hiện, đề tài đạt số kết sau:  Môi trường MT (bao gồm glucose, sữa bột, cao nấm men, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4 7H2O, MnSO4 H2O, FeSO4 7H2O, CaCO3, nước máy vừa đủ) môi trường nuôi cấy L sporogenes để thu calci lactat với hiệu suất cao hơn: lượng glucose mà L sporogenes tiêu thụ sử dụng môi trường MRS 28,71 % lượng glucose tiêu thụ sử dụng môi trường nuôi cấy MT  Nhiệt độ 50oC điều kiện kị khí điều kiện thích hợp cho Lactobacillus sporogenes để thu calci lactat với hiệu suất cao (94,12 %) Đề xuất: Do đề tài hạn chế để đề tài có tính ứng dụng cao hơn, xin đưa số đề xuất sau:  Tiếp tục nghiên cứu khả sinh tổng hợp acid lactic chủng Lactobacillus sporogenes để lựa chọn nồng độ glucose tối ưu cho calci lactat với hiệu suất cao  Tăng qui mô nghiên cứu, khảo sát lựa chọn nguồn nguyên liệu rẻ tiền nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để áp dụng qui mô công nghiệp sản xuất acid lactic 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Lâm Tuấn Anh (2010), Công nghệ sản xuất acid lactic, Khoá luận tốt nghiệp đại học, Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật thành phố Hồ Chí Minh Bộ Y Tế (2012), Dược điển Việt Nam, tr PL76- PL167 Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi sinh vật học phần I, tr 134-137 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1996), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr 133-138 Nguyễn Hữu Đình, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo dục, tr 27- 99 Nguyễn Đình Luyện (2015), Thực tập kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Trường đại học Dược Hà Nội, tr 44- 50 Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ vi sinh tập 2- Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr 322336 Lê Minh Phương (2016), Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy dinh dưỡng đến khả sinh acid lactic Lactobacillus acidophilus, Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Tô Ngọc Sắc (2016), Nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để tạo nguyên liệu probiotic, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Dược Hà Nội 10 Nguyễn Văn Thanh (2010), Công nghệ sinh học Dược, NXB Giáo dục, tr 100-110 11 Vũ Thị Thuận, Đỗ Trọng Hưng, cs (2012), "Nghiên cứu công nghệ thu hồi calci lactat", Nghiên cứu & Triển khai, 11, tr 39- 41 12 Dương Thị Huyền Trang (2016), Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ điều kiện hô hấp đến lượng sinh khối Lactobacillus sporogenes, Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược hà Nội 13 Nguyễn Thanh Quỳnh Trang (2015), Bước đầu khảo sát điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes, Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội 14 Nguyễn Thị Thu Trang (2014), Nghiên cứu điều chế Magie lactat phương pháp sinh tổng hợp, Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội 15 Trần Hạnh Triết (2005), Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng phát triển vi khuẩn Lactobacillus spororgenes, Khoá luận tốt nghiệp đại học, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh 16 Lê Thị Hồng Tuyết (2004), Nghiên cứu Bateriocin sản xuất Lactobacillus acidophilus NRRL B- 2092, Luận văn thạc sĩ chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh Tiếng Anh 17 Ali O Buy¨ U., Sebnem H (2004), "Batch production of L(+) lactic acid from whey by Lactobacillus casei (NRRL B-441)", Journal of Chemical Technology and Biotechnology, (79), pp 1036- 1040 18 Amer M A., Lammening A M (1983), "Health Maintenace benefits of cultured dairy product", Cultured dairy Product J, pp 18: 6- 19 19 Baron M (2009), "A patented strain of Bacillus coagulans increased immune response to viral challenge", Postgraduate Medicine, 121(2), pp 114- 118 20 Bergey D (1993), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Baltimore 21 De Clerk E., Rodriguez-Diaz M., et al (2004), "Polyphasic Characterization of Bacillus coagulans Strains, Illustrating Heterogeneity within this Species, and Emended Description of the Species", System Appl Microbiol, (27), pp 50–60 22 De Vecchi E., Drago L (2006), "Lactobacillus sporogenes or Bacillus coagulans: Misidentification or mislabeling?", International Journal of Probiotic and Prebiotics, 1(1), pp 3- 10 23 Ellen I., Gavie (1967), "The production of L(+) and D(-) lactic acid in cultures of some lactic acid bacteria, with a special study of Lactobacillus acidophilus NCDO 2", J Dairy Res, pp 31- 34 24 Endres J R., Clewell A., et al (2009), "Safety assessment of a proprietary preparation of a novel Probiotic, Bacillus coagulans, as a food ingredient", Food and Chemical Toxicology, 47, pp 1231–1238 25 Giesecke D., Stangassinger M., et al (1985), D(-)- Lactic acid- a metabolism problem, Z Ernahrungswiss pp 172 26 Hammer B W (1915), Bacteriological studies on the coagulation of evaporated milk, pp 119- 132 27 Hosono A., Yoshimura A., et al (1987), "Antimutagenic activity of cellular component of Streptococcus faecalis IFO 12965 ", Netherlands Milk and Daiary Journal, pp 41: 239- 45 28 Hui H Y., Khachatourians G G (1994), "Food Biotechnology Microorganisms", pp 249- 254 29 Hyronimus B., Le Marrec C., et al (2000), "Acid and bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria", Int J Food Microbiol, (61), pp 193– 197 30 Hyronimus B., Le Marrec C., et al (1998), "Coagulin, a bacteriocin-like inhibitory substance produced by Bacillus coagulans", Journal of Applied Microbiology, 85(1), pp 42- 50 31 Julie S., Jurenka M T (2012), "Bacillus coagulans", Alternative Medicine Review, 17(1), pp 76- 81 32 Kedong Ma T M., Huiyan Y., et al (2014), Open fermentative production of L-lactic acid with high optical purity by thermophilic Bacillus coagulans using excess sludge as nutrient, China, pp 28-35 33 Kenji S., Yutaka E (2006), "Open L-Lactic Acid Fermentation of Food Refuse Using Thermophilic Bacillus coagulans and Fluorescence In Situ Hybridization Analysis of Microflora", Journal Of Biosience And Bioengineering, 101(6), pp 457-463 34 Kozaki M., Uchimura T., et al (1992), "Experimental manual of lactic acid bacteria", pp 1-10 35 Lee Y K., Kim S D (2003), " Preparation and characteristics of calcium lactate from black snail", Nutraceuticals Food, 8, pp 166- 172 36 Lidan Y., Xingding Z., et al (2013), "Highly efficient production of Llactic acid from xylose by newly isolated Bacillus coagulans C106", (132), pp 38- 44 37 Majeed M., Prakash L (1998), "LactoSpore®: The Effective Probiotic" 38 Mandel R D., Eichas K., et al (2010), "Bacillus coagulans: a viable adjunct therapy for relieving symptoms of rheumatoid arthritis according to a randomized, controlled trial", BMC Complementary and Alternative Medicine 10, pp 1- 39 Mark S O., Lonnie O I., et al (2011), "L(+)- lactic acid production from non- food carbohydrates by thermotolerant Bacillus coagulans", J Ind Microbiol Biotechnol (38), pp 599- 605 40 Marshall R., Beers R J (1967), "Growth of Bacillus coagulans in Chemically Defined Media", Journal of Bacteriology, 94(3), pp 517– 521 41 Payot T., Chemaly Z., et al (1998), "Lactic acid production by Bacillus coagulans- Kinetic studies and optimization of culture medium for batch and continuous fermentations", Enzyme and Microbial Technology 24, pp 191-199 42 Pelczar J M., J Chan E C S., et al (1993), "Microbiology concepts and applications", pp 873- 874 43 Rhee Mun S., Brélan E M., et al (2011), "Complete Genome Sequence of a thermotolerant sporogenic lactic acid bacterium, Bacillus coagulans strain 36D1", Standards in Genomic Sciences 5, pp 331-340 44 Rosemarie M., Beers R J (1967), "Growth of Bacillus coagulans in Chemically Defined Media", Journal of Bacteriology, 94(3), pp 517521 45 Sun Hee C (2016), "Physicochemical Properties of Calcium Lactate Prepared by Single-Phase Aragonite Precipitated Calcium Carbonate", Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 7(1), pp 1786 46 The Merck Index (1996), America 47 Thorne Research (2002), "Lactobacillus Sporogenes Monograph ", Alternative Medicine Review, 7(4), pp 340- 342 48 Tiina Michelson K K., Eerik J., et al (2006), L(+)-Lactic acid producer Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 and its comparison with Lactobacillus delbrueckii ssp lactis DSM 20073, pp 861- 867 49 Wassewar K L (2005), Separation of Lactic acid, pp 159- 172 50 Young Jung W., Jin Nam K., et al (2006), Biotechnological Production of Lactic Acid and Its Recent Applications, Korea, pp 1-4 51 Yuan Kun L., Koji N., et al (1999), Handbook of Probiotics, John Wiley & Sons PHỤ LỤC Bảng xác định đường theo phương pháp Schoorl- Regenbogen Tiêu thụ Na2S2O3 0,1N (ml) Glucose (mg) 3,2 Tiêu thụ Na2S2O3 0,1N (ml) 13 Tiêu thụ Na2S2O3 0,1N (ml) 42,4 3,1 6,3 3,4 14 45,8 3,1 9,4 3,5 15 49,3 3,2 12,6 3,5 16 52,8 3,3 15,9 3,5 17 56,3 3,3 19,2 3,5 18 59,8 3,2 22,4 3,5 19 63,3 3,2 25,6 3,6 20 66,9 3,3 28,9 3,8 21 70,7 3,4 10 32,3 3,8 22 74,5 3,4 11 35,7 4,0 23 78,5 3,4 12 39,0 4,1 24 82,6 3,4 4,0 25 86,6 ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HÀ Mã sinh viên: 1201150 KHẢO SÁT KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐIỀU KIỆN HÔ HẤP ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ACID LACTIC CỦA Lactobacillus sporogenes KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... cấy Lactobacillus sporogenes để sinh acid lactic với hiệu suất cao - Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ điều kiện hô hấp đến khả sinh acid lactic Lactobacillus sporogenes CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Acid lactic. .. trọng việc gia tăng sinh khối sinh acid lactic  Nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển VK sinh acid lactic Khoảng nhiệt độ phát triển VK sinh acid lactic rộng Một số loài