BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME ULVAN LYASE THU TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN Giảng viên hướng dẫn : Th.s Lê Nhã Uyên TS Huỳnh Hoàng Như Khánh Sinh viên thực : Võ Thị Như Phương Mã số sinh viên : 55131398 Khánh Hòa: 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME ULVAN LYASE THU TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN GVHD: Th.s Lê Nhã Uyên TS Huỳnh Hoàng Như Khánh SVTH: Võ Thị Như Phương MSSV: 55131398 Khánh Hòa, tháng 6/2017 i LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận án tốt nghiệp này, em nhận nhiều quan tâm giúp đỡ quý báu thầy cô, ban lãnh đạo anh chị trước Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Môi trường, trường Đại học Nha Trang tận tình giảng dạy, truyền đạt kĩ chuyên ngành kiến thức xã hội suốt năm em theo học trường Đó tảng vững để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp hành trang quý giá để em vượt qua khó khăn tương lai Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành đến TS Huỳnh Hoàng Như Khánh công tác Viện Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang Ths Lê Nhã Uyên công tác trường Đại học Nha Trang tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tạo điều kiện tốt để em hoàn thành đồ án Tiếp theo, em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Công Nghệ Nha Trang, trưởng phòng Công Nghệ Sinh Học Biển toàn thể Cô chú, Anh chị công tác tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian em thực luận án Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn bạn bè, đặc biệt gia đình người thân quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn động viên, giúp đỡ em tinh thần lẫn vật chất suốt trình em học tập thực đồ án tốt nghiệp Nha Trang, tháng năm 2017 Sinh viên Võ Thị Như Phương ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl LDL-cholesterol : low-density lipoprotein-cholesterol HDL-cholesterol : high-density lipoprotein-cholesterol TG : Triglyceride TTHĐ : Trung tâm hoạt động iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 RONG BIỂN 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển 1.1.2 Phân loại phân bố rong biển .4 1.1.3 Thành phần hóa học có rong biển 1.2 ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN 1.3 ULVAN 1.3.1 Giới thiệu chung ulvan .8 1.3.2 Cấu trúc tính chất hóa học ulvan 1.3.3 Phương pháp tách chiết ulvan từ rong lục 12 1.3.4 Hoạt tính sinh học ứng dụng ulvan 13 1.4 ULVAN LYASE 17 1.4.1 Giới thiệu chung enzyme 17 3.1.2 Tình hình nghiên cứu ulvan lyase giới 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 2.1.1 Hóa chất, thiết bị 23 2.1.2 Cơ chất ulvan từ rong Ulva lactuca 24 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu .24 iv 2.2 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT 25 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Phương pháp tách chiết enzyme từ động vật thân mềm biển 26 2.3.2 Phương pháp sắc ký lọc gel 27 2.3.3 Phương pháp kết tủa protein muối (NH4)2SO4 28 2.3.4 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford (1976) 29 2.3.5 Xác định hoạt tính ulvan lyase phương pháp Nelson-Somogyi cải tiến (1989) 29 2.3.6 Phương pháp tách chiết thu nhận enzyme từ mẫu vọp Geloina cooaxans .31 2.3.7 Phương pháp nghiên cứu đặc tính xúc tác enzyme .32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .34 3.1 KẾT QUẢ DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 34 3.2 KẾT QUẢ DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN D-RHAMNOSE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NELSON SOMOGYI CẢI TIẾN, 1989 34 3.3 KẾT QUẢ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ULVAN LYASE TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN 35 3.4 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN ENZYME TỪ VỌP Geloina coaxans .42 3.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ULVAN LYSAE TỪ DỊCH CHIẾT GAN TỤY VỌP Geloina coaxans .43 3.5.1 pH tối ưu 43 3.5.2 Nhiệt độ tối ưu 45 3.5.3 Thời gian ủ tối ưu 46 3.5.4 Ảnh hưởng cation kim loại 47 3.5.5 Độ bền nhiệt .48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .52 v KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thống kê hóa chất thiết bị nghiên cứu 23 Bảng 3.1: Thông tin thời gian, địa điểm thu mẫu hình ảnh 15 mẫu động vật thân mềm biển sử dụng nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ulvan lyase .36 Bảng 3.2: Khối lượng gan tụy dịch chiết enzyme thô thu 15 mẫu động vật thân mềm biển dùng cho giai đoạn sàng lọc 39 Bảng 3.3: Hàm lượng protein giá trị OD bước sóng 750nm 15 mẫu động vật thân mềm biển 40 Bảng 3.4: Ảnh hưởng cation kim loại đến hoạt tính ulvan lyase từ vọp Geloina coaxans .48 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tỉ lệ khai thác chi ngành rong Lục để tách chiết loại polysaccharide sulfate hóa .8 Hình 1.2: Cấu trúc disaccharide lặp lại phân tử ulvan tách chiết từ rong Ulva sp Hình 1.3: Phương trình Michaelis- Menten 19 Hình 2.1: Rong Ulva lactuca 24 Hình 2.2: Vọp Geloina coaxans .25 Hình 2.3: Quy trình nghiên cứu tổng quát 25 Hình 2.4: Phương pháp tách chiết enzyme từ động vật thân mềm biển .26 Hình 2.5: Sơ đồ sắc ký lọc gel 28 Hình 2.6: Phương pháp tách chiết thu nhận enzyme từ mẫu vọp Geloina cooaxans .31 Hình 3.1: Đồ thị phương trình đường chuẩn protein (BSA) .34 Hình 3.2: Đồ thị phương trình đường chuẩn D-rhamnose 35 Hình 3.3: Biểu đồ thể hoạt tính ulvan lyase 15 mẫu động vật thân mềm biển 41 Hình 3.4: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính ulvan lyase 44 Hình 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính xúc tác ulvan lyase 46 Hình 3.6: Ảnh hưởng thời gian thực phản ứng đến hoạt tính ulvan lyase 47 Hình 3.7: Kết khảo sát độ bền nhiệt ulvan lyase 4oC 49 Hình 3.8: Kết khảo sát độ bền nhiệt ulvan lyase 30oC 50 Hình 3.9: Độ bền nhiệt ulvan lyase 45oC 51 Hình 3.10: Độ bền nhiệt ulvan lyase 60oC 51 MỞ ĐẦU Đất nước ta sở hữu đường bờ biển dài 3260 km trải dài từ Bắc tới Nam diện tích biển vô rộng lớn, nhiều đầm phá, vũng vịnh Thêm vào đó, điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa giúp Việt Nam trở thành quốc gia có đa dạng sinh vật biển bật Thế giới Trong đó, không nói đến đa dạng Rong- báu vật mà thiên nhiên ban tặng có chứa nhiều polysaccharide sinh học quý tính ứng dụng cao alginate, polymanuronic acid, laminaran, fucoidan …, đặc biệt ulvan Ulvan polysaccharide tan nước tìm thấy thành tế bào rong Lục, chúng chiếm khoảng 8-29% trọng lượng rong khô [43] Thành phần chủ yếu cấu tạo nên phân tử ulvan gốc đường rhamnose, xylose, acid iduronic, acid glucuronic, gốc sulfate hóa; số loài rong Lục Codium, người ta tìm thấy lượng đáng kể sulfate galactan [18] Điều chứng tỏ cấu trúc ulvan phức tạp cấu trúc chung cố định cho ulvan chiết xuất từ loại rong khác Mặc dù cấu trúc hóa học đa dạng phức tạp, song ulvan lại thể nhiều hoạt tính sinh học quý kháng u, kháng ung thư, kích thích miễn dịch, chống đông máu, chống oxi hóa, giảm cholesterol,… [31, 47, 48, 50, 73, 75] Ngành rong Lục (Chlorophyta) xem ngành lớn, số lượng loài đa dạng phong phú Đến nay, toàn Thế giới biết khoảng 500 chi 8000 loài Phần lớn chúng sống nước (chiếm đến 90%) 10% lại sống nước mặn [11] Với diện tích mặt nước rộng 1.000.000 km2 với điều kiện tự nhiên thuận lợi, Việt Nam thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong Lục đa dạng phong phú Tuy nhiên nước ta, việc khai thác sản xuất chưa phát huy hết tiềm năng, giá trị kinh tế giá trị dược lý polysaccharide có loài rong này, đặc biệt ulvan Mặc dù có nhiều hoạt tính sinh học quý phức tạp cấu trúc hóa học chưa nghiên cứu rõ ràng trở ngại lớn để ulvan ứng dụng rộng rãi y dược Do mà muốn nghiên cứu loại enzyme có khả phân cắt mạch phân tử ulvan nhằm: - Thứ nhất: sử dụng ulvan lyase công cụ góp phần làm sáng tỏ cấu trúc phân tử polysaccharide 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau hoàn thành nghiên cứu đúc kết thu kết luận sau: 1) Sau giai đoạn sàng lọc, kết thu 14 mẫu có hoạt tính thủy phân ulvan, chiếm tỉ lệ 93% tổng số mẫu nghiên cứu; 28% có hoạt tính thủy phân ulvan mạnh, chủ yếu loài thuộc lớp Hai mảnh vỏ Bivalvia thu vịnh Nha Trang 2) Qua trình sàng lọc, nhận thấy Geloina coaxans (mẫu số 10) loài có hoạt tính thủy phân ulvan mạnh, phổ biến vịnh Nha Trang, số lượng mẫu đủ lớn, việc tách chiết gan tụy dễ dàng thuận lợi nên chọn làm đối tượng để tiếp tục tiến hành nghiên cứu đặc tính xúc tác ulvan lyase 3) Kỹ thuật sắc ký lọc gel, kết tủa muối trung tính thẩm tách màng Cellophane kỹ thuật sử dụng tinh ulvan lyase tách chiết từ gan tụy vọp Geloina coaxans Đây kỹ thuật sử dụng tinh protein nói chung 4) Kết nghiên cứu đặc tính xúc tác ulvan lyase từ Geloina coaxans thu sau: - pH tối ưu: khoảng pH tối ưu ulvan lyase từ Geloina coaxans nằm khoảng acid yếu đến trung tính, hoạt tính mạnh giá trị pH 5.5 - Nhiệt độ tối ưu: ulvan lyase từ Geloina coaxans thể hoạt tính tốt nhiệt độ 45oC Khoảng nhiệt độ mà enzyme hoạt động tốt từ 40-45oC - Thời gian ủ tối ưu: sau giờ, sản phẩm đường khử sau thủy phân ulvan lyase đạt cực đại, không tiếp tục tăng giữ mức ổn định sau Vì kết luận khoảng thời gian thời gian ủ tối ưu cho phản ứng thủy phân ulvan ulvan lyase từ Geloina coaxans - Độ bền nhiệt: ulvan lyase từ Geloina coaxans hoàn toàn hoạt tính sau ngày 30oC, sau 15 45oC sau 10 phút 60oC Ở 4oC, sau 30 ngày hoạt tính enzyme giảm khoảng 20% Có thể thấy enzyme bền nhiệt Điều cho phép dự đoán cấu trúc hóa học chặt chẽ ulvan lyase thu từ Geloina coaxans 53 - Ảnh hưởng cation kim loại: kết nghiên cứu cho thấy enzyme ulvan lyase thu từ Geloina coaxans enzyme hoạt động không phụ thuộc kim loại thể 99,5% hoạt tính dung dịch EDTA, hoạt tính enzyme kích thích nhẹ có mặt ion Ca2+ (108.4%) Mg2+ (109.2%) so với hoạt tính môi trường dung dịch đệm mặt cation kim loại 100%, đặc biệt enzyme kích thích mạnh có mặt ion lim loại nặng Cu2+ (111.1%), Zn2+ (114.4%), Pb2+ (120%) mạnh Fe2+ (133.5%) KIẾN NGHỊ Lần giới, ulvan lyase có nguồn gốc từ động vật biển nghiên cứu Đây tiền đề cho việc phát triển thu nhận enzyme thủy phân ulvan từ nguồn tiềm – động vật biển Việc nghiên cứu loại enzyme góp phần làm sáng tỏ cấu trúc ulvan- làm sở cho việc đưa ulvan ứng dụng rộng rãi lĩnh lực y sinh học dược phẩm, phát huy hoạt tính sinh học quí chúng, ứng dụng việc điều chế loại oligosaccharide từ loại polysaccharide quí Đây tính luận án so với nghiên cứu lĩnh vực nước giới Vì thời gian thực đề tài hạn hẹp, tiến hành thêm nhiều nghiên cứu sâu enzyme ulvan lyase từ vọp Geloina coaxans, có số kiến nghị sau: 1) Có thêm nghiên cứu sâu cấu trúc hóa học trình tự amino acid, trình từ gen mã hóa loại enzyme kĩ thuật sinh học phân tử, tạo tiền đề cho việc sản xuất enzyme kĩ thuật di truyền, tổng hợp bán tổng hợp để ứng dụng hiệu xúc tác sinh học biển vào thực tế 2) Kết nghiên cứu luận án kết giới enzyme ulvan lyase từ động vật thân mềm biển Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu tinh thu nhận nhiều enzyme thủy phân ulvan từ sinh vật biển 3) Có thêm nhiều nghiên cứu hoạt tính sinh học oligo ulvan từ việc thủy phân loại enzyme Từ đó, tạo sở cho việc ứng dụng ulvan lyase sản phẩm thủy phân chúng vào sống, tận dụng nguồn tài nguyên biển quý giá Việt Nam 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Huỳnh Hoàng Như Khánh, Cao Thị Thúy Hằng, Bùi Minh Lý, Lê Quang Huấn, Ngô Thị Duy Ngọc, Phan Thị Hoài Trinh, et al Sự phân bố điều kiện xúc tác β1,3-glucanase động vật không xương sống biển Việt Nam Tạp chí Khoa học Công Nghệ 2015;53(2):139-46 Huỳnh Hoàng Như Khánh Nghiên cứu sàng lọc đặc tính O-glycoside hydrolase từ động vật không xương biển Việt Nam Luận án tiến sĩ sinh học 2016; Trang:77-100 Nguyễn Hoàng My Phát triển ngành rong biển Việt Nam Tạp chí thông tin Khoa học Công nghệ 2016;9 Từ Thị Hoàng My Khảo sát enzyme thủy phân polysaccharide rong nâu từ động vật không xương sống biển Đồ án tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Nha Trang 2016;Trang:44-5 Nguyễn Hữu Đại, Phạm Hữu Trí, Nguyễn Xuân Vỵ Thành phần loài nguồn lợi rong biển, cỏ biển đảo Phú Quý( Cù Lao Thu), Bình Thuận Tuyển Tập Nghiên Cứu Biển 2009;16:225-43 Nguyễn Hữu Dinh, Huỳnh Quang Năng Nguồn lợi rong biển Việt Nam Tạp chí Sinh học 1998 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng Hóa sinh học NXB giáo dục 2007 Trang 12634 Lê Thị Thủy Giáo trình Rong biển ứng dụng đời sống Bộ môn Y sở II Đàm Đức Tiến Nguồn lợi rong biển quần đảo Trường Sa Viện Nghiên cứu hải sản 2015 10 Đàm Đức Tiến Thành phần loài phân bố rong biển vùng triều ven biển số tỉnh từ Quảng Ninh đến Quảng Bình Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 2016;32(2):58-64 11 Nguyễn Văn Tiến Thực vật chí Việt Nam NXB khoa học kĩ thuật.2007 Trang 4-14 55 12 Nguyễn Văn Tú, Lương Đức Thiện Đặc điểm sinh thái học phân bố rong Ulva intestinalis Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh Hội nghị toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 2014;Trang:1778 13 Nguyễn Văn Tú Sự biến động rong biển kinh tế theo mùa vụ Bãi Nò, Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang Tạp chí sinh học 2013;35: 34-40 Tài liệu tiếng Anh: 14 Alves A, Duarte A.R.C, Mano J.F, Sousa R.A, Reis R.L J PDLLA enriched with ulvan particles as a novel 3D porous scaffold targeted for bone engineering Supercrit Fluids 2012; 65: 32–8 15 Alves A, Pinho E.D, Neves N.M, Sousa R.A, Reis R.L Processing ulvan into 2D structures: Cross-linked ulvan membranes as new biomaterials for drug delivery applications Int J Pharm 2012.; 426:76–81 16 BarbeyronT, Lerat Y, Sassi J.F, Le Panse S, Helbert W, Collen P.N Ulvan lyases isolated from the Flavobacteria Persicivirga ulvanivorans are the first members of a new polysaccharide lyase family J Biol Chem 2011;286(49):42063-71 17 Barros A.A.A, Alves A, Nunes C, Coimbra M.A, Pires R.A, Reis R.L Carboxymethylation of ulvan and chitosan and their use as polymeric components of bone cements Acta Biomater 2013;9:9086–97 18 Bilan M.I, Vinogradova E.V, Shashkov A.S, Usov A.I Structure of a highly pyruvylated galactan sulfate from the Pacific green alga Codium yezoense (Bryopsidales, Chlorophyta) Carbohydr Res 2007;342:586–96 19 Brading J.W.E, Georg-Plant M.M.T, Hardy D.M The polysaccharide from the alga Ulva lactuca Purification,hydrolysis, and methylation of the polysaccharide J Chem Soc 1954:319–24 20 Brading J.W.E, Georg-Plant M.M.T, Hardy D.M The polysaccharide from the alga Ulva lactuca Purification, hydrolysis, and methylation of the polysaccharide J Chem Soc 1954.:319–24 21 Carpenter K.E, Niem V.H FAO species identification guide for fishery purposes In the living marine resources of the Western Central Pacific Seaweeds, corals, bivalves and gastropods, Rome, FAO 1998;1:1-686 22 Cassolato J.E.F, Noseda M.D, Pujol C.A, Pellizzari F.M, Damonte E.B, Duarte M.E.R Chemical structure and antiviral activity of the sulfated heterorhamnan 56 isolated from the green seaweed Gayralia oxysperma Carbohydr Res 2008.;343:3085–95 23 Covis R, Vives T, Gaillard C, Benoit M, Benvegnu T Interactions and hybrid complex formation of anionic algal polysaccharides with a cationic glycine betainederived surfactant Carbohydr Polym 2015;121:436–48 24 Cunha L, Grenha A Sulfated seaweed polysaccharides as multifunctional materials in drug delivery applications Marine drug 2016;12(42):2-27 25 Dash M, Sangram K.K, Bartoli C, Morelli A, Smet P.F, Dubruel P, et al Biofunctionalization of ulvan scaffolds for bone tissue engineering ACS Appl Mater Interfaces 2014.(6): 3211–8 26 Domozych D.S., Kiemle S.N, Domozych C.R, Sorensen I, Willats W.G, Gretz M.R Differential occurrence of land plant extracellular polysaccharides in the charophycean green algae and implications for plant evolution J Phycol 2007; 43,:27–8 27 Percival E The polysaccharides of green, red and brown seaweeds: Their basic structure, biosynthesis and function Br Phycol J 1979;14:103–17 28 Fernández P.V, Ciancia M, Miravalles A.B, Estevez J.M Cell wall polymer mapping in the coenocyticmacroalga Codium vermilara J Phycol 2010;46:456–65 29 Frederick GIII, Carol AC, Terry LH Adaptation of the Nelson-Somogyi reducingsugar Assay to a microassay using microtiter plates Analytical Biochemistry 1989;182:197-9 30 Grauffel V, Kloareg B, Mabeau S, Durand P, Jozefonvicz J New natural polysaccharides with potent antithrombic activity: Fucans from brown algae Biomaterials 1989;10.: 363–8 31 Hassan S, Abd El-Twab S, Hetta M, Mahmoud B Improvement of lipid profile and antioxidant of hypercholesterolemic albino rats by polysaccharides extracted from the green alga Ulva lactuca Linnaeus Saudi J Biologic Sci 2011;18:333–40 32 Haug A, Scand B The influence of borate and calcium on the gel formation of a sulfated polysaccharide from Ulva lactuca Acta Chem 1976;30:562–6 33 Hayakawa Y, Hayashi T, Lee J.B., Srisomporn P, Maeda M, Ozawa T, et al Inhibition of thrombin by sulfated polysaccharides isolated from green algae Biochim BiophysActa 2000;1543:86–94 57 34 Hernández-Garibay E, Zertuche-González J.A, Pacheco-Ruíz I Isolation and chemical characterization of algal polysaccharides from the green seaweed Ulva clathrata (Roth) C Agardh J Appl Phycol 2011; 23:537–42 35 Huimin Q, Tingting Z, Quanbin Z, Zhien L, Zengqin Z, Ronge X l Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa Kjellm (Chlorophyta) J Appl Phycol 2005;17:527–34 36 Huynh Hoang Nhu Khanh, Bui Minh Ly, Le Quang Huan, Mikhail Kusaykin, Yu V Dubrovskaya, Cao Thi Thuy Hang, et al Screening of O-Glycoside hydrolase from Vietnam marine invertebrates Tạp chí Công nghệ Sinh học 2013;11(2):275-83 37 Ivanova V, Rouseva R, Kolarova M, Serkedjieva J, Rachev R, Manolova N Isolation of a polysaccharide with antiviral effect from Ulva lactuca Prep Biochem 1994;24:83–97 38 Jiao G, Yu G, Zhang J, Stephen S.H Chemical tructures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae Mar Drugs 2011;9:196-210 39 Kaeffer B, Benard C, Lahaye M, Blottiere H.M, Cherbut C Biological properties of ulvan, a new source of green seaweed sulfated polysaccharides, on cultured normal and cancerous colonic epithelial tells Planta Med 1999;65:527–31 40 Kanno K, Akiyoshi K, Nakatsuka T, Watabe Y, Yukimura S, Ishihara H, et al Biocompatible hydrogel from a green tide-forming chlorophyta J Sustain Dev 2012;5:38–45 41 Kumagai Y, Ojima T Enzymatic properties and the primary structure of a β-1,3glucanase from the digestive fluid of the Pacific abalone Haliotis discus hannai Comparative Biochemistry and Physiology 2009;Part B(154):113–20 42 H Kylin Zur Biochemie der Meeresalgen Hoppe-Seyler’sZ Z Physiol Chem 1913;83:171 - 97 43 Lahaye M, Robic A Structure and function properties of Ulvan, a polysaccharide from green seaweeds Biomacromolecules 2007;8:1765–74 44 Lahaye M, Brunel M, Bonnin E Fine chemical structure analysis of oligosaccharides produced by an ulvan-lyase degradation of the water-soluble cellwall polysaccharides from Ulva sp (Ulvales, Chlorophyta) Carbohydr Res 1997;304:325–33 58 45 Lahaye M, Axelos M.A.V Gelling properties of water-soluble polysaccharides from proliferating marine green seaweeds (Ulva spp) Carbohydr Polym 1993;22:261–5 46 Lahaye M, Ray B, Baumberger S, Quemener B, M.A.V Axelos Chemical characterisation and gelling properties of cell wall polysaccharides from species of ulva (Ulvales, Chlorophyta) Hydrobiologia 1996;326:473–80 47 Leiro J.M, Castro R, Arranz J.A, Lamas J Immunomodulating activities of acidic sulphated polysaccharides obtained from the seaweed Ulva rigida C Agardh Int Immunopharmacol 2007;7:879-88 48 Li B, Liu S, Xing R, Li K, Li R, Qin Y , et al Degradation of sulfated polysaccharides from Enteromorpha prolifera and their antioxidant activities Carbohydr Polym 2013;92:1991–6 49 Yanomoto M Physicochemical studies on sulfated polysaccharides extracted from seaweeds at various temperatures Agric Biol Chem 1980;44.:589–93 50 Mao W, Zang X, Li Y, Zhang H Sulfated polysaccharides from marine green algae Ulva conglobata and their anticoagulant activity J Appl Phycol 2006;18:9-14 51 Mauray S, Sternberg C, Theveniaux J, Millet J, Sinquin C, Tapon-Bretaudiere J, et al Venous antithrombotic and anticoagulant activities of a fucoidan fraction Thromb Haemost 1995.;74.:1280–5 52 Melcher R.L, Neumann M, Fuenzalida Werner JP, Gröhn F, Moerschbacher BM Revised domain structure of ulvan lyase and characterization of the first ulvan binding domain Scientific Reports 2017; 53 Merrill J.E, Waaland J.R The seaweed resources of the United State of America In: Seaweed resources of the world JICA 1998:303-23 54 Michael A McDonougha, Renuka Kadirvelraja, Pernille Harrisa, Jens-Christian N Poulsena, Sine Larsena Rhamnogalacturonan lyase reveals a unique three-domain modular structure for polysaccharide lyase family FEBS Letters 2004 565(1– 3):188–94 55 Bradford MM A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding Analytical Biochemistry 1976;72:248-54 59 56 Nyvall C P, Sassi J.F, Rogniaux H, Marfaing H, Helbert W Ulvan lyases isolated from the Flavobacteria Persicivirga ulvanivorans are the first members of a new polysaccharide lyase family J Biol Chem 2011;286(49):63-71 57 Ohno M, A T Critchley Seaweed cultivation and marine ranching Bull Mar Sci Fish 1997 58 Osama M.A, Rasha R.A Anti-proliferative and apoptotic efficacies of ulvan polysaccharides against different types of Carcinoma cells in vitro Journal of Cancer Science Therapy 2014;6: 202–8 59 Paradossi G, Cavalieri F, Pizzoferrato L, Liquori A.M A physico-chemical study on the polysaccharide ulvan from hot water extraction of the macroalga Ulva Int J Biol Macromol 1999;25:309–15 60 Pengzhan Y, Ning L, Xiguang L, Gefei Z, Quanbin Z, Pengcheng L Antihyperlipidemic effects of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta) Pharmacol Res 2003;48:543–9 61 Percival E, Wold J.K The acid polysaccharide from the green seaweed Ulva lactuca Part II The xite of the ester sulphate J Chem Soc 1963:5459–68 62 Pereira M.S, Mulloy B, Mourao P.A.S Structure and anticoagulant activity of sulfated fucans Comparison between the regular, repetitive, and linear fucans from echinoderms with the more heterogeneous and branched polymers from brown algae J Biol Chem 1999;274:7656–67 63 Qi H, Huang L, Liu X, Liu D, Zhang Q, Liu S Antihyperlipidemic activity of high sulfate content derivative of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta) CarbohydrPolym 2012; 87: 1637–40 64 Qi H, Liu X, Ma J, Zhang Q, Li Z In intro antioxidant activity of acetylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Cholorophta) J Med Plants Res 2010;4:2445–51 65 Qi H, Liu X, Zhang J, Duan Y, Wang X, Zhang Q Synthesis and antihyperlipidemic activity of acetylated derivative of ulvan from Ulva pertusa Int J Biol Macromol 2012;50:270–2 66 Qi H.M, Zhang Q.B, Zhao T.T, Chen R, Zhang H, Niu X.Z, et al Antioxidant activity of different sulfate content derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta) in vitro Int J Biol Macromol 2005;37:195–9 60 67 Qi H.M, Zhao T.T, Zhang Q.B, Li Z, Zhao Z.Q, Xing R Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa Kjellm (Chlorophyta) J ApplPhycol 2005;17: 527–34 68 Rahimi F, Tabarsa M, Rezaei M Ulvan from green algae Ulva intestinalis: optimization of ultrasound- assisted extraction and antioxidant activity Joumal of Applied Phycology 2016;28 (5):2979-84 69 Robic A, Bertrand D, Sassi J.F, Lerat Y, Lahaye M Determination of the chemical composition of ulvan, a cell wall polysaccharide from Ulva spp (Ulvales, Chlorophyta) by FT-IR and chemometrics J Appl Phycol 2009;21:451–6 70 Robic A, Sassi J.F, Dion P, Lerat Y, Lahaye M Seasonal variability of physicochemical and rheological properties of ulvan in two Ulva species (chlorophyta) from the Brittany coast J Phycol 2009; 45:962–73 71 Robic A, Sassi J.F, Lahaye M Impact of stabilization treatments of the green seaweed Ulva rotundata (Chlorophyta) on the extraction yield, the physico-chemical and rheological properties of ulvan Carbohydr Polym 2008; 74:344–52 72 Robic A., Gaillard C, Sassi J.F, Leral Y, Lahay M Ultrastructure of ulvan: A polysaccharide from green seaweeds Biopolymers 2009;91:652–64 73 Shao P, Chen X, Sun P In vitro antioxidant and antitumor activities of different sulfated polysaccharides isolated from three algae Int J LifeSc Bt & Pharm Res 2013;62:155-61 74 Tabarsa M, Han J.H, Kim C.Y, You S.G Molecular characteristics and immunomodulatory activities of water-soluble sulfated polysaccharides from Ulva pertusa J Med Food 2012; 15:135–44 75 Teng Z, Qian L, Zhou Y Hypolipidemic activity of the polysaccharides from Enteromorpha prolifera Int J Biol Macromol 2013;62:254–6 76 Vaquez-Freire M.J, Lamela M, Calleja J.M Hypolipidaemic activity of a polysaccharide extract from Fucus vesiculosus Phytother Res 1996;10: 647–50 77 Wang L, Wang X, Wu H, LiuR Overview on Biological Activities and Molecular Characteristics of Sulfated Polysaccharides from Marine Green Algae in Recent Years Mar Drugs 2014;12:4985-5010 61 78 Wang X, Zhang Z, Yao Z, Zhao M, Qi H Sulfation, anticoagulant and antioxidant activities of polysaccharide from green algae Enteromorpha linza Int J Biol Macromol 2013; 58:225–30 79 Wong T.Y, Preston L.A, Schiller N.L ALGINATE LYASE: review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and applications Annu Rev Microbiol 2000;54:289-340 80 Yaich H, Garna H, Besbes S, Barthélemy J.-P, Paquot M, Blecker C, et al Impact of extraction procedures on the chemical, rheological and textural properties of ulvan from Ulva lactuca of Tunisia coast Food Hydrocoll 2014;40:53–63 81 Zakharenko A.M, Kusaykin M.I, Ly B.M, Huyen P.V, Khanh H.H.N, Sova V.V, et al Catalytic properties of endo-1,3-β,D-glucanase from the Vietnamese edible mussel Perna viridis Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2008;35:54–61 82 Zhang Z, Wang X, Yu S, Yin L., Zhao M, Han Z Synthesized oversulfated and acetylated derivatives of polysaccharide extracted from Enteromorpha linza and their potential antioxidant activity Int J Biol Macromol 2011; 49:1012–5 Nguồn Internet: 83 www.cazzy.org/polysaccharide-lyase PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp pha dung dịch thuốc thử Nelson A, B, C  Chuẩn bị thuốc thử Nelson A: - Na2CO3 : 25g - KNaC4H8O6.4H2O : 23g - NaHCO3 : 20g - Na2SO4 : 20g Định mức đủ lít  Chuẩn bị thuốc thử Nelson B: CuSO4.5H2O 15% H2SO4 : 1-2 giọt Định mức đủ 100ml  Chuẩn bị thuốc thử Nelson C: - Dung dịch 1: + NH4Mo7O24.4H2O : 33g + H2 O : 600ml - Dung dịch 2: + Na2HAsO4 : 9.4g + H2 O : 50ml Trộn dung dịch thêm 42 ml H2SO4 đậm đặc, định mức đủ lít, đặt 37oC 1-2 ngày trước sử dụng Phụ lục 2: Bảng số liệu dựng đường chuẩn protein phương pháp Bradford Giá trị OD (A= 595nm) [BSA] (μg/ml) 20 40 60 80 100 120 Lần Lần Lần Trung bình 0,01 0,123 0,195 0,239 0,311 0,336 0,044 0,151 0,18 0,264 0,301 0,394 0,052 0,126 0,196 0,262 0,307 0,354 0,000 0,035 0,133 0,190 0,255 0,306 0,361 Phụ lục 3: Bảng số liệu dựng đường chuẩn D-Rhamnose phương pháp Nelson Somogyi cải tiến, 1989 Giá trị OD (A=750nm) Lần Lần Lần Trung bình 0 0,000 20 0,046 0,047 0,056 0,050 40 0,432 0,435 0,457 0,441 60 0,58 0,569 0,587 0,579 80 0,706 0,739 0,709 0,718 100 0,876 0,864 0,863 0,868 120 1,163 1,13 1,151 1,148 140 1,42 1,345 1,391 1,385 160 1,581 1,504 1,516 1,534 180 1,888 1,885 1,893 1,889 200 1,945 1,977 1,986 1,969 [Rhamnose] (μg/ml) Phụ lục 4: Bảng số liệu kết khảo sát pH ulvan lyase Giá trị OD (A=750nm) Ống Ống Ống Trung bình Độ lệch chuẩn 0 0,000 0,000 0,415 0,413 0,599 0,476 0,107 4,5 0,982 1,157 1,177 1,105 0,107 1,256 1,372 1,568 1,399 0,158 5,5 1,696 1,672 1,566 1,645 0,069 1,509 1,504 1,388 1,467 0,068 1,429 1,35 1,526 1,435 0,088 1,068 1,099 0,963 1,043 0,071 0,902 0,951 1,162 1,005 0,138 10 0 0,000 0.000 pH Phụ lục 5: Bảng số liệu kết khảo sát nhiệt độ xúc tác tối ưu ulvan lyase Giá trị OD (A=750nm) Nhiệt độ( C) o 10 20 30 37 45 50 60 70 Ống Ống Ống Trung bình Độ lệch chuẩn 0 0,276 0,769 1,441 1,769 1,313 0,901 0 0,437 0,689 1,283 1,696 1,537 1,091 0,000 0,000 0,346 0,591 1,183 1,655 1,109 0,839 0,000 0,000 0,000 0,177 0,089 0,158 0,138 0,114 0,096 0,000 0,630 0,592 1,126 1,501 1,393 1,013 Phụ lục 6: Bảng số liệu kết khảo sát thời gian phản ứng tối ưu ulvan lyase Giá trị OD (A=750nm) Thời gian (phút) 10 15 20 30 60 90 120 180 240 360 540 720 900 1080 Ống Ống Ống Trung bình Độ lệch chuẩn 0,013 0,134 0,229 0,471 0,803 1,235 1,442 1,947 1,945 1,947 1,946 1,920 1,939 1,946 0,010 0,171 0,129 0,374 0,819 1,174 1,346 1.915 1,945 1,945 1,954 1,929 1,960 1,933 0,012 0,075 0,218 0,423 1,019 1,094 1,108 1,939 1,893 1,949 1,965 1,947 1,958 1,926 0,000 0,012 0,127 0,192 0,423 0,880 1,168 1,299 1,934 1,928 1,947 1,955 1,932 1,952 1,935 0,000 0,002 0,048 0,055 0,049 0,120 0,071 0,172 0,017 0,030 0,002 0,010 0,014 0,012 0,010 Phụ lục 7: Bảng số liệu kết khảo sát độ bền nhiệt ulvan lyase 4oC Giá trị OD Ống Ống Ống Trung bình Độ lệch chuẩn 1,826 1,850 1,862 1.846 0.008 1,860 1,792 1,840 1.817 0.024 14 1,793 1,693 1,789 1.755 0.043 21 1,712 1,669 1,680 1.687 0.048 30 1,688 1,673 1,650 1.670 0.009 (A=750nm) Thời gian (Ngày) Phụ lục 8: Bảng số liệu kết khảo sát độ bền nhiệt ulvan lyase 30oC Giá trị OD (A=750nm) Ống Ống Ống Trung bình Độ lệch chuẩn 1,900 1,868 1,876 1.881 0,017 1,875 1,884 1,824 1,861 0,032 1,782 1,839 1,868 1,830 0,044 1,870 1,849 1,838 1,852 0,016 1,842 1,856 1,874 1,857 0,016 24 1,679 1,587 1,613 1,626 0,047 32 1,423 1,257 1,566 1,415 0,155 48 1,384 1,369 1,297 1,350 0,047 72 1,405 1,254 1,101 1,253 0,152 96 0 0,000 0,000 Thời gian (h) Phụ lục 9: Bảng số liệu kết khảo sát độ bền nhiệt ulvan lyase 45oC Giá trị OD (A=750nm) Ống Ống Ống Trung bình Độ lệch chuẩn 1,907 1,885 1,922 1,905 0,019 0,25 1,919 1,872 1,915 1,902 0,026 0,5 1,885 1,905 1,895 1,895 0,010 1,838 1,914 1,916 1,889 0,044 1,807 1,853 1,899 1,853 0,046 1,835 1,881 1,849 1,855 0,024 1,843 1,727 1,786 1,785 0,058 0,297 0,290 0,197 0,261 0,056 0,101 0,122 0,168 0,130 0,034 12 0,161 0,140 0,100 0,134 0,031 15 0 0,000 0,000 Thời gian (h) Phụ lục 10: Bảng số liệu kết khảo sát độ bền nhiệt ulvan lyase 60oC Giá trị OD (A=750nm) Ống Ống Ống Trung bình Độ lệch chuẩn 1,808 1,892 1,845 1,882 0,023 10 0 0,000 0,000 30 0 0,000 0,000 60 0 0,000 0,000 120 0 0,000 0,000 180 0 0,000 0,000 Thời gian (phút) ... HOẠT TÍNH ULVAN LYASE TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN 35 3.4 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT VÀ THU NHẬN ENZYME TỪ VỌP Geloina coaxans .42 3.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ULVAN. .. bào động vật bảo toàn hoạt tính sinh học Chính lí trên, chọn đề tài Nghiên cứu đặc tính xúc tác ulvan lyase từ động vật thân mềm biển Thức ăn hầu hết loài động vật thu c nhóm chủ yếu rong biển. .. MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME ULVAN LYASE THU TỪ ĐỘNG VẬT THÂN MỀM BIỂN GVHD: Th.s Lê Nhã Uyên TS Huỳnh Hoàng Như Khánh SVTH: