BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SNPs TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ GHẸ XANH (Portunus pelagicus Linnaeus, 1758) Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM Giảng viên hướng dẫn : TS Đặng Thúy Bình Sinh viên thực : Phan Thị Thanh Huyền Mã số sinh viên : 55133504 KHÁNH HÒA - 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SNPs TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ GHẸ XANH (Portunus pelagicus Linnaeus, 1758) Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM GVHD: TS Đặng Thúy Bình SVTH: Phan Thị Thanh Huyền MSSV: 55133504 KHÁNH HÒA, tháng 06/2017 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu đề tài trường Đại học Nha Trang, em xin chân thành cảm ơn quan tâm nhà trường, giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, đặc biệt thầy cô giáo cán thuộc Viện Công nghệ sinh học Môi trường truyền kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em năm học vừa qua Với tình cảm chân thành lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến TS Đặng Thúy Bình (Viện Công Nghệ Sinh Học & Môi Trường) định hướng tận tình hướng dẫn cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến NCS Vũ Đặng Hạ Quyên, ThS Trương Thị Oanh Ths Trần Quang Sáng (Viện Công Nghệ Sinh Học & Môi Trường) ThS Đoàn Vũ Thịnh (Khoa Công Nghệ Thông Tin) động viên dìu dắt em suốt trình nghiên cứu, thực đề tài viết luận văn tốt nghiệp Em xin cảm ơn dự án NORHED “Ảnh hưởng biến đổi khí hậu đến quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus dịch tễ học sinh vật gây bệnh chủ yếu” cung cấp kinh phí hỗ trợ cho em thực đề tài Cuối em xin cảm ơn gia đình, anh chị bạn bè động viên giúp em vượt qua khó khăn suốt năm học vừa qua Do thời gian kiến thức hạn chế nên luận văn tốt nghiệp em tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đóng góp ý kiến quý báu quý thầy cô bạn Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng năm 2017 Sinh viên Phan Thị Thanh Huyền ii TÓM TẮT Ghẹ xanh (Portunus pelagicus Linnaeus, 1758) có chu kì sinh sản diễn quanh năm, tốc độ tăng trưởng nhanh, dễ nuôi, đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao Việt Nam Giai đoạn trôi ấu trùng ghẹ xanh khoảng 15 – 18 ngày Các dòng chảy dọc theo bờ biển Việt Nam tạo khả kết nối rộng rãi quần thể sinh vật biển Tuy nhiên, đặc trưng vùng biển phía Tây Nam Việt Nam gần vịnh Thái Lan (khả hình thành dòng xoáy) dòng chảy biển Đông sông Mê Kông rào cản sinh học cho di chuyển gen sinh vật biển thông qua phát tán ấu trùng, tạo phân tách quần thể Đề tài áp dụng phương pháp ezRAD kỹ thuật giải trình tự hệ để phát thị phân tử SNPs ứng dụng nghiên cứu di truyền quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus vùng biển Việt Nam Từ 67 cá thể ghẹ xanh thu từ khu vực Hải Phòng, Khánh Hòa Kiên Giang đại diện cho vùng biển Việt Nam, hệ gen tham chiếu ghẹ xanh xây dựng dựa vào thông số tối ưu Nghiên cứu phát 584 SNPs ý nghĩa từ 175.790 SNPs thô Kết phân tích cho thấy quần thể P pelagicus khu vực Hải Phòng Khánh Hòa có kết nối di truyền với Quần thể P pelagicus Kiên Giang có phân tách rõ rệt so với quần thể Hải Phòng Khánh Hòa Kết nghiên cứu hỗ trợ giả thuyết dòng chảy khu vực Tây Nam dòng chảy sông Mê Kông rào cản sinh học cho di chuyển gen quần thể Nghiên cứu góp phần khảo sát đa dạng di truyền ghẹ xanh Portunus pelagicus, đồng thời cung cấp liệu đầu vào cấu trúc kết nối quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus phân bố vùng biển Việt Nam làm sở cho việc xây dựng chiến lược quản lý bảo tồn nguồn lợi Từ khóa: Portunus pelagicus, di truyền quần thể, SNPs, ezRAD i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .v MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan khu vực nghiên cứu 1.1.1 Vùng biển Hải Phòng 1.1.2 Vùng biển Khánh Hòa 1.1.3 Vùng biển Kiên Giang 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.2.1 Hệ thống phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái .10 1.2.3 Đặc điểm phân bố 11 1.2.4 Đặc điểm sinh thái dinh dưỡng 11 1.2.5 Đặc điểm sinh sản 12 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 14 1.3.1 Enzyme cắt giới hạn 14 1.3.2 Chỉ thị phân tử đa hình đơn nucleotide 16 1.3.3 Tổng quan phương pháp giải trình tự hệ .16 1.3.4 Tổng quan kỹ thuật ezRAD .19 1.3.5 Ứng dụng kỹ thuật RAD nghiên cứu di truyền quần thể 19 1.4 Tổng quan nghiên cứu liên quan đến đa dạng di truyền quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus 22 1.4.1 Trên giới 22 1.4.2 Ở Việt Nam 23 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian phương pháp nghiên cứu 25 2.2 Sơ đồ khối nghiên cứu 26 ii 2.3 Thu nhận thư viện ezRAD 26 2.4 Xử lý số liệu 29 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số ghẹ xanh Portunus pelagicus 32 3.2 Thu nhận thư viện gen ezRAD ghẹ xanh Portunus pelagicus .32 3.3 Tạo hệ gen tham chiếu 33 3.4 Xác định thị SNPs di truyền quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus .35 3.5 Xác định đa dạng di truyền 36 3.6 Xác định khoảng cách di truyền quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus khu vực 36 3.7 Xây dựng cấu trúc quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus vùng biển Việt Nam37 3.8 Thảo Luận .38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 PHỤ LỤC iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Khu vực Hải Phòng (bao gồm Đảo Cát Bà) địa điểm thu mẫu Hình 1.2: Bản đồ Khánh Hòa địa điểm thu mẫu Hình 1.3: Khu vực Kiên Giang (bao gồm Đảo Phú Quốc) địa điểm thu mẫu Hình 1.4: Hình ảnh mô tả hình thái bên ghẹ xanh Portunus pelagicus 10 Hình 1.5: Đặc điểm hình thái ghẹ xanh Portunus pelagicus 11 Hình 1.6: Vòng đời ghẹ xanh Portunus pelagicus 13 Hình 1.7: Các kiểu cắt Enzyme cắt giới hạn 15 Hình 1.8 Chỉ thị phân tử SNPs .16 Hình 1.9 Các bước thực giải trình tự hệ 17 Hình 1.10: Các bước giải trình tự hệ thống Illumina 18 Hình 2.1: Bản đồ khu vực thu mẫu Việt Nam 25 Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu ứng dụng thị phân tử SNPs nghiên cứu di truyền quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus 26 Hình 2.3: Cấu trúc Adapter .28 Hình 2.4: Quy trình tạo hệ gen tham chiếu 30 Hình 3.1: DNA tổng số ghẹ xanh Portunus pelagicus 32 Hình 3.2 : Kết điện di sản phẩm PCR .33 Hình 3.3: Biểu đồ thể %(A+T) %(G+C) ba hệ gen tham chiếu 34 Hình 3.4: Đồ thị thể số contigs Blocks hệ gen tham chiếu 34 Hình 3.5: Hình ảnh (phần mềm Seaview) hệ gen tham chiếu dựa thông số tối ưu 34 Hình 3.6: Phân tích tọa độ di truyền quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus vùng biển Việt Nam dựa thị SNPs .37 Hình 3.7: Dòng chảy theo mùa biển Đông 41 Hình 3.8: Sơ đồ hình thành vùng xoáy vịnh Thái Lan 42 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thư viện ezRAD 28 Bảng 2.2: Giá trị thang đo Phred 29 Bảng 3.1: Thông số hệ gen tham chiếu dựa vào giá trị Coverage Cuts off 34 Bảng 3.2: Kết sàng lọc SNPs ghẹ xanh 35 Bảng 3.3: Số lượng cá thể ghẹ xanh trước sau sàng lọc .35 Bảng 3.4: Các thông số đa dạng di truyền quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus dựa thị SNPs .36 Bảng 3.5: Chỉ số sai khác di truyền FSt (phía đường bên) giá trị p-value (phía đường bên) quần thể ghẹ xanh Portunus pelagicus Linnaeus, 1758 37 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µL µM ĐDSH Microliter Micromol Đa dạng sinh học HST Hệ sinh thái BĐKH Biến đổi khí hậu RAD Restriction site Associated DNA Sequencing SNPs RAPD RELP AFLP Đa hình đơn nucleotide (Single- nucleotide polymorphisms) Random Amplification of Polymorphic DNA Reliable Event Logging Protocol Amplified Fragment Length Polymorphisms DNA Deoxyribonucleic acid A, T, C, G Adenine, Thymine, Guanine, Cytocine dNTP Deoxynucleotide Bp G Gb AB AC Base pairs Gam Ngân hàng Gen (Genbank) Allele Balance Allele Count AF Allele Frequency BI Bayesian inference Dp Cm Depth Centimeter GENO Genotype Km Kilometer MP COI Maximum Parsimony Cytochrome c oxidase I Mt DNA Hệ gen ty thể RNA Ribonucleic acid 16S rRNA PCR 16S ribosomal Ribonucleic acid Polymerase Chain Reaction MỞ ĐẦU Ghẹ xanh Portunus pelagicus loài phân bố rộng, tìm thấy khắp vùng biển Thái Bình Dương từ quốc gia Đông Á, Đông Nam Á, Đông Australia, đảo Fidji, đến phía Tây Biển Đỏ, Đông Phi với số lượng lớn có giá trị thương mại cao (FAO, 2014) Chúng đánh giá cao giá trị dinh dưỡng thịt chúng ngon, (Maheswarudu ctv, 2008) với hàm lượng protein cao, chứa nhiều acid béo, acid amin thiết yếu nguyên tố vi lượng Chính thế, việc khai thác ghẹ xanh diễn rộng khắp giới nhằm phục vụ cho nhu cầu đời sống ngày cao người Theo thống kê FAO (2014) tổng sản lượng ghẹ xanh đánh bắt giới tăng dần từ khoảng 5.000 năm 1963 đạt khoảng 184.000 năm 2013 Theo Tổng Cục Thủy Sản (2012), sản lượng thủy sản giảm từ 24,8% xuống 21,9% năm 2010, thể suy giảm nguồn lợi thuỷ sản mức độ đa dạng sinh học khu vực Còn theo số liệu Viện Nghiên cứu Hải Sản (Bộ NNPTNT), sản lượng khai thác ghẹ xanh Kiên Giang năm 2014 đạt 6.200 tấn, giảm 20% so với năm 2013, so với 2009 giảm 43% Ghẹ xanh Portunus pelagicus thường di chuyển vào vùng cửa sông để tìm kiếm thức ăn nơi trú ẩn Thức ăn ghẹ xanh đa dạng, chủ yếu động vật bao gồm loài hai mảnh vỏ, chân bụng, giáp xác, cá loài rong tảo lớn (FAO, 2014) Môi trường sống chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng bao gồm khu vực gần rạn san hô, rừng ngập mặn, thảm cỏ biển (FAO, 2014) Nhiệt độ 28 – 30oC độ mặn 30 – 35 ‰ thích hợp cho tồn phát triển ghẹ xanh (Ravi ctv, 2012) Khi độ mặn nước biển thay đổi, để tồn ghẹ thực trình di cư đến vùng có có độ mặn thích hợp Ghẹ xanh đóng vai trò quan trọng việc cân chuỗi thức ăn hệ sinh thái nơi mà chúng sinh sống Chu kì sinh sản ghẹ xanh diễn quanh năm với tốc độ tăng trưởng nhanh, dễ nuôi; khả chống chịu nitrat ammoniac tốt (Romano Zeng, 2007a, b) làm cho loài trở thành đối tượng lý tưởng nuôi trồng thủy sản Vì thế, số hướng triển khai thực thành công, mở hội cho ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam Vào cuối năm 2011, Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Kiên Giang tổ chức Quỹ Quốc tế Bảo vệ Thiên nhiên Việt Nam (WWF VN) đề xuất xây dựng “Ngân hàng Ghẹ Xanh” nhằm nâng cao nhận thức người dân đóng góp họ việc bảo tồn, bảo vệ nguồn lợi ghẹ, góp phần bảo đảm sinh kế bền vững cho ngư dân địa 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận Nghiên cứu thu 67 cá thể ghẹ xanh Portunus pelagicus khu vực Hải Phòng, Khánh Hòa Kiên Giang tổng số SNPs thô 175.790 SNPs Sử dụng phương pháp lọc dựa vào số AF, AB, Mean DP, Mean Quality, AB, MQR/MQNR, Paired, HWE phát 584 SNPs có ý nghĩa di truyền Sự đa dạng di truyền ghẹ xanh P pelagicus quần thể Hải Phòng, Khánh Hòa Kiên Giang thể qua số lượng alen 1,796 ± 0,010 (dao động từ 1,723 (HP) đến 1,780 (KH)); số alen hiệu 1,169 ± 0,003 (dao động từ 1,140 (HP) đến 1,211 (KH)); số dị hợp tử quan sát (0,135 ± 0,003) thấp Hải Phòng (0,112) cao Khánh Hòa (0,164); số dị hợp tử mong đợi (0,133 ± 0,002) thấp Hải Phòng (0,111) cao Khánh Hòa (0,163) Cấu trúc di truyền quần thể P pelagicus khu vực Hải Phòng Khánh Hòa có kết nối di truyền với (FSt = -0,00016; p-value = 0,35697) Quần thể Kiên Giang Hải Phòng thể phân tách rõ rệt (FSt = 0,04154; p-value = 0,0005