1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SNPs TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TỔ TRẮNG Aerodramus fuciphagus (THUNBERG, 1812) TẠI KHU VỰC TRUNG VÀ NAM BỘ, VIỆT NAM Giảng viên hƣớng dẫn : TS Đặng Thúy Bình Sinh viên thực : Võ Thị Đức Mã số sinh viên : 55133687 Khánh Hòa, năm 2017 TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG BỘ MÔN SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SNPs TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TỔ TRẮNG Aerodramus fuciphagus (THUNBERG, 1812) TẠI KHU VỰC TRUNG VÀ NAM BỘ, VIỆT NAM GVHD: TS Đặng Thúy Bình SVTH: Võ Thị Đức MSSV: 55133687 Khánh Hòa, tháng năm 201 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, trƣớc tiên em bày bỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình ThS Vũ Đặng Hạ Quyên tận tình bảo hƣớng dẫn em suốt thời gian nghiên cứu thực đồ án Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo thuộc viện Công nghệ sinh học Môi trƣờng giảng dạy, truyền đạt kiến thức bổ ích cho em suốt trình học tập năm qua Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trƣờng Đại học Nha Trang tạo điều kiện sở vật chất cho em suốt trình thực đồ án Em xin cảm ơn đề tài ―Khai thác phát triển nguồn gen chim yến đảo (Aerodramus fuciphagus germani Oustalet, 1878) phục vụ phát triển bền vững nghề chim yến Việt Nam‖ Công ty TNHHMTV Yến sào Khánh Hòa tài trợ kinh phí hỗ trợ thu mẫu cho em thực đồ án Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè anh chị phòng thí nghiệm sinh học phân tử quan tâm, giúp đỡ hỗ trợ em suốt thời gian thực để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Mặc dù, em cố gắng để hoàn thiện đồ án nhƣng thời gian kiến thức hạn chế, nên trình thực đồ án tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đƣợc góp ý thầy, cô giáo để đồ án đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 25 tháng năm 2017 Sinh viên Võ Thị Đức ii TÓM TẮT Việt Nam có đƣờng bờ biển dài từ Bắc đến Nam, có nhiều đảo quần đảo thích hợp cho việc sinh sống trú ngụ chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus Đây loài chim mà tổ đƣợc làm từ nƣớc bọt có giá trị kinh tế cao, nguồn thực phẩm bổ dƣỡng nhiều quốc gia giới Cũng chúng mang lại nhiều lợi ích nên ngƣời khai thác mức tổ yến có nguồn gốc tự nhiên dẫn đến suy giảm nguồn lợi tổ yến, nhƣ ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển quần thể chim yến Nghiên cứu áp dụng phƣơng pháp ezRAD (ez Restriction-site Associated DNA) nhằm khảo sát khác biệt di truyền kết nối quần thể chim yến phân bố đảo (đảo A1- Khánh Hòa Côn Đảo) chim yến nuôi nhà (Nha Trang – Khánh Hòa Kiên Giang) Việt Nam Từ 75 cá thể chim yến Aerodramus fuciphagus thu đƣợc từ khu vực Khánh Hòa, Côn Đảo, Kiên Giang, hệ gen tham chiếu chim yến Aerodramus fuciphagus đƣợc xây dựng dựa vào thông số tối ƣu Nghiên cứu phát 721 SNPs có ý nghĩa di truyền từ 593.637 SNPs thô Kết phân tích cho thấy có kết nối quần thể chim yến nhà với chim yến nhà, chim yến đảo với chim yến đảo, đồng thời có phân tách quần thể chim yến nhà (Kiên Giang, Nha Trang) quần thể chim yến đảo (Đảo A1, Côn Đảo) Kết nghiên cứu góp phần hỗ trợ giả thuyết trƣớc nguồn gốc quần thể chim yến nhà Kiên Giang có nguồn gốc từ Thái Lan Nghiên cứu góp phần khảo sát đa dạng di truyền chim yến Aerodramus fuciphagus cung cấp liệu đầu vào cấu trúc kết nối quần thể chim yến tổ trắng làm sở cho việc xây dựng chiến lƣợc bảo tồn quản lý nguồn lợi Từ khóa: Aerodramus fuciphagus, di truyền quần thể, SNPs, ezRAD iii MỤC LỤC Đề mục Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH HÌNH VẼ .v DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vùng nghiên cứu .4 1.2 Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu 1.2.1 Hệ thống phân loại chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 1.2.2 Đặc điểm hình thái .6 1.2.3 Phân bố .7 1.2.4 Hành vi, tập tính 1.2.5 Khả định vị tiếng vang 10 1.2.6 Thức ăn cách thức bắt mồi 10 1.2.7 Đặc điểm sinh sản chim yến 11 1.3 Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu 12 1.3.1 Tổng quan giải trình tự hệ (NGS) 12 1.3.2 Tổng quan Restriction site Associated DNA Sequencing 1.3.3 Tổng quan ezRAD 13 1.3.4 Tổng quan SNPs 14 1.4 Tình hình nghiên cứu di truyền chim yến (Apodiformes) giới Việt Nam 16 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 16 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 18 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng, địa điểm phƣơng pháp thu mẫu 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 iv 2.2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu di truyền chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus Thunberg, 1812 .22 2.2.2 Giải thích quy trình thực .22 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết nghiên cứu 28 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 28 3.1.2 Thu nhận thư viện ezRAD .28 3.1.3 Xây dựng hệ gen tham chiếu chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus) 29 3.1.4 Phát thị SNPs quần thể quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 31 3.1.5 Xây dựng cấu trúc quần thể chim yến A fuciphagus Việt Nam 33 3.2 Thảo luận 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC v DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus .6 Hình 1.2 Bản đồ phân bố chim yến Aerodramus fuciphagus Hình 1.3 Bản đồ phân bố chim yến Việt Nam Hình 1.4 Đảo yến Hòn Nội (A)-Hòn Ngoại (B) Khánh Hòa Hình 1.5 Chim yến làm tổ (A) tổ yến (B) 11 Hình 1.6 Chim ngày tuổi(A) chim tập bay (B) 12 Hình 1.7 Quá trình tạo thƣ viện gen phƣơng pháp EzRAD 14 Hình 1.8.Chỉ thị phân tử SNPs 14 Hình 2.1 Mẫu chim trứng (A) mẫu chim yến tổ trắng (B) Aerodramus fuciphagus 21 Hình 2.2.Địa điểm thu mẫu chim yến 21 Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu di truyền chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 22 Hình 2.4 Tạo thƣ viện gen ezRAD .23 Hình 2.5 Cấu trúc Adapter .25 Hình 3.1 DNA tổng số chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus .28 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR ezRAD 29 Hình 3.3 Biểu đồ thể % (A+T) % (G+C) ba hệ gen tham chiếu theo giá trị coverage cutoff 30 Hình 3.4 Hình ảnh hệ gen tham chiếu sử dụng phần mềm Seaview dựa vào thông số tối ƣu 31 Hình 3.5 Phân tích tọa độ di truyền quần thể chim yến Aerodramus fuciphagus dựa thị SNPs 35 vi DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Số lƣợng mẫu thu địa điểm 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng enzyme cắt giới hạn 24 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR tạo thƣ viện DNA .25 Bảng 2.4 Giá trị thang đo Phred 26 Bảng 3.1 Thông số hệ gen tham chiếu dựa vào giá trị Coverage Cutoff, %(A+T) %(G+C) 30 Bảng 3.2 Kết sàng lọc SNPs chim yến Aerodramus fuciphagus 32 Bảng 3.3 Số lƣợng cá thể chim yến tổ trắng trƣớc sau sàng lọc .32 Bảng 3.4 Các thông số đa dạng di truyền quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus dựa thị SNPs 34 Bảng 3.5 Chỉ số sai khác di truyền Fst (phía dƣới đƣờng bên) p- value (phía đƣờng bên quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 33 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ctv Cộng tác viên bp Base pair PCR Polymerasa Chain Reaction mtDNA DNA ty thể SNPs Single-Nucleotide Polymorphism ezRAD ez Restriction-site Associated DNA µL Microliter µM Micromol AB Allele Balance AC Allele Count AF Allele Frequency Q Quality DNA Deoxyribonucleic acid NGS Next Generation Sequencing SSCP Single Stranded Conformation Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism LSA Locus Specific Amplification EST Expressed Sequence Tags CHD Chromodomain helicase DNA binding protein GAPDH Glyceraldehyde – phosphate dehydrogenase DAPC Discriminant analysis of principal components RADP Random Amplified Pholimorphic DNA AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism RAD Restriction site Associated DNA Sequencing RE Restriction enzyme GBS Genotype By Sequencing RNA Ribonucleic acid rRNA ribosome Ribonucleic acid DAPC Discriminant Analysis of Principal Components SPB Sample Purification Beads PCoA Principal Coordinates Analysis viii DA Discriminant Analysis PC Principal Components A, T, G, C Adenine, Thymine, Guanine, Cytocine 38 toàn bộ gen cách nhanh chóng, kinh tế xác so với phƣơng pháp trƣớc (Michael ctv, 2010) Đồng thời, việc ứng dụng giải trình tự hệ thúc đẩy phát hàng triệu biến thể di truyền từ gen động vật có xƣơng sống Kết nghiên cứu ứng dụng giải trình tự hệ để xác định thị phân tử nghiên cứu cấu trúc quần thể chim cắt Falco cherrug khắp lục địa Á – Âu (Zhan ctv, 2015) Nghiên cứu sử dụng 144 SNPs cách phân tích Bayesian Nghiên cứu làm bật đƣợc tầm quan trọng chức SNPs để nghiên cứu mô hình di truyền quần thể, đồng thời cho thấy biến đổi di truyền phong phú lớp chim giống với nghiên cứu trƣớc (William ctv, 2008) Bƣớc đầu nghiên cứu cho thấy vị trí địa lý khác cá thể có khác biệt SNPs Việc xác định phân loài chim yến Việt Nam nhiều tranh cãi phân loài A f germani phân loài A f amechanus Đặc biệt thời gian vừa qua, nghề nuôi chim yến nhà phát triển, khó xác định nguồn gốc chim yến Hơn nữa, có tƣợng chim yến xuất nhà yến miền bắc Việt Nam (Thanh Hóa), vậy, nghiên cứu chuyên sâu di truyền chim yến mức độ hệ gen để xác định biến đổi quần đàn, tập tính di cƣ môi trƣờng sống thay đổi cần thiết 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận Thu mẫu tách chiết DNA chim yến từ mẫu phôi khu vực Khánh Hòa, Côn Đảo Kiên Giang Tạo thƣ viện hệ gen chim yến đảo chim yến nhà khu vực Khánh Hòa (chim yến đảo nhà), Côn Đảo (chim yến đảo), Kiên Giang (chim yến nhà) Xây dựng hệ gen tham chiếu chim yến Việt Nam phát 721 SNPs mang ý nghĩa di truyền Cấu trúc quần thể chim yến A fuciphagus khu vực thu mẫu có phân tách định, chia làm nhóm gồm quần thể chim yến nhà chim yến đảo Quần thể chim yến nhà Kiên Giang, Nha Trang – Khánh Hòa có tách biệt với quần thể chim yến đảo A1 Côn Đảo Các quần thể chim yến nhà (Kiên Giang Khánh Hòa) nhƣ quần thể chim yến đảo (A1– Khánh Hòa) Côn Đảo có mối quan hệ gần gũi với  Kiến nghị Mở rộng khu vực thu mẫu số địa điểm nhƣ Bình Phƣớc, thành phố Hồ Chí Minh… Nếu có điều kiện thời gian đƣa nghiên cứu chuyên sâu hệ gen chim khu vực Đông Nam Á Đồng thời, địa điểm cần tăng thêm số lƣợng mẫu thu (ít 32 mẫu) để đảm bảo ý nghĩa mặt thống kê 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đinh Thị Phƣơng Anh, Võ Tấn Phong (2011) Nghiên cứu số đặc điểm sinh thái học chim yến hàng điều kiện tự nhiên đảo Cù Lao Chàm, Hội An – Quảng Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 44 (3), pp: 111-118 Đặng Thúy Bình, Lê Hữu Hoàng, Lƣơng Công Bình, Đoàn Vũ Thịnh (2017) Nghiên cứu bƣớc đầu hệ gen cấu trúc quần thể chim yến Aerodramus fuciphagus sử dụng thị phân tử Hội thảo khoa học phát triển bền vững ngành nghề yến sào Việt Nam, pp: 51-62 Lê Hữu Hoàng, Lƣơng Công Bình, Nguyễn Xuân Viễn (2014) Nghiên cứu sở khoa học đề xuất giải pháp phát triển bền vững nghề nuôi chim yến Việt Nam Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, 123 trang Hồ Thị Loan, Đặng Tất Thế, Nguyễn Giang Sơn (2013) Bƣớc đầu ứng dụng kĩ thuật PCR để xác định giới tính chim yến hàng Aerodramus fuciphagus Hội nghị khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 5, pp: 1446-1449 Hồ Thị Loan, Nguyễn Giang Sơn, Đặng Tất Thế, Nguyễn Lân Hùng Sơn (2015) Mối quan hệ di truyền số quần thể chim yến sống đảo đất liền Việt Nam Tạp chí sinh học, 37 (2), pp: 228 - 235 Trần Văn Minh (2009) Vùng duyên hải miền Trung ứng phó với biến đổi khí hậu: thực tiễn giải pháp Ủy ban nhân dân thành phố Đà Nẵng Trần Viết Ôn, Bùi Hiếu, Lê Thị Nguyên (2005) Nghiên cứu dự báo hạn hán vùng Nam Trung Bộ Tây Nguyên xây dựng giải pháp phòng chống Bộ khoa học công nghệ, 122 trang Nguyễn Quang Phách (1993) Cơ sở sinh học việc khai thác hợp lý, bảo vệ phát triển nguồn lợi chim yến hàng (Collocalia fuciphaga germani Oustalet 1878) Việt Nam Nhà xuất Hà Nội, 96 trang Nguyễn Quang Phách, Hồ Thế Ân (1999) Tuyển tập tóm tắt kết đề tài nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ môi trƣờng tỉnh Khánh Hoà 10 năm (1989 – 1999) Sở KHCN MT Khánh Hoà 10 Võ Tấn Phong, Lê Đình Thủy, Đinh Thị Phƣơng Anh (2016) Nghiên cứu ảnh hƣởng số nhân tố sinh thái nơi làm tổ đến sinh sản quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus (Thunberg, 1812) quần đảo Cù Lao Chàm, Hội 41 An, tỉnh Quảng Nam Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 6, pp: 1568-1573 11 Võ Tấn Phong, Lê Đình Thủy, Đinh Thị Phƣơng Anh (2015) Nghiên cứu bƣớc đầu ảnh hƣởng việc khai thác tổ yến đến sức sinh sản quần thể loài chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus (Thunberg, 1812) khu bảo tồn thiên nhiên Cù Lao Chàm, tỉnh Quảng Nam Tạp chí sinh học 2015, 37(1), pp: 20-24 12 Nguyễn Lân Hùng Sơn (2013) Tổng quan số nghiên cứu phân loại học chim yến (Apodiformes: Apodidae) giới Việt Nam Kỷ yếu Hội thảo khoa học phát triển nghề nuôi chim yến Việt Nam, pp: 59-72 13 Đặng Tất Thế, Lê Xuân Cảnh, Nguyễn Hồng Vân (2007) Đa dạng di truyền chim yến sống đảo đất liền thuộc tỉnh Bình Định Khánh Hòa Báo cáo Khoa học Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ hai Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, pp: 568-573 14 Nguyễn Khoa Diệu Thu, Nguyễn Phƣơng Nam, Đặng Văn Nguyên, Nguyễn Xuân Mai Nguyễn Văn Tuyên (2009) Nghiên cứu nuôi thử nghiệm chim yến nhà để lấy tổ bán đảo Phương Mai Bình Định TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 15 Aowphol A., Voris H.K., Feldheim K.A., Harnyuttanakorn P., Thirakhupt K (2008) Genetic homogeneity among colonies of the white-nest swiftlet (Aerodramus fuciphagus) in Thailand Zoolog Sci., 25(4), pp: 80-372 16 Beuzen N.D., Stear M.J., Chang K.C (2010) Molecular markers and their use in animal breeding Ver J, 160, pp: 42-52 17 Bolger A.M., Lohse M., Usadel B (2014) Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data Bioinformatics, 30(15), pp: 2114-2120 18 Chantler P., Driessens G (2000) Swifts: A Guide to the Swifts and Treeswifts of the World 2nd, Pica Press, East Sussex Clements R, Sodhi NS, Schilthuizen 240 page 19 Chong Z., Ruan J and Wu C.I (2012) Rainbow: an integrated tool for efficient clustering and assembling RAD-seq reads Bioinformatics (Oxford, England), 28(21), pp: 2732–2737 42 20 Cranbrook, Lim G.V., Mustafa A R (2013) The species of white-nest swiftlets (Apodidae, Collocaliini) of Malaysia and the origins of house- farmbirds: morphometric and genetic evidence Forktail, 29, pp: 107-119 21 Duran C.N., Appleby T., Clark D., Wood M (2009) AutoSNPdb: an annotated single nucleotide polymorphism database for crop plants Nucleic Acids Res, 37, pp: 951-953 22 Edwards D., Batley J (2010) Plant genome sequencing: applications for plant improvement Biotech, 8, pp: 2-9 23 Elaine R M (2008) The impact of next-generation sequencing technology on genetics Trands in Genetics, 24, pp: 133-141 24 Francis C.M (1987) The Management of Edible Bird's Nest Caves in Sabah: Wildlife Section, Sabah Forest Department; 217 page 25 Frascaroli E., Schrag T.A., Melchinger A.E (2013) Genetic diversity analysis of elite European maize (Zea mays L.) inbred lines using AFLP, SSR and SNP markers reveals ascertainment bias for a subset of SNPs Genet, 126, pp: 133-141 26 Frohlich T., Kirschbaum T., Thoenes U., Furrer F., Dietrichveenstra U., Seller M (2004) The light typer instrument: high through put genotyping of single nucleotide polymorphism Biochemica, (2), pp: 9-11 27 Guryev V., Berezikov E., Cuppen E (2005) CASCAD: a database of annotated candidate single nucleotide polymorphisms associated with expressed sequences BMC Genomics, 6, pp: 6-10 28 Hoang L.H., Binh D.T, Thu N.A., Binh L.C (2014) Population genetics of white-nest swiftlet, Aerodramus fuciphagus in Vietnam Journal of Fisheries Science and Technology, Special issue 2015, pp: 57-62 29 Hobbs J.J (2004) Problems in the Harvest of Edible Birds’ Nests in Sarawak and Sabah, Malaysian Borneo Biodiversity and Conservation, 2, pp: 5-13 30 Houdret N., Lhermitte M., Degand P., Roussel P (1975) Purification et es étude chimique d’une glycoprotein de Collocalia Biochime (57): 603-608 31 Hoyo D.J., Elliott A., Sargatal J (1999) Handbook of the birds of the world, vol 5, Barn-owls to Hummingbirds Lynx Edicions, Barcelona, pp: 388-435 32 Jehan T., Lakhanpaul S (2006) Single nucleotide polymorphism (SNP)methods and applications in plant genetics: A review Indian J Biotech, 5, pp: 435-459 43 33 Jesse A P., Patrick J B., Mark E S., Jean L J (2012) Development of High-Density Genetic Maps for Barley and Wheat Using a Novel Two-Enzyme Genotyping-by-Sequencing Approach PLoS One, (5) 34 Jombart T (2008) adegenet: a R package for the multivariate analysis of genetic markers Bioinformatics, 24, pp: 1403-1405 35 Jombart T., Devillard S and Balloux F (2010) Discriminant analysis of principal components: a new method for the analysis of genetically structured populations BMC Genetics, 11, pp: 94 -105 36 Jordan S.A., Humphries P (1994) Single nucleotide polymorphism in exon of the BCP gene on q31-q35 Genet, 3, pp: 15-19 37 Kathan R.H and Weeks D.I (1969) Structure studies of Collocalia mucoids Archives of Biochemistry and Biophysics, 134, pp: 572-576 38 Kharrati K.H and Esmailizadeh A K (2014) SNPs Genotyping Technologies and Their Applications in Farm Animals Breeding Programs: Review Vol 57 (1), pp: 87-95 39 Kim K S., Bellendir S., Hudson K A.(2010) Fine mapping the soybean aphid resistance gene Rag1 in soybean Theor Appl Genet., 120 (5): 1063-1107 40 Koon L.C and Cranbrook (2002) Swiftlets of Borneo: Builders of edible nests Kota Kinabalu, Malaysia: Natural History Publications (Borneo), 120 page 41 Kwok P.Y., Chen X (2003) Detection of single nucleotide polymorphisms Curr Issues Mol Biol, 5, pp: 43-60 42 Lau A.S.M., Melville D.S (1994) International Trade in Swiftlet Nests with Special Reference to Hong Kong Traffic International, pp: 11-42 43 Lee P.L., Clayton D.H., Griffiths R., Page R.D (1996) Does behavior reflect phylogeny in swiftlets (Aves: Apodidae) A test using cytochrome b mitochondrial DNA sequences Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(14), pp: 7091- 7096 44 Medway L (1963) The antiquity of trade in edible birds’nests Fed Mus J, 8, pp: 36–47 45 Peterson B K., Weber J N., Kay E.H., Fisher H.S and Hoekstra H E (2012) Double digest RADseq: An inexpensive method for de novo SNP discovery and genotyping in model and non-model species, PLos One, 7(5) 44 46 Phach N.Q, Yen V.Q, Voisin J.F, 2002 The white nest swiftlet and the black nest swiftlet: A monograph Boubée, Paris; 297 page 47 Phach N.Q., Voisin J.F., 2007 On an ecological form of the white-nest swiftlet Aerodramus fuciphagus (Aves, Apodidae) breeding in houses in Vietnam Revue Ecologique (Terre and Vie), 62, pp: 49-57 48 Price J.J., Johnson P.K., Clayton H.D (2004) The evolution of echolocation in swiftlets Journal of Avian Biology, 35(2), pp: 135-143 49 Raman H., Dalton-Morgan J., Diffey S., Raman R., Alamery S., (2014) SNP markers-based map construction and genome-wide linkage analysis in Brassica napus Plant Biotech J., 12 (7), pp: 851-860 50 Robert J T., Jonathan B P., Zac H F., Jonathan L W., Iria F.S., Kimberly R A., Bird E.C (2013) ezRAD: a simplified method for genomic genotyping in nonmodel organisms Peer J 1, https://doi.org/10.7717/peerj.203 51 Rod P., Peter E.S (2012).GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel Population genetic software for teaching and research—an update Bioinformatics, 28(19), pp: 2537-2539 52 Sachidanandam R., Weissman D., Schmidt S.C., Kakol J.M (2001) A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms Nature, 409, pp: 928-933 53 Seidel G.E (2010) Brief introduction to whole-genome selection in cattle using single nucleotide polymorphisms Report Fert Develop, 22(1):138-44 54 Shi W., Eli M., John K M.K., Mikhail V.M (2012) 2b-RAD: a simple and flexible method for genome-wide genotyping Nuature methods, 9, pp: 808-810 55 Suh Y., Vijg J., 2005 SNP discovery in associating genetic variation with human disease phenotypes Mutat Res, 573, pp: 41- 53 56 Thanh N.M., Andrew C.B., Peter B.M., Yutao L., Russell E.L (2010) Single nucleotide polymorphisms in the crustacean hyperglycemic hormone genes with individual growth performance in giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii Journal Article, pp: 7-15 57 Thomassen H A., Wiersema A T., Bakker M A., Knijff P., Hetebrij E., & Povel G D (2003) A new phylogeny of swiftlets (Aves: Apodidae) based on cytochrome-b DNA Mol Phylogenet Evol, 29(1), pp: 86-93 45 58 Thomassen H.A., Robert T.J., Bakker M.A.G., Povel G.D.E (2005) Phylogenetic relationships amongst swifts and swiftlets: A multi locus approach Molecular Phylogenetics and Evolution, 37(1), pp: 264-277 59 Twyman R.M (2004) SNP discovery and typing technologies for pharmacogenomics Curr Top Med Chem, 4, pp: 1423-1431 60 Vermeer S., Hoischen A., Meijer R.P., Gilissen C., Neveling K (2010) Targeted next-generation sequencing of a 12.5 Mb homozygous region reveals ANO10 mutations in patients with autosomal-recessive cerebellar ataxia Genet, 87, pp: 813–819 61 Wu X., Li Y., Shi Y., Song Y ctv, 2014 Fine genetic characterization of elite maize germplasm using high-throughput SNP genotyping Theor Appl Genet, 127(3), pp: 621-631 PHỤ LỤC Phụ lục Nội dung Số lƣợng trang Phụ lục Quy trình tách chiết DNA tổng số kit Promega Phụ lục Quy trình đo hàm lƣợng DNA sử dụng máy đo huỳnh quang Qubit 2.0 Phụ lục Mẫu nồng độ DNA tƣơng ứng cá thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus Phụ lục Bảng adapter đƣợc gắn cho mẫu quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus Phụ lục 1.Tách chiết DNA tổng số kit Promega Quy trình chung mẫu phôi trứng mẫu cơ: dùng kéo panh vô trùng cắt nhỏ 20 mg mẫu cho vào ống eppendorf 1,5 mL; thêm 275 µL hỗn hợp dung dịch Master Mix (gồm 200 µL Nuclei Lysis solution, 50 µL EDTA (pH 8.0), 20 µL Protein Kvà µL RNase A solution) Sau ủ mẫu 55ºC đến mô tan hoàn toàn, mô tan hoàn toàn thêm 250 µL Wizard SV Lysis Buffer, mix mẫu chuyển dịch qua Minicolumn Assembly Tiến hành li tâm 13000 x g phút, loại bỏ dịch; thêm 650 µL Column Wash Solution, ly tâm 13000 x g phút sau loại bỏ dịch lỏng, với bƣớc ta lặp lại lần Với lần thứ sau loại bỏ dịch vừa li tâm ta tiến hành li tâm khô 13000 x g thời gian phút Chuyển cột lọc qua eppendorf 1,5 mL, thu hồi DNA ta tiến hành rửa giải lần riêng biệt với 100 µL Nuclease- Free Water thời gian ủ khác (5 phút, 10 phút 15 phút cho lần rửa giải) DNA sau đƣợc tách chiết bảo quản -40ºC Phụ lục Cách xác định đo huỳnh quang Qubit 2.0 Bƣớc 1: Chuẩn bị tube 0,5 mL ghi nhãn cho mẫu cần đo hàm lƣợng DNA mẫu chuẩn Bƣớc 2: Pha dung dịch Qubit™ working solution theo tỷ lệ Qubit™ dsDNA HS reagent 1:200 Qubit™ dsDNA HS buffer Bƣớc 3: Cho 190 μL Qubit™ working solution cho tube chuẩn bị cho mẫu chuẩn Bƣớc 4: Thêm 10 μL dung dịch chuẩn Qubit™ standard 1, cho tube riêng biệt mix đều, tránh tạo bọt Bƣớc 5: Thêm Qubit™ working solution cho tube sử dụng để đo nồng độ DNA mẫu để thể tích cuối đạt 200 μL Bƣớc 6: Thêm mẫu vào tube có dung dịch Qubit™ working solution chuẩn bị trƣớc đo, với thể tích dao động từ – 20 μL, mix – giây Bƣớc 7: Đặt mẫu phút nhiệt độ phòng Bƣớc 8: Cài đặt máy đo Qubit 2.0 cách chọn DNA, sau ấn chọn dsDNA High Sensitivity Ở hình chính, chọn Yes No để tiến hành xác định đƣờng chuẩn Bƣớc 9: Thiết lập đƣờng chuẩn - Đặt tube có chứa dung dịch Standard #1 vào máy, đóng nắp, ấn READ Lấy tube - Đặt tube có chứa dung dịch Standard #2 vào máy, đóng nắp, ấn READ Lấy tube Bƣớc 10: Đặt lần lƣợt tube có chứa mẫu cần đo vào máy, đóng nắp ấn READ để máy tiến hành đo Bƣớc 11: Xác định nồng độ DNA theo công thức Nồng độ DNA = QF value x 200𝐴 Trong đó: QF value: Giá trị hiển thị máy Qubit A thể tích DNA cho vào ban đầu Phụ luc Mẫu nồng độ DNA tƣơng ứng cá thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus Côn Đảo A1 - Khánh Hòa Nha Trang - Khánh Kiên Giang Hòa Tên Nồng độ Tên Nồng độ Tên mẫu Nồng độ Tên Nồng độ mẫu (ng/µl) mẫu (ng/µl) (ng/µl) mẫu (ng/µl) Y41 3,0 Y91 3,0 PNT1 16,3 KG1 24,0 Y43 3,1 Y94 16,0 PNT2 8,7 KG2 24,0 Y44 3,7 Y96 3,1 PNT3 3,9 KG3 24,0 Y46 5,7 Y97 11,6 PNT4 5,4 KG4 24,0 Y47 4,2 Y99 9,3 PNT5 7,1 KG5 15,8 Y48 4,87 Y101 7,1 KG6 24,0 Y50 13,27 Y103 9,8 KG7 24,0 Y51 3,0 Y106 3,6 KG8 18,0 Y52 3,1 Y108 3,5 KG9 24,0 Y53 5,8 Y111 4,9 KG10 4,7 Y54 11,8 Y112 5,6 KG11 5,1 Y55 11,3 Y115 6,2 KG12 24,0 Y57 7,7 Y116 3,0 KG13 5,2 Y59 8,7 Y120 9,6 KG14 3,4 Y62 8,1 Y124 3,6 KG15 15,3 Y65 11,9 Y125 5,1 KG16 5,6 Y68 16,9 KG17 19,8 Y75 6,4 KG18 24,0 Y76 4,0 KG19 24,0 Y78 8,1 KG20 23,8 Y79 6,7 KG21 24,0 Y81 3,3 KG22 24,0 Y82 3,2 KG23 19,8 KG24 10,8 KG25 10,9 KG27 12,8 KG28 12,0 KG29 10,2 KG30 6,7 KG31 4,7 Phụ lục 4: Bảng adapter đƣợc gắn cho mẫu quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus I Quần thể A1- Khánh Hòa II Quần thể Côn Đảo Y41 TATAGCCT-AGCGATAG Y91 TATAGCCT-GAGATTCC Y43 TAATCTTA-ATTCAGAA Y94 TATAGCCT-TCCGCGAA Y44 CAGGACGT-ATTCAGAA Y96 ATAGAGGC-GAGATTCC Y46 ATAGAGGC-AGCGATAG Y97 ATAGAGGC-ATTACTCG Y47 GTACTGAC-ATTCAGAA Y99 CCTATCCT-GAGATTCC Y48 CCTATCCT-AGCGATAG Y101 GGCTCTGA-GAGATTCC Y50 GGCTCTGA-AGCGATAG Y103 AGGCGAAG-GAGATTCC Y51 CAGGACGT-TAATGCGC Y106 TAATCTTA-GAGATTCC Y52 TAATCTTA-AGCGATAG Y108 CAGGACGT-GAGATTCC Y53 CAGGACGT-AGCGATAG Y111 GTACTGAC-GAGATTCC Y54 TATAGCCT-AGCGATAG Y112 TATAGCCT-TCCGCGAA Y55 GTACTGAC-TAATGCGC Y115 ATAGAGGC-TCCGCGAA Y57 ATAGAGGC-TCTCGCGC Y116 CCTATCCT-TCCGCGAA Y59 CCTATCCT-TCTCGCGC Y120 GGCTCTGA-TCCGCGAA Y62 GGCTCTGA-TCTCGCGC Y124 AGGCGAAG-TCCGCGAA Y65 AGGCGAAG-TCTCGCGC Y125 TAATCTTA-TCCGCGAA Y68 CCTATCCT- GAATTCGT Y75 TAATCTTA-TCTCGCGC Y76 CAGGACGT-TCTCGCGC Y78 CCTATCCT-GAATTCGT Y79 GGCTCTGA-GAATTCGT Y81 AGGCGAAG-GAATTCGT Y82 TAATCTTA-GAATTCGT III Quần thể Nha Trang- Khánh Hòa IV Quần thể Kiên Giang PNT1 AGGCGAAG-AGCGATAG KG1 CCTATCCT- TCCGGAGA PNT2 TAATCTTA-AGCGATAG KG2 GGCTCTGA- TCCGGAGA PNT3 CAGGACGT-AGCGATAG KG3 AGGCGAAG-TCCGGAGA PNT4 TATAGCCT-TCCGCGAA KG4 TAATCTTA-TCCGGAGA PNT5 ATAGAGGC-ATTACTCG KG5 CAGGACGT- TCCGGAGA KG6 GTACTGAC- TCCGGAGA KG7 AGGCGAAG-CGCTCATT KG8 TAATCTTA-CGCTCATT KG9 CAGGACGT-CGCTCATT KG10 TATAGCCT-GAGATTCC KG11 ATAGAGGC-GAGATTCC KG12 GTACTGAC-CGCTCATT KG13 CCTATCCT-GAGATTCC KG14 GGCTCTGA-GAGATTCC KG15 AGGCGAAG-GAGATTCC KG16 TAATCTTA-GAGATTCC KG17 CAGGACGT-GAGATTCC KG18 GTACTGAC-GAGATTCC KG19 AGGCGAAG- TCTCGCGC KG20 TAATCTTA-TCTCGCGC KG21 CAGGACGT-TCTCGCGC KG22 GTACTGAC-TCTCGCGC KG23 TATAGCCT-TAATGCGC KG24 ATAGAGGC-TAATGCGC KG25 CCTATCCT-TAATGCGC KG27 GGCTCTGA-TAATGCGC KG28 AGGCGAAG-TAATGCGC KG29 TAATCTTA-TAATGCGC KG30 CAGGACGT-TAATGCGC KG31 GTACTGAC-TAATGCGC ... thực đề tài Ứng dụng thị SNPs nghiên cứu di truyền quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus (Thunberg, 1812) khu vực Trung Nam bộ, Việt Nam Mục tiêu đề tài Mục tiêu đề tài áp dụng phƣơng... chiếu chim yến tổ trắng (Aerodramus fuciphagus) 29 3.1.4 Phát thị SNPs quần thể quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus 31 3.1.5 Xây dựng cấu trúc quần thể chim yến. .. VÀ MÔI TRƢỜNG BỘ MÔN SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SNPs TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TỔ TRẮNG Aerodramus fuciphagus (THUNBERG, 1812) TẠI KHU VỰC