BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ỨNG DỤNG CHỈ THỊ MICROSATELLITE TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TỔ TRẮNG Aerodramus fuciphagus Thunberg 1812 PHÂN BỐ TRÊN MỘT SỐ ĐẢO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn : ThS Vũ Đặng Hạ Quyên Sinh viên thực : Nguyễn Thị Kim Truynh Mã số sinh viên : 55132172 Khánh Hòa, năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ỨNG DỤNG CHỈ THỊ MICROSATELLITE TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TỔ TRẮNG Aerodramus fuciphagus Thunberg 1812 PHÂN BỐ TRÊN MỘT SỐ ĐẢO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn : ThS Vũ Đặng Hạ Quyên Sinh viên thực : Nguyễn Thị Kim Truynh Mã số sinh viên : 55132172 Khánh Hòa, tháng 06 năm 2017 i LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, trƣớc tiên em bày bỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình Ths Vũ Đặng Hạ Quyên tận tình bảo hƣớng dẫn em suốt thời gian nghiên cứu thực đồ án Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo thuộc viện Công nghệ sinh học Môi trƣờng giảng dạy, truyền đạt kiến thức bổ ích cho em suốt trình học tập năm qua Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm thí nghiệm thực hành, Trƣờng Đại học Nha Trang tạo điều kiện sở vật chất cho em suốt trình thực đồ án Em xin cảm ơn đề tài ―Khai thác phát triển nguồn gen chim yến đảo (Aerodramus fuciphagus germani Oustalet, 1878) phục vụ phát triển bền vững nghề chim yến Việt Nam‖ Công ty TNHHMTV Yến sào Khánh Hòa tài trợ kinh phí hỗ trợ thu mẫu để thực hoàn thành đồ án thời hạn Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè anh chị phòng thí nghiệm Sinh học phân tử quan tâm, giúp đỡ hỗ trợ em suốt thời gian thực để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Mặc dù, em cố gắng để hoàn thiện đồ án nhƣng thời gian kiến thức hạn chế, nên trình thực đồ án tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận đƣợc góp ý thầy, cô giáo để đồ án đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 25 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Kim Truynh ii TÓM TẮT Chim yến (giống Aerodramus fuciphagus) loài chim có giá trị kinh tế cao từ nguồn lợi tổ yến thu đƣợc Chim yến hàng Aerodramus fuciphagus loài chim phân bố vùng Đông Nam Á có giá trị kinh tế cao Việt Nam có lợi bao gồm nhiều đảo quần đảo, với điều kiện khí hậu thuận lợi thích hợp cho loài chim yến đến làm tổ sinh sống, phân loài Aerodramus fuciphagus germani phân loài đặc hữu Việt Nam, phân bố chủ yếu tỉnh từ Quảng Bình đến Phú Quốc Ngày nay, ảnh hƣởng việc khai thác mức nhƣ phát triển mạnh mẽ nghề nuôi chim yến nhà, đặt sức ép lớn quần thể chim yến đảo tự nhiên Đồng thời, chim yến bắt đầu có phân bố nhiều nơi, ghi nhận diện chim yến khu vực phía Bắc Việt Nam nơi chúng không sinh sống trƣớc đây, khiến cho việc xác định nguồn gốc trở nên khó khăn Nghiên cứu áp dụng thị Microsatellite việc phân tích di truyền quần thể chim yến Aerodramus fuciphagus đảo Việt Nam Từ 53 cá thể chim yến đƣợc thu từ quần thể thuộc Hội An (Quảng Nam), Nha Trang (Khánh Hòa) Côn Đảo (Bà Rịa – Vũng Tàu), quần thể chim yến đảo đƣợc khỏa sát dựa locus microsatellite Kết phân tích cho thấy có kết nối quần thể chim yến đảo Khánh Hòa Hội An chung nguồn gốc tổ tiên từ lâu đời Tuy nhiên, biến đổi locus microsatellite mà quần thể Côn Đảo có phân tách quần thể Hội An Nghiên cứu góp phần khảo sát đa dạng di truyền chim yến hàng Aerodramus fuciphagus, đồng thời cung cấp liệu đầu vào cấu trúc kết nối quần thể chim yến phân ố đảo Việt Nam, làm sở cho việc xây dựng chiến lƣợc quản l ảo tồn nguồn lợi chim yến Từ khóa : Aerodramus fuciphagus, microsatellite, đa dạng di truyền iii MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i TÓM TẮT ii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU CHUƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus Thunberg -1812 1.1.1 Khái quát hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Vị trí địa lý phân bố 1.1.4 Tập tính hành vi 1.2 Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu 1.2.1 Khái niệm microsatellite 1.2.2 Tính chất chế hình thành microsatellite 1.2.3 Ứng dụng microsatellite nghiên cứu di truyền 1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus Thunberg – 1812 10 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 10 1.3.1.1 Các nghiên cứu phân loại dựa vào đặc điểm hình thái tiếng vang 10 1.3.1.2 Các nghiên cứu quần thể chim yến tổ trắng 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 13 1.3.2.1 Nghiên cứu dựa đặc điểm hình thái 13 1.3.2.2 Nghiên cứu quần thể chim yến 14 CHƢƠNG II: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Địa điểm phƣơng pháp thu mẫu 17 2.2 Nghiên cứu di truyền quần thể chim yến tổ trắng sử dụng dụng thị phân tử microsatellite 18 2.3 Tách chiết DNA, khuếch đại phân tích locus microsatellite 19 iv 2.4 Phƣơng pháp xử lý phân tích liệu microsatellite 23 2.4.1 Khảo sát đa dạng di truyền chim yến đảo Việt Nam 23 2.4.2 Xây dựng cấu trúc quần thể chim yến đảo Việt Nam 23 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết nghiên cứu 25 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 25 3.1.2 Phân tích microsatellite 25 3.1.3 Phân tích liệu microsatellite 27 3.1.3.1 Các số đa dạng di truyền 27 3.1.3.2 Chỉ số AMOVA (Molecular Variation Analysis) 28 3.1.3.3 Chỉ số sai khác di truyền 28 3.1.3.4 Xây dựng cấu trúc di truyền quần thể chim yến đảo Việt Nam 29 3.2 Thảo luận 32 3.2.1 Về cấu trúc di truyền quần thể 32 3.2.2 Sự đa dạng di truyền quần thể chim yến đảo 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 Kết luận 38 Đề xuất ý kiến 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái chim yến Aerodramus fuciphagus Hình 1.2 Hình ảnh miêu tả động tác bay không chim yến A fuciphagus5 Hình 1.3 Bản đồ thể phân bố loài chim yến khu vực Đông Nam Á Hình 1.4 Mô trình trƣợt lỗi enzyme polymerase trình nhân đôi DNA Hình 1.5 Sự hình thành microsatellite thông qua trình bắt cặp không hai nhiễm sắc tử chị em (sister chromatids) Hình Bản đồ thu mẫu chim yến nghiên cứu 18 Hình 2 Sơ đồ khái quát trình tiến hành nghiên cứu 19 Hình Chu trình nhiệt phản ứng PCR 22 Hình Phân tích trình tự Microsatellite dạng đồ thị hóa 23 Hình Kết điện di DNA tổng số mẫu phôi chim yến Aerodramus fucifagus 25 Hình Locus microsatellite chim yến Aerodramus fuciphagus 26 Hình 3 Phân tích AMOVA quần thể chim yến đảo Việt Nam 28 Hình Phân tích cấu trúc quần thể thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus dựa phần mềm STRUCTURE 30 Hình Cấu trúc di truyền quần thể dựa chƣơng trình DAPC 31 Hình Mạng lƣới haplotype quần thể chim yến A fuciphagus Việt Nam 33 vi DANH MỤC BẢNG Bảng Số lƣợng mẫu yến thu đƣợc cho nghiên cứu 17 Bảng 2 Các cặp mồi microsatellite sử dụng nghiên cứu 20 Bảng Các phản ứng PCR nghiên cứu 21 Bảng Kích thƣớc số alen thuộc locus nghiên cứu 27 Bảng Giá trị trung bình số di truyền quần thể nghiên cứu 28 Bảng 3 Giá trị sai khác di truyền (pairwise FST) quần thể nghiên cứu 29 Bảng Tỷ lệ phân nhóm quần thể 30 vii DANH MỤC VIẾT TẮT SSR: Simple Sequence Repeat STR: Short Tandem Repeat VNTR: Variable Number of Tandem Repeat TR: Tandem Repeat SNP: Single Nucleotide polymorphism Fib: Fibrinogen Cytb: Cytochrome b ND: NADH dehydrogenase mtDNA: mitochondrial DNA rRNA: ribosome RNA PCR: Polymerase Chain Reation V: version MCMC: Markov Chain Monte Carl DAPC: Discriminent Analysis of Principal Components GAPDH: Glyceraldehyde phosphate dehyrogenase MỞ ĐẦU Việt Nam nƣớc có bờ biển dài, nhiều đảo hang đá tự nhiên tạo điều kiện cho chim yến đến sinh sống làm tổ nên từ lâu nghề nuôi chim yến đảo thiên nhiên nƣớc ta phát triển tận ngày Hiện nay, chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus đối tƣợng đƣợc quan tâm nguồn lợi kinh tế từ tổ yến mà chúng mang lại Tổ chim yến đƣợc tạo nên hoàn toàn từ nƣớc bọt chim yến chứa hàm lƣợng chất dinh dƣỡng cao, mà đƣợc định giá cao thị trƣờng cộng thêm nhu cầu thị trƣờng lớn dẫn đến việc khai thác mức quần thể chim yến tự nhiên (Lê Hữu Hoàng, 2015) Ngoài ra, cạnh tranh thức ăn, nơi hang chim yến làm nhiều chim non bị chết Nhiều chim bố mẹ ị chết bị dính nƣớc bọt chim yến xây tổ tổ bên cạnh chƣa đông cứng hay mối quan hệ khác loài nguyên nhân khiến cho quần thể chim yến bị thay đổi (Võ Tấn Phong, 2014) Từ năm 2004 trở lại đây, nƣớc ta, chim yến tổ trắng vào sinh sống làm tổ nhà hầu hết tỉnh từ Thanh Hóa đến Cà Mau, Phú Quốc – Kiên Giang tỉnh phía tây nhƣ Bình Phƣớc, Đắk Lắk Nghề nuôi chim yến nƣớc ta ngày phát triển, chim yến nhà ngày phân bố rộng khắp địa phƣơng nƣớc tạo hội phát triển kinh tế Tuy nhiên, vấn đề bảo tồn lƣu giữ nguồn gen quý loài trở nên cấp thiết thông tin phân loại nguồn gốc quần thể chim yến chƣa rõ ràng (Lê Hữu Hoàng, 2015) Theo liệu nghiên cứu Lê Hữu Hoàng ctv (2014) dựa gen Cytb (cytochrome b) thuộc mtDNA (DNA ty thể) gen nhân GAPDH (Glyceraldehyde phosphate dehyrogenase) cho thấy nhóm cá thể chim yến tổ trắng thu Côn Đảo có phân tách, nhóm cá thể chia sẻ chung haplotype với quần thể đảo A2, A6 (Khánh Hòa) Bên cạnh đó, chƣa có nghiên cứu cụ thể đến quần thể chim yến đảo để đƣa định can thiệp phù hợp, có số nghiên cứu cho thấy suy giảm số lƣợng quần thể chim yến tổ trắng tự nhiên thông quan suy giảm số lƣợng tổ số lƣợng hang động bị bỏ hoang ngày tăng (Sankaran, 2001) 36 cao Điều cho thấy có phân tách rõ quần thể Hội An – Côn Đảo (0.11630) với quần thể Hội An – Khánh Hòa có phân tách nhƣng chƣa rõ ràng (0.05685) 3.2.2 Sự đa dạng di truyền quần thể chim yến đảo Việc sử dụng rộng rãi thị phân tử góp phần làm sáng tỏ mối quan hệ loài, đa dạng di truyền cấu trúc quần thể Sự xuất thƣờng xuyên nhiều alen vị trí microsatellite cung cấp đầy đủ thông tin di truyền, nên chúng đƣợc quan tâm nghiên cứu di truyền, bảo tồn sinh vật (Selkoe Toonen, 2006) Nhiều nghiên cứu sử dụng microsatellite để khảo sát đa dạng di truyền cấu trúc quần thể Mức độ đa dạng di truyền quần thể chim yến đảo A1-Khánh Hòa quần thể Côn Đảo cao quần thể Hội An Mức độ đa dạng di truyền thấp quần thể Hội An số nguyên nhân khách quan nhƣ môi trƣờng sinh vật ị thay đổi tác động thời tiết, khí hậu hay ngƣời; nguyên nhân chủ quan số lƣợng thu mẫu hạn chế cho việc đánh giá Nhìn chung, giá trị dị hợp tử quan sát cao giá trị dị hợp tử mong đợi quần thể chim yến đảo Quần thể chim nhàn Sterna hirundo cƣ trú Bermuda trải qua hiệu ứng cổ chai (Bottleneck Effect) sau trận bão xảy vào năm 2003 Sau đó, Szczys ctv (2012) sử dụng locus microsatellite nhằm đánh giá đa dạng di truyền quần thể chim nhàn Sterna hirundo sau tƣợng nút thắt cổ chai Qua nghiên cứu, tác giả thấy quần thể đa dạng di truyền với số lƣợng alen dị hợp tử quan sát thấp Đồng thời qua giá trị pairwise FST cho thấy tách biệt hoàn toàn dấu hiệu di cƣ loài chim nhàn Sterna hirundo từ quần thể khác Từ đó, tác giả cho quần thể Bermuda ị đe dọa nghiêm trọng đề xuất hƣớng bảo tồn quần thể Janowski ctv (2016) nghiên cứu tìm thị Micorsatellite loài chim nhàn Sterna hirundo Wilhelmshaven (Đức) kỹ thuật 454 ShotGun Pyrosequencing Nghiên cứu cho thấy giá trị đa hình (PIC) khoảng 0.67, số lƣợng alen có dao động 4-12 alen locus; locus số dị hợp tử quan sát Ho đa số thấp số di hợp tử mong đợi He Từ kết nghiên cứu, tác giả nhận định xảy giao phối cận huyết loài chim nhàn Đồng thời, nghiên cứu cung cấp thông tin di truyền cặp chim nhàn bố mẹ 37 Draheim ctv (2010) nghiên cứu phân loài cấu trúc quần thể loài Sternula antillarum thuộc họ chim Nhàn vùng biển California, Interior vùng phía đông (Mỹ) thị mtDNA microsatellite Nghiên cho thấy mức độ đa dạng di truyền thông qua microsatellite (12-30 alen/locus) cao mtDNA (7-10 alen/locus), nhiên nhìn chung thị sử dụng nghiên cứu cho thấy đa dạng di truyền cao Cấu trúc quần thể cho thấy tách biệt quần thể Qua so sánh số nghiên cứu từ đối tƣợng chim sống đảo khác, cho thấy quần thể chim yến đảo Việt Nam mức độ cân số lƣợng nhƣ mức độ cân di truyền Từ kế hoạch bảo tồn đƣợc thực tốt cần trì tình trạng tƣơng lai để đảm bảo nguồn lợi chim yến 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Tách chiết DNA tổng số chim yến từ mẫu phôi thu đƣợc khu vực: đảo Hội An, đảo A1 – Khánh Hòa, Côn Đảo – Bà Rịa Vũng Tàu Khuếch đại phân tích locus microsatellite chim yến Aerodramus fuciphagus Phân tích đa dạng di truyền xây dựng đƣợc cấu trúc di truyền quần thể chim yến đảo Việt Nam dựa thị microsatellite nhƣ sau: - Quần thể chim yến có kết nối với quần thể chim yến Hội An Côn Đảo, nhiên quần thể Côn Đảo quần thể Hội An lại có phân tách rõ rệt - Quần thể chim yến đảo Việt Nam xuất phân nhóm di truyền bao gồm ba nhóm Nhóm thứ chiếm ƣu quần thể đảo A1 – Khánh Hòa Hội An, nhóm thứ ba chiếm ƣu quần thể Côn Đảo, nhóm thứ ba phân bố hai quần thể Côn Đảo đảo A1 - Khánh Hòa - Quần thể đảo A1 quần thể Côn Đảo cho thấy mức đa dạng di truyền cao quần thể chim yến Hội An Đề xuất ý kiến Tiếp tục thu mẫu khu vực đảo có chim yến sinh sống nhƣ khu vực Ninh Thuận, Phú Yên, Bình Định để mở rộng khu vực nghiên cứu Tăng số lƣợng mẫu khu vực nghiên cứu lên 32 mẫu/khu vực để đảm bảo nghĩa thống kê Tiếp tục có nghiên cứu sâu hơn, kết hợp sử dụng thêm thị phân tử khác nhau, nhằm có đƣợc hiểu biết sâu quần thể chim yến đảo Từ đề phƣơng hƣớng quy hoạch bảo tồn loài chim yến, có giá trị kinh tế cao 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đinh Thị Phƣơng Anh (2011) Nghiên cứu số đặc điểm sinh thái học chim Yến hàng điều kiện tự nhiên đảo Cù Lao Chàm, Hội An Quảng Nam Tạp chí khoa học công nghệ đại học Đà Nẵng 3(44), 111 – 118 Hồ Thị Loan, Đặng Tất Thế, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Lân Hùng Sơn, Võ Tấn Phong (2015) Xác định giới tính chim yến hàng tỉnh Quảng Nam kỹ thuật PCR Hội nghị Khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 6, 653 – 658 Hồ Thị Loan, Nguyễn Giang Sơn, Đặng Tất Thế, Nguyễn Lân Hùng Sơn (2015) Mối quan hệ di truyền số quần thể chim yến sống đảo đất liền Việt Nam Hội nghị Khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 6, 228 – 235 Lê Hữu Hoàng (2015) Kỹ thuật nuôi chim yến – Khoa học thực tiễn Nhà xất Khoa học Kỹ Thuật Lê Hữu Hoàng, Đặng Thúy Bình, Nguyễn Thị Anh Thƣ, Lê Công Bình (2014) Nghiên cứu đặc điểm di truyền phân loài chim yến (Aerodramus fuciphagus) Việt Nam Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn Kỳ tháng 1/2014, 77 – 82 Nguyễn Khoa Diệu Thu, Nguyễn Phƣơng Nam, Đặng Văn Nguyên, Nguyễn Xuân Mai & Nguyễn Văn Tuyên (2009) Nghiên cứu nuôi thử nghiệm chim yến nhà để lấy tổ án đảo Phƣơng Mai Bình Định Nguyễn Quang Phách (1993) Cơ sở sinh học việc khai thác hợp lý, bảo vệ phát triển nguồn lợi chim yến hàng (Collocalia fuciphaga germani Oustalet) Việt Nam, Luận án tiến sĩ, Đại học Tổng hợp Hà Nội Nguyễn Quang Phách (1999) Tuyển tập tóm tắt kết đề tài nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ môi trƣờng tỉnh Khánh Hoà 10 năm (1989 – 1999) Sở KHCN & MT Khánh Hoà Võ Quí (1975) Chim Việt Nam, Hình thái Phân loại Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, 1, 524 – 534 10 Võ Tấn Phong, Lê Đình Thủy, Đinh Thị Phƣơng Anh (2015) Nghiên cứu ảnh hƣởng số nhân tố sinh thái nơi làm tổ đến sinh sản quần thể chim yến 40 tổ trắng Aerodramus fuciphagus (Thurnberg, 1812) quần đảo Cù Lao Chàm, Hội An, Quảng Nam Hội nghị Khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ 6, 1568 – 1573 Tài liệu nƣớc Aowphol A., Voris H K., Feldheim K A., Harnyuttanakorn P., Thirakhupt K (2008) Genetic homogeneity among colonies of the white-nest swiftlet (Aerodramus fuciphagus) in Thailand Zoolog Sci 25(4), 80-372 Chantler P & Driessens G (2000) Swifts: a guide to the swifts and treeswifts of the world Pica Press, Roberstbridge Clements J F (2009), The Clements Checklist of Birds of the World 6th Cornell University Press Clements R., Sodhi N S., Schilthuizen M (2006) Limestone Karsts of Southeast Asia Imperiled Arks of Biodiversity BioScience 56(9), 733-742 Cranbrook E.O., Lim G.W., Koon L.C., Abdulrahman M (2013) The species of white-nest swiftlets (Apodidae,Collocaliini) of Malaysia and the origins of housefarmbirds: morphometric and genetic evidence Forktail, 29: 107-119 Dickinson E.C 2003 The Howard & Moore Complete Checklist of the Birds of the World, 3rd Edition Christopher Helm, London, 1-1039 Earl D.A & vonHold B.M (2012) STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method Conservation Genet Resour 4, 359 – 361 Evanno G., Regnaut S., Goudet J (2005) Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study Mol Ecol 14, 2611– 2620 Excoffier L & Lischer H.E (2010) Arlequin suite ver 3.5: a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows Molecular Ecology Resources 10(3), 564 – 567 10 Francis, C M (1987) The Management of Edible Bird's Nest Caves in Sabah: Wildlife Section, Sabah Forest Department 11 Fullard J H., Barclay R M R., Thomas D W (1993), Echolocation in Free-Flying Atiu Swiftlets (Aerodramus sawtelli) Biotropica, 25(3): 334 – 339 41 12 Gemayel R., Vinces M.D., Legendre M., Verstrepen K.J (2010) Variable tandem repeats accelerate evolution of coding and regulatory sequences Annu Rev Genet (44), 445–477 13 Hans Ellegren (2004) Microsatellites: simple sequences with complex evolution Nature Reviews Genetics 5, 435-445 14 Hope M D., Mark P M., Patricia B., Susan M H (2010) Subspecific Status and Population Genetic Structure of Least Terns (Sternula antillarum) Inferred by Mitochondrial DNA Control-Region Sequences and Microsatellite DNA The Auk 127(4), 807-819 15 IOC (2013) Word Bird Names (http://worldbirdnames.org ) 16 Janowski S., Gross I., Sauer-GürthH., Tietze D T., Grohme M., Frohme M., Becker P (2016) New Microsatellite Markers for the Common Tern (Sterna hirundo) Developed with 454 Shot-Gun Pyrosequencing The Open Ornithology Journal 10, 50 – 59 17 Jombart T., Devillard S., Balloux F (2010) Discriminant analysis of principal components: a new method for the analysis of genetically structured populations BMC Genetics 11, 94 18 Jombart, T (2008) adegenet: a R package for the multivariate analysis of genetic markers Bioinformatics 24: 1403-1405 19 Kolade O.M (2014) Morphometry of and genetic variation in mtDNA of the edible nest swiftlet (Aerodramus fuciphagus Thurnberg) in Malaysia Thesis of Master University Putra Malaysia 20 Lee, P L., Clayton, D H., Griffiths, R., & Page, R D (1996) Does behavior reflect phylogeny in swiftlets (Aves: Apodidae)? A test using cytochrome b mitochondrial DNA sequences Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(14), 7091-7096 21 Lepage, Denis (2007) Checklist of bird of Vietnam Bird Checklist of the World Avibase 22 Li Y-C, Korol AB, Fahima T, Beiles A and Nevo E (2002) Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review Mol Ecol 11, 2453-2465 42 23 Ma Z.Q., Ro¨der MS, Sorrells M.E (1996) Frequencies and sequence characteristics of di-, tri-, and tetranucleotide microsatellites in wheat Genome 39,123–130 24 Mason A.S (2015) SSR Genotyping In: Batley J (ed) Plant Genotyping Springer, New York, NY, pp 77-89 25 Mayr G., Manegold A (2006): A Samll Subloscine-like Passeriform Bird from the Early Oligocene of France Condor 108 (3): 717 – 720 26 Nguyen, Q P., Quang, P N., Vo, Q Y., Quang, Y V., & Voisin, J F (2002) The White-nest Swiftlet and the Black-nest Swiftlet: A Monograph : with Special Reference to Vietnamese Populations Société nouvelle des éditions Boubée 27 Peakall R., Smouse P.E (2012) GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel Population genetic software for teaching and research—an update Bioinformatics 28(19), 2537 – 2539 28 Pérez-Jiménez M., Besnard G., Dorado G and Hernandez P (2013) Varietal tracing of virgin olive oils based on plastid DNA variation profiling PloS One (8), 70507 29 Phumichai C., Phumichai T and Wongkaew A (2015) Novel chloroplast microsatellite (cpSSR) markers for genetic diversity assessment of cultivated and wild Hevea rubber Plant Mol Biol Report (33), 1486-1498 30 Price J.J., Johnson K.P., Bush S.E., Clayton D.H (2005) Phylogenetic relationships of the Papuan Swiftlet Aerodramus papuensis and implications for the evolution of avian echolocation Ibis 147 (4), 790 – 796 31 Price, J J., Johnson, P K., & Clayton, H D (2004) The evolution of echolocation in swiftlets Journal of Avian Biology 35(2), 135-143 32 Pritchard J K., M Stephens and P Donnelly (2000) Inference of population structure using multilocus genotype data Genetics 155, 945–959 33 Pritchard J.K., Wen X., Falush D (2010), and Documentation for STRUCTURE software 34 Sankaran, R (2001) The status and conservation of the Edible-nest Swiftlet (Collocalia fuciphaga) in the Andaman and Nicobar Islands Biological Conservation 97(3), 283-294 43 35 Selkoe K.A & Toonen R.J (2006) Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers Ecol Lett 9(5), 615 – 629 36 Sibley, Charles Gald & Ahlquist, Jon Edward (1990) Phylogeny and classification of birds Yale University Press, New Haven, Conn 37 Szczys P., Nisbet I C T., Wingate D B (2012) Conservation genetics of the Common Tern (Sterna hirundo) in the North Atlantic region; implications for the critically endangered population at Bermuda Conservation Genetics 13(4), 1039 – 1043 38 Thomassen, H A (2005) Swift as Sound: Design and Evolution of the Echolocation System in Swiftlets (Apodidae: Collocaliini) 39 Thomassen, H A., den-Tex, Robert-Jan, de-Bakker, M A G., & Povel, G D E (2005) Phylogenetic relationships amongst swifts and swiftlets: A multi locus approach Molecular Phylogenetics and Evolution, 37(1), 264-277 40 Thomassen, H A., Wiersema, A T., de Bakker, M A., de Knijff, P., Hetebrij, E., & Povel, G D (2003) A new phylogeny of swiftlets (Aves: Apodidae) based on cytochrome-b DNA Mol Phylogenet Evol, 29(1), 86-93 41 Vieira L.C., Santini L., Diniz L.A., Munhoz F.C (2016) Microsatellite markers: what they mean and why they are so useful Genet Mol Biol vol39 (3), 312 – 328 42 Viruhpintu, S (2002) Breeding Biology of the White-Nest Swiftlet Aerodramus fuciphagus (Thunberg, 1812) in Man-Made and Natural Habitats PhD Dissertation, Chulalongkorn University PHỤ LỤC Phụ Lục Nội dung Số trang Phụ lục Quy trình tách chiết DNA tổng số kit Qiagen Phụ lục Quy trình điện di DNA Phụ lục Dữ liệu sử dụng cho phân tích di truyền PHỤ LỤC Quy trình tách chiết DNA tổng số kit Qiagen Bƣớc 1: Lấy 25 mg mẫu phôi yến cho vào tube 1,5 mL Bƣớc 2: Thêm 180 µL đệm ATL 20 µ> proteinase K, mix Bƣớc 3: Ủ 56oC mẫu tan hoàn toàn, mix 15s Bƣớc 4: Thêm 200 µL Buffer AL, mix Bƣớc 5: Thêm 200 µL ethanol (96 – 100oC), mix Bƣớc 6: Dùng pipet hút toàn dịch chuyển sang tube có cột lọc mL (có sẵn) Bƣớc 7: Ly tâm 8.000 vòng/phút 1phút Bƣớc 8: Loại bỏ dịch thu cột lọc Bƣớc 9: Đặt cột lọc sang tube mL (có sẵn) Bƣớc 10: Thêm 500 µL đệm AW1, ly tâm phút 8.000 vòng/phút Bƣớc 11: Loại bỏ dịch thu cột lọc Bƣớc 12: Đặt cột lọc sang tube mL (có sẵn) Bƣớc 13: Thêm 500 µL Buffer AW2, ly tâm phút 13.000 vòng/phút Bƣớc 14: Loại bỏ dịch chuyển cột lọc trênsang tu e 1,5 mL (không có sẵn) Bƣớc 15: Thêm 50 µL đệm AE, ủ 3-5 phút nhiệt độ phòng, ly tâm phút 8.000 vòng/phút thu đƣợc 100 µL bảo quản DNA -20oC PHỤ LỤC Quy trình điện di DNA  Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Bƣớc 1: Cân 0,6g agarose thêm 40mL đệm TBE 1X chứa bình tam giác 100mL thứ nhất, cân khối lƣợng ình, đun sôi lò vi sóng agarose tan hoàn toàn Bƣớc 2: Cân lại khối lƣợng ình thêm nƣớc cất vào cho đạt khối lƣợng an đầu Để nguội 60°C - 70°C, chuyển qua bình tam giác 100mL thứ hai thêm 2µL Ethidium bromide 10mg/mL, lắc nhẹ để tránh tạo bọt trộn (lƣu hóa chất độc hại cần tuyệt đối cẩn thận thao tác) Bƣớc 3: Đổ gel khuôn đƣợc lắp đặt sẵn Khi gel nguội hoàn toàn đông cứng lại, rút nhẹ lƣợt theo phƣơng thẳng đứng để tránh làm rách giếng Bƣớc 4: Bảo quản gel đệm TBE 1X  Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di thêm đệm TBE 1X ngập gel Dùng micropipette trộn 3µL mẫu, ơm vào giếng gel Hút µL DNA Ladder (thang DNA) vào giếng Tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90V, 400mA 30 phút PHỤ LỤC Dữ liệu sử dụng cho phân tích di truyền 53 Population HA 24 A1 22 CD SAMPLE POP HA1 HA 231 235 156 158 174 190 203 207 182 185 210 210 HA5 HA 246 246 165 169 175 187 196 216 182 182 207 211 HA6 HA 231 245 157 169 162 174 206 208 158 169 206 214 HA7 HA 235 253 169 169 174 174 199 203 169 169 202 210 HA8 HA 237 241 161 165 174 186 203 207 161 165 186 218 HA9 HA 231 239 156 169 174 190 211 215 169 182 202 214 HA10 HA 245 245 157 162 0 208 211 158 162 0 Y_41 A1 243 245 169 196 162 178 203 219 173 181 214 218 Y_42 A1 224 245 165 169 178 182 217 218 110 133 207 207 Y_43 A1 231 241 165 169 178 186 203 215 173 182 214 218 Y_44 A1 241 241 156 165 162 186 203 203 169 169 206 218 Y_46 A1 231 245 165 169 174 178 203 217 173 182 210 214 Y_47 A1 231 235 241 165 169 162 207 218 173 173 210 214 AEF_4 AEF_104 AEF_133 AEF_27 AEF_109 AEF_115 Y_48 A1 245 245 165 169 174 186 211 217 177 177 214 218 Y_49 A1 0 165 165 178 186 0 169 169 206 218 Y_50 A1 232 240 0 175 183 208 208 207 219 Y_51 A1 242 250 165 169 178 190 217 218 174 178 206 210 Y_52 A1 235 249 165 184 162 174 203 211 165 186 206 214 Y_53 A1 231 245 156 164 174 182 203 207 165 177 218 218 Y_54 A1 227 245 156 156 158 174 207 211 159 159 214 222 Y_55 A1 241 241 164 169 174 178 195 199 169 173 214 214 Y_57 A1 228 241 161 164 186 186 203 207 113 118 214 218 Y_65 A1 235 246 165 169 174 178 203 215 165 165 210 210 Y_68 A1 242 254 169 169 170 178 204 212 182 182 210 214 Y_73 A1 242 250 165 169 179 187 217 218 111 118 219 219 Y_74 A1 242 250 165 169 178 198 217 218 105 128 211 215 Y_78 A1 224 242 169 169 175 175 208 216 119 125 211 215 Y_79 A1 228 239 165 169 182 190 199 203 169 169 218 218 Y_81 A1 242 242 165 169 175 186 208 208 170 182 215 215 Y_82 A1 232 244 165 165 179 179 208 212 166 182 215 223 Y_83 A1 228 240 157 161 183 191 200 204 111 117 218 218 Y_101 CD 232 236 165 169 178 190 232 236 165 169 178 190 Y_103 CD 220 236 165 169 175 187 200 204 166 166 211 215 Y_106 CD 220 232 165 165 178 186 192 204 120 158 207 207 Y_108 CD 232 232 165 169 173 191 196 204 113 127 207 215 Y_111 CD 232 236 169 169 178 198 200 200 159 166 215 215 Y_112 CD 232 232 165 169 158 190 192 200 157 178 215 215 Y_115 CD 236 236 169 169 178 186 204 208 159 159 207 215 Y_116 CD 232 237 165 169 178 190 196 208 108 121 207 215 Y_119 CD 242 250 165 169 175 179 208 217 119 178 211 214 Y_120 CD 228 236 169 169 178 190 217 218 174 178 215 215 Y_121 CD 232 242 165 169 179 190 217 218 170 170 215 219 Y_122 CD 232 242 165 169 175 178 217 218 146 146 211 215 Y_123 CD 232 242 165 169 175 178 217 218 112 136 211 215 Y_124 CD 232 236 165 169 198 198 192 200 170 178 203 211 Y_125 CD 232 236 169 169 175 178 196 204 155 155 207 215 Y_91 CD 236 242 111 117 190 198 217 218 105 110 203 211 Y_92 CD 232 242 165 169 191 191 217 218 110 134 215 215 Y_94 CD 232 232 237 165 169 178 200 208 104 110 215 215 Y_95 CD 237 242 165 169 179 190 217 218 113 120 207 215 Y_96 CD 232 254 162 169 171 194 209 217 172 186 215 215 Y_97 CD 232 232 165 169 162 198 196 204 166 174 214 214 Y_99 CD 220 232 169 169 0 200 204 170 190 0 ... TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ỨNG DỤNG CHỈ THỊ MICROSATELLITE TRONG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ CHIM YẾN TỔ TRẮNG Aerodramus fuciphagus Thunberg 1812 PHÂN BỐ TRÊN MỘT SỐ ĐẢO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành:... dẫn liệu khoa học nêu trên, đề tài Ứng dụng thị microsatellite nghiên cứu di truyền quần thể chim yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus (Thunberg, 1812) phân bố số đảo Việt Nam đƣợc thực nhằm khảo... truyền quần thể chim yến Aerodramus fuciphagus - Khảo sát cấu trúc kết nối quần thể chim yến đảo Việt Nam Ý nghĩa đề tài Nghiên cứu sử dụng thành công thị microsatellite nghiên cứu di truyền chim yến