www.DaiHocThuDauMot.edu.vn I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Các hợp chất thiên nhiên đóng vai trò ngày quan trọng sống, đặc biệt lĩnh vực y dược nhằm nâng cao sức khỏe, phòng chống bệnh hiểm nghèo Nhiều loại thảo dược, sản phẩm thiên nhiên sử dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, dùng làm tiền chất cho tổng hợp hóa dược, cấu trúc chúng sử dụng chất dẫn đường để tìm kiếm dẫn xuất mới, có hoạt tính cao phục vụ việc phát triển thuốc chữa bệnh Sơn trà (Eriobotrya Lindl.) chi nhỏ thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae), có xuất xứ từ Đơng Đông nam Châu Á Kết nghiên cứu vài loài Eriobotrya phát nhiều hợp chất có cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học lý thú Cau chuột (Pinanga Blume) chi thực vật quan trọng họ Cau (Arecaceae), có nhiều lồi đặc hữu Việt Nam Một số loài thuộc chi Pinanga ứng dụng y học cổ truyền nay, chưa có cơng trình cơng bố thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Những sở khoa học thực tiễn nêu định hướng cho chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai lồi Sơn trà (Eriobotrya Lindl.) loài Cau chuột (Pinanga Blume) Việt Nam” Mục tiêu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học lồi Sơn trà poilane (Eriobotrya poilanei), loài Sơn trà nhật (Eriobotrya japonica) lồi Cau chuột núi (Pinanga duperreana) để tìm kiếm hợp chất có cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học lý thú nhằm khai thác tốt nguồn tài nguyên thực vật Nội dung nghiên cứu luận án o Thu hái mẫu thực vật, xác định tên khoa học xử lý mẫu; o Điều chế cặn chiết từ mẫu thực vật thu hái được; www.DaiHocThuDauMot.edu.vn o o o o Phân lập hợp chất từ cặn chiết; Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được; Chuyển hóa hóa học hợp chất phân lập có hàm lượng lớn; Thử hoạt tính sinh học chất phân lập dẫn xuất chuyển hóa Ý nghĩa khoa học luận án Luận án đóng góp kết nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Sơn trà (Eriobotrya) loài Cau chuột núi (Pinanga duperreana) Việt Nam, số dẫn xuất bán tổng hợp từ axit ursolic Các kết luận án tạo tiền đề cho nghiên cứu chi Sơn trà chi Cau chuột nhằm khai thác ứng dụng có hiệu hoạt tính q báu chúng lĩnh vực y dược Những đóng góp luận án - Đây nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Eriobotrya poilanei Pinanga duperreana Việt Nam giới - Trong số chất phân lập từ lồi Eriobotrya có chất lần tìm thấy chi này, gồm có tritecpen: axit arjunic (125); metyl 2α,3β-dihydroxyolean-12-en-28-oat (132); metyl 2α,3β-dihydroxyurs-12-en28-oat (133); axit 2-O-axetyl-3β-O-(p-axetyl-trans-coumaroyl) alphatolic (134) axit 2α-O-axetyl-3β-O-(p-axetyl-cis-coumaroyl) alphatolic (135); flavolignan: catiguanin B (128) ancol béo: hexatetracontan-1-ol (129) - Dẫn xuất N-(3-axetoxyurs-12-en-28-oyl)-5-aminohexan-1-amin (145) 3-succinoylurs-12-en-28-amit (146) hai chất Bố cục luận án Luận án gồm 144 trang, có 75 hình, 13 bảng Bố cục luận án: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (34 trang); Chương 2: Thực nghiệm (26 trang); Chương 3: Kết thảo luận (59 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang) Phần Danh sách hợp chất phân lập từ nghiên cứu dẫn xuất chuyển hóa từ axit ursolic (9 trang); Danh mục cơng www.DaiHocThuDauMot.edu.vn trình khoa học cơng bố khn khổ luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (11 trang) với 103 tài liệu cập nhật đến năm 2011 Ngồi cịn có 35 trang phần Phụ lục với hình phổ II NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần Mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, mục tiêu nhiệm vụ nghiên cứu luận án Chương – TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần Tổng quan tài liệu tập hợp nghiên cứu nước quốc tế vấn đề: 1.1 Đặc điểm thực vật tình hình nghiên cứu chi Sơn trà (Eriobotrya), họ Hoa hồng (Rosaceae) 1.2 Đặc điểm thực vật tình hình nghiên cứu chi Cau chuột (Pinanga), họ Cau (Arecaceae) 1.3 Các hợp chất tritecpen thiên nhiên khung oleanan ursan 1.4 Chuyển hóa hóa học axit ursolic Chương – THỰC NGHIỆM Phần Thực nghiệm trình bày nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu, q trình chiết tách, đặc điểm hóa lý số liệu phổ chất phân lập từ E poilanei, E japonica, thân P duperreana chất chuyển hóa từ axit ursolic Nguyên liệu: Mẫu Eriobotrya poilanei thu hái rừng quốc gia Bì Dúp, Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng vào tháng năm 2009; mẫu E japonica thu hái Tam Đảo, thuộc tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng năm 2010; mẫu Pinanga duperreana thu hái Ba Vì, tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng năm 2009 Các mẫu thực vật TS Nguyễn Tiến Hiệp CN Ngô Văn Trại xác định tên khoa học Quy trình chiết: Mẫu thực vật làm sạch, sấy khô nhiệt độ www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 40 0C, xay nhỏ ngâm chiết hỗn hợp dung mơi metanol/nước (85/15) nhiệt độ phịng sau chiết phân bố với dung môi n-hexan, etyl axetat (diclometan), n-butanol Cất loại dung môi áp suất thấp thu cặn chiết tương ứng Phân lập chất: Tinh chế cặn chiết thu phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ khác như: silica gel, RP-18, sephadex LH20 hệ dung mơi thích hợp Xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc hợp chất xác định kết hợp phương pháp phổ đại phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều hai chiều (COSY, HSQC, HMBC…) Phương pháp thử hoạt tính sinh học: * Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định gồm chủng vi khuẩn gram (-): Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442, Escherichia coli (Ec) ATCC 25922, Salmonella enterica (Se); chủng vi khuẩn gram (+): Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709, Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633, Lactobacillus fermentum N4 chủng nấm Candida albicans (Ca) ATCC 10198 * Hoạt tính gây độc tế bào: dòng tế bào ung thư người cung cấp ATCC, gồm có: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu), ung thư vú (MCF7) Chương – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Các chất phân lập từ Eriobotrya poilanei J E Vid Từ E poilanei, 12 chất phân lập gồm tritecpen, flavonoid, phytosterol ancol béo Trong tinh chế cặn chiết etyl axetat, có nhiều phân đoạn chứa hỗn hợp chất có Rf sát nhau, khó khăn cho việc phân lập Do vậy, để tăng khả phân tách, phản ứng axetyl hóa phân đoạn tiến hành Vì vậy, số chất phân lập từ cặn chiết etyl axetat, có chất thu dạng sản phẩm axetyl www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 3.1.1 Các hợp chất tritecpen  Khung ursan Chất 93 120 121 123 124 Cấu tạo R1 = R2 = R4 = H R3 = OH R5 = COOH R1 = R2 = R4 = H R3 = OAc R5 = COOH R1 = R2 = R4 = H R3 = OH R5 = CHO R1 = R2 = H; R3 = OAc; R4 = OH R5 = COOH R1 = R3 = OAc; R2 = O; R4 = OH R5 = COOH R1 = R2 = R3 = OAc R4 = OH R5 = COOH  Axit ursolic (5): Chất phân lập dạng bột màu trắng Phổ FT-IR cho đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm hydroxyl 3448 nhóm cacboxyl 1691 cm-1 Phù hợp với số liệu phổ IR, phổ 1H 13C-NMR cho thấy phân tử chất có chứa nhóm axit (C = 178,23), tín hiệu nhóm hydroxymetin (H = 2,98 m, C = 76,85 d), nối đôi dạng >C=CH- [H = 5,11 (1H, t, J = 3,4), C = 138,17 s; 124,57 d] nhóm metyl, bao gồm nhóm metyl bậc ba thể qua tín hiệu singlet H = 0,66; 0,73; 0,85; 0,88; 1,02 nhóm bậc thể qua tín hiệu doublet H = 0,79 (3H, d, J = 6,4), 0,89 (3H, d, J = 8,7) Ngồi tín hiệu kể trên, phổ 13C-NMR, DEPT cịn cho thấy có mặt nhóm CH2, nhóm CH cacbon khơng gắn trực tiếp với hydro phân tử Với số liệu phổ phân tích đưa cơng thức phân tử chất C30H48O3 cấu trúc xác định axit ursolic nhờ so sánh với số liệu công bố  Andehid ursolic (120): Công thức phân tử chất 120 C30H48O2 rút từ pic ion phân tử m/z = 441,37346 [M+H]+ phổ HR-ESI-MS (theo tính tốn cho C30H49O2: 441,37326) Phổ IR cho đỉnh hấp thụ 3421 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn (OH), 1718 cm-1 (CHO) Phổ 1H- 13C-NMR tương tự chất có khác biệt nhóm axit chất thay nhóm andehid chất 120 Điều thể qua tín hiệu H = 9,32 (1H, s) C = 207,4 d Cấu trúc chất 120 xác định andehid ursolic nhờ kết hợp so sánh với số liệu phổ khối phổ 1D-NMR tài liệu  Axit 3β-O-axetyl pomolic (121): Chất 121 phân lập dạng chất rắn màu trắng Phổ HR-ESI-MS cho pic ion phân tử m/z = 515,37362 [M+H]+ (theo tính tốn cho C32H51O5: 515,37365) Phổ 1H 13C-NMR cho thấy có khung axit urs-12-en-28-oic, phân tử xuất thêm nhóm hydroxyl gắn với C-19, điều thể qua tín hiệu cacbon bậc C = 73,09 tín hiệu singlet H-18 (H = 2,53) Các số liệu phổ cho thấy phân tử chứa nhóm axetyl [H = 2,05 (s, 3H); C = 21,30 q; 171,03 s] suy phản ứng axetyl hóa thực với nhóm hydroxyl bậc vị trị C-3 Số liệu phổ 121 hoàn toàn phù hợp với liệu phổ axit 3β-O-axetyl pomolic tài liệu Bảng 3.1 - Số liệu 13C-NMR (125 MHz) chất 5, 120, 121 chất tham khảo Chất Axit ursolic (DMSOd6 ) Chất 120 (CDCl3) Andehid ursolic (CDCl3) Axit 3-OChất 121 (CDCl3) axetyl C (DMSOd6 ) 38,24 t 38,22 t 38,78 t 38,7 t 38,07 t 26,96 t 26,79 t 27,26 t 27,3 t 23,52 t 23,6 t 76,85 d 76,82 d 79,04 d 79,0 d 80,96 d 80,9 d pomolic (CDCl3) 38,1 t 38,36 s 38,35 s 39,87 s 38,8 s 37,54 s 37,7 s 54,79 d 54,77 d 55,27 d 55,2 d 55,21 d 55,2 d 17,99 t 17,97 t 18,31 t 18,4 t 18,28 t 18,2 t 30,18 t 30,77 t 33,15 t 32,0 t 32,57 t 32,6 t 39,09 s 39,09 s 42,01 s 39,9 s 39,97 s 39,9 s 47,02 d 47,00 d 47,62 d 47,6 d 47,97 d 47,1 d 10 36,51 s 36,51 s 36,98 s 37,0 s 36,94 s 36,9 s 11 23,80 t 23,80 t 23,34 t 23,3 t 23,65 t 23,5 t 12 124,57 d 124,54 d 126,24 d 126,1 d 129,30 d 129,3 d 13 138,17 s 138,18 s 137,84 s 137,7 s 137,93 s 137,9 s www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 14 41,63 s 41,62 s 42,01 s 42,2 s 41,04 s 41,0 s 15 32,70 t 32,69 t 29,70 t 28,2 t 28,19 t 28,2 t 16 22,83 t 22,82 t 26,92 t 23,4 t 25,31 t 25,3 t 17 46,82 s 46,81 s 50,16 s 50,2 s 47,76 s 47,8 s 18 52,38 d 52,37 d 52,68 d 52,6 d 52,79 d 52,8 d 19 38,49 d 38,42 d 39,02 d 39,0 d 73,09 s 73,1 s 20 38,44 d 38,48 d 38,86 d 38,9 d 41,08 d 41,0 d 21 27,53 t 27,52 t 30,21 t 30,2 t 25,98 t 25,9 t 22 36,30 t 36,29 t 31,91 t 33,2 t 37,68 t 37,1 t 23 28,24 q 28,23 q 28,17 q 29,8 q 27,43 q 27,4 q 24 16,90 q 16,90 q 15,63 q 15,7 q 16,67 q 16,6 q 25 16,03 q 16,03 q 15,53 q 15,6 q 15,32 q 15,3 q 26 15,19 q 15,18 q 17,25 q 17,3 q 17,04 q 16,9 q 27 23,25 q 23,24 q 23,25 q 23,3 q 24,48 q 24,4 q 28 178,23 s 178,23 s 207,40 d 207,3 d 184,45 s 183,6 s 29 16,97 q 16,97 q 16,67 q 16,7 q 28,03 q 28,0 q 30 21,04 q 21,10 q 21,07 q 21,2 q 16,15 q 16,1 q OCOCH3 - - - - 171,03 s -  Axit 2-oxo-1,3-O-diaxetyl-19-hydroxyurs-12-en-28-oic (123): Công thức phân tử chất 123 xác định C34H50O8 từ pic ion phân tử m/z = 587,35841 [M+H]+ (theo tính toán cho C34H51O8 587,35839) phổ HR-ESI-MS Phổ 1H, 13C-NMR, DEPT cho thấy phân tử 123 tritecpen axit khung urs-12-en Sự khác rõ rệt chất 123 so với chất nêu xuất nhóm xeton C=O (C = 198,39) nhóm axetyl (H = 2,15 s, 6H; C = 20,47; 20,99 169,77; 169,90) phân tử Ngoài ra, tương tự chất 121, tín hiệu cacbon bậc cộng hưởng 73,04 ppm, chứng tỏ có nhóm hydroxyl gắn C-19 Hai proton hai nhóm axetoxy metin xuất dạng tín hiệu singlet H = 4,37 4,33 (mỗi tín hiệu 1H) cho phép dự đốn hai nhóm axetyl gắn vào C-1 C-3, nhóm xeton C-2 Các dự đốn khẳng định so sánh số liệu phổ chất 123 với số liệu công bố axit 2-oxo-1,3-O-diaxetyl-19hydroxyurs-12-en-28-oic tài liệu  Axit 1,2,3-O-triaxetyl-19-hydroxyurs-12-en-28-oic (124): Chất 124 tách dạng chất bột màu trắng, cho pic ion phân tử m/z = www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 631 [M+H]+ phổ ESI-MS Phổ 1H 13C-NMR gần giống chất 123, khác nhóm C-2 Nhóm xeton chất 123 thay nhóm axetyl chất 124 Điều thể qua tín hiệu nhóm xeton xuất thêm tín hiệu nhóm axetoxy metin nhóm axetyl Tín hiệu triplet H = 5,45 (J = 3,7 Hz) gán cho H-2; hai tín hiệu doublet H 4,77 4,70 (J = 3,7 Hz) H-1 H-3, tương ứng Bên cạnh đó, phổ COSY cho thấy tương tác H-2 với H-1 H-3 cấu hình nhóm O-axetyl C-1, C-2 C-3 xác định thông qua số tương tác 3,7 Hz proton H-1, H-2 H-3 thể mối tương quan axial-equatorial-axial chúng Từ số liệu phổ phân tích trên, với phổ HSQC, HMBC kết hợp với tài liệu, xác định chất 124 axit 1,2,3-O-triaxetyl-19-hydroxy urs-12-en-28oic Bảng 3.2- Số liệu 1H- (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) chất 123, 124 chất tham khảo (CDCl3) Axit 2-oxo1,3-Odiaxetyl-19hydroxy urs12-en-28-oic Chất 123 C Chất 124 Metyl 1,2,3-Otriaxetyl-19hydroxy urs12-en-28-oat δC δH, J (Hz) δH, J (Hz) δC δH, J (Hz) δH, J (Hz) 85,44 d 5,08 (s) 5,08 ( s) 70,05 d 4,77(d, 3,7) 4,75 (d, 3,7) 198,39 s - - 75,07 d 5,45 (t, 3,7) 5,44 (t, 3,7) 81,98 d 5,04 (s) 5,04 (s) 78,24 d 4,70(d, 3,7) 4,70 (d, 3,7) 43,05 s - - 40,50 s 52,47 d 52,53 d 17,83 t 25,16 t 32,19 t 32,28 t - 40,73 s 41,94 s - 47,69 d 48,24 d - 10 47,79 s 37,59 s - www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 11 25,92 t 25,92 t 12 128,90 d 13 137,60 s 137,73 s 14 40,73 s 41,05 s 15 28,32 t 28,27 t 5,28(t, 3,7) 5,30 (t, 3,0) 129,19 d 16 25,13 t 25,92 t 17 46,79 s 47,63 s 18 52,64 d 19 73,04 s 73,04 s 20 41,09 d 41,05 d 21 25,92 t 28,27 t 22 37,45 t 23 28,63 q 1,10 (s) 1,10 (s) 24 17,15 q 0,72 (s) 25 12,77 q 0,79 (s) 26 16,84 q 27 28 29 30 2,52 (s) 5,26 (t, 3,7) 5,26 (t,3,6) - 2,50 (s) 2,55 (br s) 27,49 q 1,19 (s) 1,18 (s) 0,73 (s) 17,55 q 1,07 (s) 1,07 (s) 0,80 (s) 12,03 q 1,34 (s) 1,30 (s) 0,99 (s) 0,99 (s) 17,55 q 0,73 (s) 0,69 (s) 24,19 q 1,28 (s) 1,29 (s) 24,36 q 1,22 (s) 1,21 (s) 184,20 s - - 184,12 s - - 27,44 q 1,20 (s) 1,21 (s) 29,10 q 0,90 (s) 0,90 (s) 16,07 q 0,95 (d, 6,6) 0,95 (d, 6,5) 16,12 q 0,94 (d,6,6) 0,93 (d, 6,4) 2,15 (s) 2,16 (s) 170,05 s – 20,71 q 2,00 (s) 1,99 ( s) 169,77 s – AcO-C1 20,47 q 2,52 (s) - 52,53 d 37,59 t AcO-C2 - - - 170,05 s – 21,37 q 2,08 (s) 2,08 (s) AcO-C3 169,90 s – 20,99 q 2,15 (s) 2,16 (s) 170,05 s – 20,89 q 2,02 (s) 2,02 (s)  Khung oleanan Chất R 125 R1= R2= R3= OH 126 R1= R2= OAc R3= OH 127 R1= R2= OAc R3= H  Axit arjunic (125): Phổ HR-ESI-MS chất 125 có pic ion phân tử www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 10 m/z 511,33940 [M+Na]+ (theo tính tốn cho C30H48O5Na: 511,33994), tương ứng với công thức phân tử C30H48O5 Số liệu phổ khối, kết hợp với phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho phép dự đoán chất 125 tritecpen axit khung oleanan Các tín hiệu singlet nhóm metyl bậc H = 0,79; 0,84; 0,96; 0,99; 1,02; 1,04; 1,31 (mỗi tín hiệu 3H, s) củng cố cho giả thiết Ngoài phổ 1H- 13C-NMR cịn cho thấy có mặt nối đơi dạng >C=CH- [H = 5,30 (1H, t, J = 3,4, H-12)]; C = 124,73 (C-12), 144,70 (C-13)]; nhóm –COOH C = 182,65 nhóm oxymetin H = 3,63 (m); 3,28 (d, J = 3,7); 2,94 (d, J = 9,6) C = 69,53; 82,48; 84,55 Bên cạnh tín hiệu kể trên, phổ 13C-NMR, DEPT cịn cho thấy có mặt nhóm CH2, nhóm CH cacbon khơng gắn trực tiếp với hydro phân tử Hình 3.1 – Phổ 13C-NMR DEPT (125 MHz) chất 125 Để xác định ví trí nối kết nhóm hydroxyl phân tử, liệu phổ 2D-NMR phân tích Phổ 1H-1H-COSY cho thấy tương tác H-2/H-3, H-1/H-2, H-18/H-19 H-11/H-12 Mặc dù tín hiệu nhóm cacboxyl khơng quan sát rõ phổ 1D-NMR, phổ HMBC cho thấy tương tác H-18 với 28-COOH Hơn nữa, phổ HMBC cho thấy tương tác H-1 với C-2, C-3; H-3 với C-2, C-4, C23, C-24 Điều khẳng định gán ghép tín hiệu phổ hoàn toàn phù hợp Ngoài ra, số tương tác H-2 H-3 lớn (J = 9,6 Hz), chứng tỏ nhóm hydroxyl C-2 C-3 không nằm mặt phẳng phân tử Với số liệu nêu tương tác phổ 2D- www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 11 NMR (HSQC, HMBC, COSY), kết hợp so sánh với số liệu công bố, cấu trúc chất 125 xác định axit 2α,3β,19α-trihydroxyolean-12-en28-oic hay axit arjunic Đây lần axit arjunic tìm thấy chi Eriobotrya  Axit 2α,3β-O-diaxetylolean-12-en-28-oic (127): So sánh phổ chất 127 với chất 126 ta thấy độ dịch chuyển hóa học dạng vạch tín hiệu gần nhau, nhiên phân tử 127 có nhóm hydroxyl so với chất 126 Điều thể tín hiệu nhóm oxymetin phổ 1H- 13C-NMR 127 Tín hiệu doublet nhóm oxymetin C-19 vùng trường thấp ( δC 80,57) chất 126 bị thay tín hiệu triplet (δC 46,2) phía vùng trường cao Như phân tử 127 khơng có nhóm hydroxyl C-19 Mặc dù phổ 13CNMR chất 127 khơng cho tín hiệu nhóm cacboxyl, nhiên độ dịch chuyển cacbon khơng gắn trực tiếp với hydro C-17 phía vùng trường thấp (C = 46,51) pic ion phân tử m/z 557,38424 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C34H52O6 phổ khối phân giải cao chứng tỏ phân tử chất 127 có nhóm COOH C-17 Cấu hình hai nhóm axetyl xác định 2,3dựa vào giá trị số tương tác lớn H-2 với H-1 (J2a-1a = 11,0 Hz) H-3 với H-2 (J2a-3a = 10,5 Hz) giá trị số tương tác nhỏ (J2a-1e = 4,3 Hz), kết hợp so sánh với chất tương tự tài liệu Như vậy, cấu trúc chất 127 xác định axit 2α,3β-Odiaxetylolean-12-en-28-oic qua số liệu phổ phân tích so sánh với tài liệu cơng bố 3.1.2 Các hợp chất flavonoid Chất 22:(-)-Epicatechin Chất 128:Catiguanin B www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 12  Catiguanin B (128): Chất 128 thu dạng chất rắn, màu cam Phổ IR chất 128 cho đỉnh hấp thụ 3413 (OH), 1728 cm-1 (C=O) Công thức phân tử C25H22O10 rút từ pic ion phân tử m/z = 483,12909 [M+H]+ (theo tính tốn cho C25H23O10 483,12912) phổ HR-ESI-MS Phổ 1H-, 13C-NMR DEPT cho thấy chất 128 có chứa đơn vị epicatechin thể qua tín hiệu vịng C, gồm có nhóm metin gắn với oxy H = 4,92 (1H, br s, H-2); 4,25 (1H, m, H-3) C = 80,07 (C-2); 66,83 (C-3); tín hiệu nhóm metylen CH2-4 H = 2,82; 2,92 C = 29,49 Bên cạnh đó, proton thơm tương tác kiểu ABX vòng B tìm thấy phổ 1H-NMR, gồm có doublet H = 6,79 7,00 với số tương tác 8,2 1,5 Hz; doublet kép H = 6,86 (J = 1,5 & 8,2 Hz) Các tương tác H-2 với C-1' (132,08 ppm), C-2' (115,18 ppm) C-6' (119,20 ppm) phổ HMBC khẳng định có mặt đơn vị epicatechin phân tử 128 Ngồi ra, phổ NMR cịn cho thấy tín hiệu nhóm metin [H = 4,48 (1H, dd, J = 3,0 & 9,0 Hz) C = 31,15], nhóm metylen [H = 2,98 (1H, dd, J = 3,0 & 14,8 Hz); 2,50 (1H, dd, J = 9,0 & 14,8 Hz) C = 44,78], vịng benzen bị lần có nhóm hydroxyl thể qua tín hiệu singlet proton thơm H = 6,47 6,62 Bên cạnh cacbon thơm có cacbon dịch chuyển vùng trường thấp C = 142,10 146,41 nhóm –COOMe [H = 3,60 s, C = 174,65 s; 52,03 q] quan sát thấy phổ NMR Phổ HMBC tương tác H-9 với C-7, C-8, C-1", C-2" C=O chứng tỏ C-9 liên kết với C-8 vòng A C-1" vòng thơm bị lần Ngoài ra, tương tác H-10 với C-9, C-1” C=O khẳng định nối kết C-10 với C-9 –COOMe Tương tác hai proton nhóm CH2-10 2,98 ppm với H-2’, H-6’ H-6’’ phổ ROESY chứng minh hóa lập thể chất 128 hình vẽ Cuối cấu trúc chất 128 xác định catiguanin B so sánh với số liệu phổ tài liệu.Theo tra cứu tài liệu chúng tôi, lần catiguanin B tìm thấy chi Eriobotrya www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 13 Hình 3.2 – Phổ ROESY (75 MHz) chất 128 3.1.3 Các hợp chất phytosterol ancol béo  Hexatetracontan-1-ol (129): Phổ FT-IR chất 129 cho đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm hydroxyl 3423 C-O 1023 cm-1 Phổ HR-ESI-MS cho biết pic ion phân tử m/z 663,73831 [M+H]+ (theo tính tốn cho C46H95O 663,73829) tương ứng với công thức C46H94O Sự phân mảnh phổ khối thể đặc điểm đặc trưng cho hydrocacbon no qua ion phân mảnh ln nhóm CH2 số nhóm CH2 tương ứng với 14 đơn vị khối lượng bội số 14 Ví dụ: m/z = 606 [M-C4H8]+ (M-56 ); 578 [M-C6H12]+ (M-84); 522 [M-C10H20]+ (M-140), Sự có mặt nhóm hydroxyl phân tử thể rõ qua ion phân mảnh m/z 646 [M-OH+H]+ (M-16) Phổ 1H- 13C-NMR khẳng định chất 129 ancol béo mạch dài, thể qua pic nhiều nhóm CH2 cộng hưởng chồng chập δH = 1,26; δC = 29,63; nhóm metyl mạch hydrocacbon no δH = 0,89 (t, 3H), δC = 14,12; nhóm CH2OH δH = 3,65 (t, 2H), δC = 63,13; nhóm metylen bên cạnh nhóm CH2OH δH = 1,56 (4H), C = 32,85; 31,94 Dựa vào tín hiệu phổ phân tích kết hợp so sánh với số liệu tài liệu, cấu trúc chất 129 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 14 xác định hexatetracontan-1-ol Đây lần chất tìm thấy chi Eriobotrya  β-Sitosterol (130) β-Sitosterol glucosid (131) Chất 130: β-Sitosterol Chất 131: β-Sitosterol glucosid 3.2 Các chất phân lập từ Eriobotrya japonica Lindl Từ E japonica, tritecpen thuộc khung oleanan, ursan lupan, dạng nguyên gốc dạng sản phẩm axetyl hóa phân lập Trong có chất giống với chất tìm thấy E poilanei, chất (axit ursolic), 93 (axit 3β-O-axetyl ursolic) 121 (axit 3β-O-axetyl pomolic)  EJ1 hỗn hợp đồng phân cấu tạo: Metyl 2α,3β-dihydroxyolean12-en-28-oat (132) Metyl 2α,3β-dihydroxyurs-12-en-28-oat (133): Số liệu phổ 1D-NMR cho cặp tín hiệu giống độ dịch chuyển hóa học dạng vạch Dựa vào tỉ lệ đường tích phân phổ 1H-NMR thấy chất EJ1 hỗn hợp hai đồng phân với tỉ lệ khoảng : (132 : 133) Cấu trúc hỗn hợp đồng phân cấu tạo xác định dựa vào phổ IR, ESI-MS 1D-NMR Chất 132: Metyl 2α,3β- Chất 133: Metyl 2α,3βdihydroxy-olean-12-en-28-oat dihydroxy-urs-12-en-28-oat  EJ2-Ac hỗn hợp đồng phân hình học: Chất 134 135 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 15 Cơng thức phân tử chất EJ2-Ac C43H58O8 rút từ pic ion phân tử m/z = 701 [M-H]- phổ ESI-MS số liệu phổ NMR Các tín hiệu phổ NMR chất EJ2-Ac xuất chủ yếu dạng cặp có độ dịch chuyển hóa học dạng vạch tương tự với tỉ lệ 1: 0,9 (134 : 135) cho phép dự đoán hỗn hợp hai đồng phân Phần giống đồng phân khung lupan axit với tín hiệu cacboxyl δC = 182,23 (2xC); nhóm isopropenyl [δH = 4,73; 4,60 (mỗi tín hiệu br s, 2H); 1,69; 1,685 (mỗi tín hiệu s, 3H); δC = 109,79 (2xCH2); 152,09 (C); 151,05 (C) 19,27 (2xCH3)] nhóm metyl singlet cộng hưởng vùng từ 0,78 - 1,00 ppm Độ dịch chuyển hóa học, dạng vạch số tương tác proton oxymetin δH = 4,79; 4,86 (mỗi tín hiệu d, J = 10,3 Hz, H-3) 5,08; 5,20 (mỗi tín hiệu dt, J = 10,3 & 4,5 Hz, H-2) phổ 1H-NMR đặc trưng cho cấu hình 2 nhóm chứa oxy so sánh với tài liệu Hình 3.3–Phổ 1H-NMR (125 MHz) chất EJ2-Ac www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 16 Sự có mặt cặp nhóm axetyl phân tử quan sát thấy phổ NMR Các tín hiệu cặp thứ là: δH = 2,31; 2,30 (mỗi tín hiệu s, 3H); δC = 170,68; 170,59 (C=O); 21,08; 20,96 (CH3) Cặp nhóm axetyl thứ hai 1,91 ppm (s, 6H, CH3CO) 166,68; 165,61 ppm (CH3CO); 21,08 ppm (CH3CO) Ngồi ra, tín hiệu proton thơm đối xứng cặp δH = 7,66; 7,07 (mỗi tín hiệu d; J = 8,6 Hz; 2H) 7,55; 7,12 (mỗi tín hiệu d; J = 8,8 Hz; 2H) với tín hiệu cacbonyl este δC = 169,13 (2xC) chứng tỏ phân tử có chứa nhóm p-coumaroyl Với số liệu phổ phân tích giả thiết chất EJ2-Ac axit 2α-axetyl-3β-O-(p-axetyl-coumaroyl) alphitolic Sự khác hai đồng phân cấu hình coumaroyl Đồng phân 134 có nhóm trans-coumaroyl 135 có nhóm cis-coumaroyl thể qua số tương tác H-2' H-3' 16,0 12,7 Hz, tương ứng Các số liệu phổ chất 134 135 gần đồng với số liệu axit 2-O-axetyl-3β-O-(p-transcoumaroyl) alphatolic axit 2α-O-axetyl-3β-O-(p-cis-coumaroyl) alphatolic, tương ứng tài liệu khác độ dịch chuyển hóa học C-7' phía trường cao với  ~ ppm xuất thêm nhóm axetyl Từ số liệu phân tích trên, chúng tơi xác định chất 134 135 axit 2-O-axetyl-3βO-(p-axetyl-trans-coumaroyl) alphatolic axit 2α-O-axetyl-3β-O-(p-axetylcis-coumaroyl) alphatolic 3.3 Cây Cau chuột núi (Pinanga duperreana Pierre ex Becc.) 3.3.1 Hàm lượng lipit tổng thành phần axit béo mẫu hạt Hình 3.4 – Sơ đồ phân tích hàm lượng lipit tổng hạt P duperreana  Kết cho thấy hàm lượng lipit tổng mẫu hạt Cau chuột núi tương đối nhỏ (2,35% so với mẫu khơ) Hình 3.5 – Sơ đồ phân tích thành phần axit béo dầu hạt P duperreana www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 17  Kết phân tích thành phần dầu béo cho thấy axit béo sau có hàm lượng cao: axit octadecenoic (40,89%); axit tetradecanoic (19,48%) axit dodecanoic (15,42%) 3.3.2 Các chất phân lập từ thân Cau chuột núi Từ P duperreana, hợp chất thuộc lớp chất khác phân lập, gồm polyphenol, flavonoid phytosterol Trong chất 22 (epicatechin) 130 (-sitosterol) hai chất giống với chất phân lập từ E poilanei Hai chất khơng trùng lặp cịn lại (E)-3,5,3',4'-tetrahydroxystilben (136) stigmasterol (137)  (E)-3,5,3’,4’-tetrahydroxystilben (136): Chất 136 thu dạng chất rắn, màu nâu Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 243 [M-H]-, kết hợp với số liệu phổ 1D-NMR cho phép dự đoán chất 136 có cơng thức phân tử C14H12O4 Phổ 1D-NMR cho biết phân tử 136 chứa khung stilben vịng benzen có gắn nhóm hydroxyl [δH 8,13 (4H, br s, -OH)] Hai vòng benzen gắn kết với qua nhóm etylen với cấu hình trans thể tín hiệu [δH 6,94 (1H, d, 16,3 Hz), 6,81 (1H, d, 16,3 Hz) δC 129,72d, 127,05d] Vòng benzen thứ bị lần vị trí 1, 3, dựa vào độ bội tín hiệu [δH 6,52 (2H, d, 2,0 Hz), 6,26 (1H, t, 2,0 Hz) δC 159,61s ×2, 141,32s, 105,82d ×2], C-1 gắn với nhóm etylen, C-3 C-5 gắn với hai nhóm hydroxyl Vịng benzen thứ hai bị lần, C-1’ gắn với nhóm etylen hai vị trí cịn lại gắn với hai nhóm hydroxyl [δH 7,07 (1H, d, 2,0 Hz), 6,90 (1H, dd, 8,0, 2,0 Hz), 6,80 (1H, d, 8,0 Hz) δC 146,50s, 146,48s, 131,12s, 120,19d, 116,47d, 113,90d] Dạng vạch proton kết hợp với tài liệu phổ mơ cho phép xác định vịng benzen thứ hai chứa nhóm hydroxyl vị trí C-3’ C-4’ Từ số liệu phân tích trên, cấu trúc chất 136 xác định (E)-3,5,3’,4’-tetrahydroxystilben Bảng 3.3- Số liệu phổ 1H- (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) chất 136 chất tham khảo www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 18 C (E)-3,5,3’-trihydroxy-4’metoxystilben (CD3COCD3) Chất 136 (E)-3,5,3’,4’tetrahydroxy stilben (mô phỏng) δH(CD3COCD3) 6,52 (d, 2,0) - δC(CD3OD) 141,31s 105,82d 159,61s δH [J(Hz)] 6,61 (d, 1,8) - δC 140,8s 105,8d 159,4s δH 6,38 - δC 141,3 104,7 159,8 6,26 (t, 2,0) 102,69d 6,35 (br t, 1,8) 102,8d 6,212 102,8 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6,52 (d, 2,0) 6,81 (d, 16,3) 6,94 (d, 16,3) 7,07 (d, 2,0) 6,80 (d, 8,0) 6,90 (dd, 8,0, 2,0) 8,13 (s) 159,61s 105,82d 129,72d 127,05d 131,12s 113,90d 146,50s 146,48s 116,47d 6,61 (d, 1,8) 6,94 (d, 16,2) 7,04 (d, 16,2) 7,20 (d, 1,8) 6,85 (d, 8,3) 7,02 (dd, 8,3, 1,8) - 159,4s 105,8d 129,4d 127,0d 130,4s 110,1d 148,5s 147,4s 116,5d 6,38 6,95 6,95 7,29 6,98 159,8 104,7 127,4 127,4 130,9 115,2 145,9 146,5 117,2 121,1d 7,24 123,2 - 5,35 - 6’ OH 120,19d - 3.4 Các dẫn xuất từ chuyển hóa axit ursolic Tám dẫn xuất axit ursolic tổng hợp Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn xuất chuyển hóa nhóm C-3-OH, dẫn xuất chuyển hóa nhóm 28COOH dẫn xuất chuyển hóa hai nhóm với phần biện luận phổ để chứng minh cấu trúc dẫn xuất mới: 145 146 trình bày 3.4.1 Các dẫn xuất từ chuyển hóa nhóm 3-OH Hình 3.6- Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất 138, 139 140 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 19 3.4.2 Các dẫn xuất từ chuyển hóa nhóm 17-COOH Hình 3.7- Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất 142 Hình 3.8 – Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất 143 144 Hình 3.9 – Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất amit 145  N-(3-axetoxyurs-12-en-28-oyl)-5-aminohexan-1-amin (145) Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 595 [M-H]- tương ứng với CTPT chất 145 C38H64O3N2 So sánh phổ 1D-NMR chất 145 với 93 cho thấy phân tử 145 có thêm tín hiệu cầu nối amit CO-NH [δH = 6,00 (1H, br s, NH) δC = 178,5s (C=O)] số tín hiệu cho thấy phản ứng amit hóa xảy nhóm amino liên kết với nguyên tử cacbon bậc tác nhân hexan-1,5-diamin [δH = 3,31, 2,99 (2H, tín hiệu m, H-1’); 2,73, 2,62, (2H, tín hiệu m, H-2’) δC = 39,71t (C- www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 20 1’), 47,48t (C-2’)] Từ số liệu phân tích nêu, chúng tơi kết luận chất 145 N-(3-axetoxyurs-12-en-28-oyl)-5-aminohexan-1-amin 3.4.3 Các dẫn xuất từ chuyển hóa hai nhóm 3-OH 17-COOH Hình 3.10–Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất 146  3-succinoylurs-12-en-28-amit (146) Khi thực phản ứng este hóa chất 144 với axit succinic thu chất 146 Phổ IR chất cho thấy tín hiệu 3459 (N-H), 1735 (C=O este), 1713 (C=O axit) 1641 (C=O amit) Phổ 1D-NMR cho thấy phân tử 146 có chứa nhóm –CONH2 [H 6,78, 5,93 (mỗi tín hiệu 1H, br s, NH2) C 182,81s (C=O)] nhóm succinoyl [H 2,64 (4H, br s, 2H-2’ 2H-3’); C 176,32 171,84 (mỗi tín hiệu s, C=O)] Thêm vào đó, H-3 chất 146 có giá trị H cao 1,3 ppm so với H-3 chất 144 Điều chứng tỏ nhóm succinoyl gắn vào vị trí C-3 Pic ion phân tử m/z = 554 [M-H]- phổ ESI-MS tương ứng với công thức phân tử C34H53O5N khẳng định thêm cấu trúc 146 3-succinoylurs-12-en-28-amit 3.5 Kết thử hoạt tính sinh học 3.5.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy cặn chiết E poilanei hoạt tính kháng chủng vi sinh vật đem thử; dẫn xuất 145 146 có hoạt tính với chủng Bacillus subtillis mức độ trung bình, chất 145 có hoạt tính mạnh chất 146 nồng độ µM 10 µM www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 21 3.5.2 Hoạt tính gây độc tế bào Các dòng tế bào ung thư người dùng để thử hoạt tính bao gồm ung thư biểu mơ (KB); ung thư gan (HepG2); ung thư vú (MCF7) ung thư phổi (Lu) Bảng 3.4- Kết thử hoạt tính độc tế bào cặn chiết, chất phân lập từ E poilanei dẫn xuất axit ursolic STT T n mẫu Giá tr IC50 tr n dòng tế bào (g/ml) KB HepG2 MCF Lu Các cặn chiết E poilanei EPoH 73,84 111,46 84,30 74,53 EPoE 58,62 79,71 54,00 30,05 EPoB 116,88 >128 94,49 119,77 Các chất phân lập từ E poilanei 128 >100 >100 >100 >100 93 8,0 4,73 27,50 34,79 10,23 11,75 8,0 12,23 Các chất chuyển hóa từ axit ursolic (5) 138 5,31 4,36 25,36 19,79 140 4,32 4,31 3,43 5,44 142 11,60 17,90 14,44 17,56 10 143 >128 >128 >128 >128 11 144 62,92 53,46 43,44 71,23 12 145 4,90 5,03 4,78 4,96 13 146 26,0 9,14 44,58 33,57 14 10,23 11,75 8,0 12,23 Chất tham khảo Ellipticin 0,51 0,79 0,72 0,68 www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 22 Kết thử hoạt tính độc tế bào cho thấy cặn chiết n-hexan (EPoH), etyl axetat (EPoE) n-butanol (EPoB) có hoạt tính với dịng tế bào ung thư thử nghiệm, trừ cặn EPoB hoạt tính với dịng tế bào ung thư gan HepG2 Axit ursolic (5) số dẫn xuất có hoạt tính với dịng tế bào đem thử Trong đó, chất 140 dẫn xuất 145 có hoạt tính mạnh chất ban đầu (5) tất dòng tế bào thử nghiệm 3.5.3 Hoạt tính chống oxy hóa cặn chiết E poilanei Bảng 3.5 - Kết thử hoạt tính chống oxy hóa cặn chiết E poilanei Cặn chiết IC50 (g/ml) EPoH >128 EPoE 92,63 EPoB 65,97 Resveratrol 5,24 Cặn chiết etyl axetat n-butanol E poilanei có hoạt tính chống oxy hóa không mạnh www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 23 III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đây lần thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Sơn trà poilane (E Poilanei) công bố Việt Nam giới Từ Sơn trà poilane (E poilanei J E Vid.) 12 hợp chất phân lập xác định cấu trúc, bao gồm: - tritecpen, chất thuộc khung ursan: 5, 120, 121, 123, 124 chất khung oleanan: 125, 127, chất 121, 123, 124 127 phân lập dạng sản phẩm axetyl; - flavonoid (chất 22 128 - flavolignan gặp tự nhiên); - phytosterol (130 131) ancol béo (129) Các chất 125, 128 129 tìm thấy lần chi Eriobotrya Từ Sơn trà nhật (E japonica Lindl.) hợp chất tritecpen khung ursan, oleanan, lupan phân lập, bao gồm: chất 132, 133, 5, 93, 121, 134 135 Đây lần chất 132, 133, 134, 135 tìm thấy chi Eriobotrya Lần Cau chuột núi (Pinanga duperreana Pierre ex Becc.) nghiên cứu Việt Nam giới - Đã xác định hàm lượng lipit tổng hạt (2,35% so với mẫu khô) thành phần axit béo dầu hạt Cau chuột núi phương pháp GC/MS - Từ thân phân lập xác định cấu trúc hợp chất, là: (E)-3,5,3’,4’-tetrahydroxystilben (136); (-)-epicatechin (22); βsitosterol (130) stigmasterol (137) Từ axit ursolic, phân lập từ E poilanei với hàm lượng cao (0,065%), tổng hợp dẫn xuất thơng qua phản ứng chuyển hóa tại: www.DaiHocThuDauMot.edu.vn 24 - Nhóm 3-OH tạo dẫn xuất oxo (138), dẫn xuất oxim (139, 140) - Nhóm 17-COOH tạo dẫn xuất este (146), dẫn xuất amit (142, 143, 144, 145) Trong dẫn xuất 145 146 hai chất Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết, hợp chất tách dẫn xuất tổng hợp cho thấy: - Cặn chiết n-hexan etyl axetat từ E poilanei có hoạt tính độc với dòng tế bào ung thư thử nghiệm ( HepG2, KB, Lu MCF7) mức trung bình - Axit ursolic (5) số dẫn xuất có hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư thử nghiệm, dẫn xuất 140, 145 có hoạt tính tương đối tốt với dịng t bo (IC50< 5,5 àM) KIN NGH ã Nghiờn cu thêm số hoạt tính khác dẫn xuất 145, 146 phản ứng chuyển hóa từ chất • Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học thành phần hóa học cặn chiết diclometan Cau chuột núi (P duperreana)  ... Kết thử hoạt tính sinh học 3.5.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy cặn chiết E poilanei khơng thể hoạt tính kháng chủng vi sinh vật... án tạo tiền đề cho nghiên cứu chi Sơn trà chi Cau chuột nhằm khai thác ứng dụng có hiệu hoạt tính q báu chúng lĩnh vực y dược Những đóng góp luận án - Đây nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính. .. tính khác dẫn xuất 145, 146 phản ứng chuyển hóa từ chất • Tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học thành phần hóa học cặn chiết diclometan Cau chuột núi (P duperreana)