Đang tải... (xem toàn văn)
Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm và có vai trò quan trọng trong nghiên cứu khoa học và thực tiễn. Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần cho phép mở rộng nguồn gen của các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ. Vậy Tế bào trần là gì? Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần như thế nào?
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tiểu luận chủ đề : KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh A, ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào trần sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực thí nghiệm có vai trò quan trọng nghiên cứu khoa học thực tiễn Kỹ thuật nuôi cấy dung hợp tế bào trần cho phép mở rộng nguồn gen loài thực vật, tạo dòng tế bào sản xuất mang đặc tính di truyền ưu việt bố mẹ Vậy Tế bào trần gì? Kỹ thuật nuôi cấy dung hợp tế bào trần nào? Chúng ta tìm hiểu? I, Khái niệm protoplast II So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào NỘI DUNG thành III, Các kỹ thuật cụ thể IV, Các ứng dụng V, Quy trình minh họa I KHÁI NIỆM PROTOPLAST, THẾ NÀO LÀ LAI TẾ BÀO SOMA? Tế bào trần (protoplast) tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào, màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất nhân tế bào Protoplast • • Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với hợp thành tế bào hợp tế bào trần dung Nếu tế bào trần có nguồn gốc từ tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc giống, loài, chi khác dung hợp với tượng dung hợp tế bào soma (lai soma) Tế bào giống, loài A Tế bào lai soma Tế bào giống, loài B Tế bào trần tạo bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào tế bào mô sẹo từ mô tươi nguyên trạng Đặc điểm: Để môi trường dinh dưỡng sau 5- 10 ngày tạo vách tế bào phân chia y Hu ền ù ph TB Mô sẹ o Tại phải nuôi cấy tế bào trần Sự tiếp cận đến MSC nghiên cứu thao tác thuộc tính màng tế bào, điều mà thực bị bao phủ vách tế bào Do tính sẵn sàng sử dụng tế bào trần cho phương pháp phá vỡ tế bào để nhanh chóng thâu nhận bào quan đại phân tử mà không gặp phải biến dạng hư hỏng phương pháp ly trích thông thường Do tế bào cách ly với tế bào khác quần thể tế bào trần hệ thống đơn bào nên thao tác tương tự quần thể vi sinh vật II SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN VỚI NUÔI CẤY TẾ BÀO VẪN CÒN THÀNH Ưu Tế bào màng cứng, trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu đơn vị thể tích môi trường cao Tế bào trần có khả tái sinh mạnh Cho phép khả biến nạp gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước thường bị vỏ tế bào ngăn cản Cho phép khả dung hợp tế bào-gắn hai tế bào trần lại thành tế bào với hai thông tin di truyền hai tế bào Tế bào lai thu đực từ dung hợp hai tế bào trần, tái sinh phát triển thành lai Tồn Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện Chưa có phương pháp hiệu để tuyển chọn sản phẩm phù hợp III, CÁC KỸ THUẬT CỤ THỂ Kỹ thuật tách tế Kỹ thuật nuôi cấy tế Kỹ thuật dung hợp tế bào trần bào trần bào trần 10 IV Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần lai tế bào soma Triển vọng phương pháp nuôi cấy dung hợp tế bào trần lớn: Sau loại bỏ thành tế bào nuôi cấy môi trường thích hợp, tế bào trần tái tạo nhanh chóng thành tế bào đưa hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành TB 30 Các tế bào trần có khả tiếp nhận vật liệu từ bên đưa vào tế bào Do đó, tế bào trần đối tượng thích hợp cho nghiên cứu đưa nhân lạp thể, ti thể, DNA, Plasmit vào tế bào Quần thể tế bào trần xem hệ thống tế bào đơn Do thao tác tương tự vi sinh vật qua lựa chọn dòng đột biến tách dòng quần thể tế bào thực vật 31 Một số ứng dụng khác • • Sản xuất dòng bố mẹ phục vụ sản xuất hạt lai Sản xuất hợp chất thứ cấp qua nhân sinh khối tế bào môi trường lỏng(nuôi lắc, nuôi bioreactor) • Công nghệ nuôi cấy tế bào trần ứng dụng cho có giá trị kinh tế cao, khó nhân giống bằng phương pháp thông thường 32 • Nhờ kỹ thuật dung hợp người ta lai tạo hai loài thực vật khác nhau, chí loài thuộc chi khác Phương pháp tạo thể có nguồn gen khác xa mà lai hữu tính không thực Cho phép mở rộng nguồn gen loài thực vật, tạo dòng tế bào sản xuất mang đặc tính di truyền ưu việt bố mẹ Nhiều lai tạo có lực chống cỏ dại chống nấm bệnh 33 • Tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu sinh lí tế bào: tính thấm màng, vận chuyển chất hòa tan, ion, chế hoạt động hoocmon thực vật… • Một ứng dụng đầy triển vọng khác nuôi cấy tế bào trần vi nhân giống thực vật 34 V, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy dung hợp tế bào trần Quy trình nuôi cấy protolast từ thuốc .Nguyên liệu thực vật: thứ từ xuống Lá nguồn nguyên liệu thông dụng truyền thống cho kĩ thuật protoplast thực vật, cho phép phân lập số lớn tế bào tương đối đồng 35 Phương pháp để tách protoplast từ cây: • Khử trùng mẫu • Ngâm mẫu dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất • Tách lớp mặt • Ngâm mẫu hỗn hợp enzyme • Tinh tế bào trần • Nuôi cấy tế bào trần môi trường thích hợp dung hợp hay chuyển nạp • gene Lá thuốc in vitro sử dụng làm nguyên liệu tách protoplast Sử dụng tách ngày 36 Các bước phân lập protoplast từ a) Chuẩn bị môi trường Dung dịch enzyme tách protoplast: + Onozuka cellulose R10 0,5% + Onozuka macerozyme R10 0,1% + Mannitol 13,0% + pH môi trường ̴ 5,8 Dung dịch khử trùng bằng màng lọc Milipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2 – 0,25 µm 37 Tiến hành Ngày thứ nhất: Các mẫu lọai bỏ hết gân đặt đĩa petri thủy tinh vô trùng Dùng dao cấy băm nhỏ mảnh Các mảnh băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 ml bổ sung 10 ml dung dịch enzyme tách protopast Bọc cóc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn đặt tối qua đêm máy lắc tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút) 38 Ngày thứ hai Chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng ( Ø = 65µm) đặt cốc loại 50ml Bổ sung thêm 3ml dung dịch rửa vào cốc chứa mảnh vụn, lắc mạnh, lọc tiếp lưới lọc l Chuyển hỗn hợp protoplast - enzyme vào tube ly tâm loại 15ml ly tâm 50g 10 phút Loại bỏ phần dịch phía trên, thêm 1ml dung dịch rửa lên bề mặt dung dịch tách protoplast cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt tạo thành hai pha, ly tâm 50×g 10 phút Các protoplast sống sót nằm bề mặt dung dịch 39 Hút lớp protoplast màu xanh lục tube ly tâm chuyển sang tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa ly tâm lại Protoplast lắng xuống đáy tube có dạng viên Rửa protoplast them lần 10 ml dung dịch rửa Đặt giọt protoplast lên buồng đếm hồng cầu ước lượng mật độ protoplast Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast chuyển sang đĩa petri vô trùng Bọc lại, ghi nhãn nuôi cấy qua đêm tối 28˚C 40 Ngày thứ ba:Chuyển sang nuôi cấy ánh sang yếu bọc lớp vải thưa đèn huỳnh quang ánh sang trắng, với chu kì chiếu sang 16 giờ, nuôi hai ngày Ngày thứ năm:Chuyển sang nuôi cấy cường độ ánh sang cao ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa 41 Ngày thứ bảy: Ta có kết việc nuôi cấy protoplast, số tế bào phân chia từ tổng số tế bào ban đầu, mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy Có dấu hiệu nhiễm không 42 Kết luận Tóm lại kỹ thuật nuôi cấy dung hợp tế bào trần có vai trò quan trọng có triển vọng lớn Đặc biệt kỹ thuật dung hợp lai tạo hai loài thực vật khác nhau, chí loài thuộc chi khác nhau, tạo phong phú nguồn gen thực vật Vì vậy, cần phát huy mạnh kỹ thuật ứng dụng chọn tạo giống trồng nhiều lĩnh vực khác 43 Cảm ơn cô giáo bạn ý lắng nghe 44 ... Kỹ thuật nuôi cấy tế Kỹ thuật dung hợp tế bào trần bào trần bào trần 10 Kỹ thuật tách tế bào trần a) Nguyên tắc Enzyme xenlulolaza, pectinaza hemixenluloza để phân giải thành TB giải phóng tế bào. .. bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào, màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất nhân tế bào Protoplast • • Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với hợp thành tế bào hợp tế bào trần dung Nếu tế. .. vào tế bào thực vật mà trước thường bị vỏ tế bào ngăn cản Cho phép khả dung hợp tế bào- gắn hai tế bào trần lại thành tế bào với hai thông tin di truyền hai tế bào Tế bào lai thu đực từ dung hợp