Đ A I H O C Q U Ố C G I A HA NÔI NGU YẾN V À N MÙI ffia ! (Ị}G Hểl NỌI NHÀ XUẢT B n đại học q uố c g ia hà nội ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI • • • NGUYỄN VẢN MỪI THỰC HÀNH ■ HOÁ SINH HỌC NHÀ XUẤT B Ả N ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI - 2001 Lời n ó i d ầ u ~ C h ương Hoá c h ấ t d u n g d ị c h .9 I Khái niệm vê hoá c h ấ t II Dung dịch 13 III Nồng độ dung dịch 14 IV Pha dung dịch tiêu chuẩn để chuẩn độ 22 V Cách tính hệ số điều c h ỉn h .25 VI Bài t ậ p 26 C h ng P h n g p h p lấy m ẩu p h ả n t í c h .29 I Lấy m ẫ u 29 II Chuẩn bị mẫu phán tích 31 III Cỏ định m ẫ u 31 C h ng P h n g p h p s o m a u 34 I Phương pháp so m àu 34 II Định luật L am bert-B eer 35 III Màu dung dịch chọn hước sóng ánh sáng (hay chọn kinh lọc m u ) 37 C h ng P h n g p h p q u a n g p h ố k ế 43 I Hấp thụ tử ngoại loại cuvet khác n h a u 44 II Quang phổ hấp thụ tử ngoại NAD* N A D H 44 III Ước tính khôi lượng NADH 45 C h n g Đ in h lư ợ n g g l u x i t .46 I Định lượng đường khứ theo phương pháp B e rtra n d 46 II Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng Rodzevich 50 III Định lượng glucozd máu phương pháp N e lso n 52 rv Định lượng fructozd (lung dịch có lản đường khử khác 53 V Định lượng đường khử phường pháp axit dinitro-salicylic (DNS) 55 VI Định lượng sacarozd theo phương pháp thuỷ phân axit 56 VII Đinh lượng tinh bột theo phương pháp thuỷ phân a x i t .57 VIII Định lượng xenlulozơ 59 IX Định lượng pectin phương pháp canxi p e c ta t 60 X Định lượng dextrin phương pháp kết tủ a vối cồn 61 C h ơng Đ ịn h lư ợng lipĩt 63 I Định lượng lipit máy Soxhlet 63 II Xác định sô lip it 6 Chương Đ ịn h lư ng a x ỉt am in p r o t e i n 72 I Định lượng axit amin phương pháp chuẩn độ íbrmol (phương pháp Sorensen) * 72 II Định lượng axit amin n in h iđ n n 74 III Định lượng axit amin nhờ tạo thành phức chất vối đồng (Phương pháp Pope Stevens) .76 IV Định lượng nitd phương pháp Kjeldahl 78 V Định lượng protein phương pháp Lowrv .83 VI Định lượng protein tỏng sỏ, albumin globulin huyêt máu phương pháp Biure 84 VII Định lượng protein Coomasie Brilliant Blue G-250 86 VIII Định lượng protein phương pháp quang p h ô .89 C hương Đ ịn h lư ợ n g a x it n u c l e i c 92 I Phương pháp Schimidt T h ann hauser 92 II Phương pháp Schneider 94 III Phương pháp Ogur R osen 95 IV Phướng pháp quang phố 97 V Định lượng hợp chất photpho mô ruột theo phương pháp Schmidt T hannhauser có sửa đ ổ i 98 VI Định lượng photpho theo phương pháp Horecker cộng 101 VII Định lượng photpho vỏ có nguồn gốc từ photpholipit theo phường pháp Delorv ĩ 101 VIII Định lượng ARN orxinol 102 IX Định lượng ADN phướng phấp điphenylam in 104 C h ơng Xáo đ ịn h h o t đô củ a m ộ t sô e n z i m 106 I Định nghĩa (lơn vị hoạt độ enzim .106 II Chú ý xác định hoạt độ enzim 106 III Xác định hoạt độ ascorbat oxidaza 107 IV Xác định hoạt độ a- amylaza theo Rukhliadeva Geriacheva 108 V Xác định hoạt độ c a talaza 112 VI Xác định hoạt độ cholinesteraza huyết (ChE) - phương pháp sửa đổi H estrin 113 VII Xác định hoạt độ glucoamylaza .114 VIII Xác định hoạt độ lip aza .116 IX Xác định hoạt độ papain 118 X Xác định hoạt độ pepsin phương pháp A nson 121 XI Xác định hoạt độ peroxidaza 123 XII Xác định hoạt độ photphataza kiếm photphataza axit theo phương pháp King Armstrong 125 XII ỉ Xác định hoạt độ proteinaza theo phương pháp Anson cai tiên 127 XIV Xác định hoạt độ ureaza theo phương pháp chuân đ ộ 130 C hương 10 Đ ịn h lư ợ ng v i t a m i n 132 I Định lượng vitamin c theo phương pháp chuẩn đ ộ 132 II Định lượng vitamin B2 phương pháp huỳnh quang 135 III Định lượng vitamin B phương pháp huỳnh quang 142 Chương 11 Đ ịn h lư ợng m ộ t sô" n g u y ên t ô 144 I Định lượng photpho 144 II Định lượng Kali tổng sô thực vật Natri Cobantinitrit 150 III Định lượng Canxi Magie tống sô thực vật trilon B 151 IV Định lượng Canxi mô theo phương pháp R etinxki 152 V Định lượng sắt 154 ("hương 12, Phụ lục 155 I Các dung dịch đệm 155 II Dung dịch pH c h u ẩn 163 III Nồng độ axit amoniac thường g ặ p .163 IV Pha dung dịch phần trăm axit amoniac 164 V Khỏi lượng mol phân tử tỷ khôi sô" a x i t 165 VI Kiêm tra nồng r*\ dung dịch chuẩn độ pha dung dịch chát gốc có nồng độ x ác 165 VII Chỉ thị màu axit - bazơ 166 VIII Cách pha sử dụng số thuốc thử thị màu thông thường 167 IX Các dung dịch rửa dụng cụ bẩn phòng thí nghiệm 168 X Nguyên tử khôi sô" nguyên tô" 169 XI Nồng độ dung dịch amoni sunfat băo hoà nhiệt độ khác 170 XII Cách tính lực li t â m 170 XIII Các ký hiệu quy định kích thưóc phần thập p h â n 170 XIV Các chữ Hy L p 171 XV Các tính chất sô đồng vị phóng xạ ứng dụng ysinh học .171 XVI Sự phụ thuộc tỷ khổi sô" khúc xạ vào nồng độ dung dịch .172 Tài liệ u t h a m k h ả o 173 Lời nói đ ầ u Giáo trình "Thực hành hoá sinh học” dùng cho sinh viên năm thứ ba, ngành Công nghệ Sinh học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quỏc gia Hà Nội Sinh viên tiến hành làm 20 thực hành 11 chương khác nhau, tùy thuộc điều kiện, sở vật chất phòng thí nghiệm cho phép Cán phụ trách thực hành có thê lựa chọn phần như: cách tính toán loại nồng dộ, xứ lý mẫu till nghiệm, phương pháp so màu, phương pháp quang phổ kê, định lượng gluxit, định lưựng lipit., định lượng axit am in protein, định lượng axit nucleic, xác định hoạt độ định lượng vitamin, định lương sô' nguyên tô'kim loại Ngoài ra, quyên sách dùng cho thực tập chuyên đề sinh viên năm t hủ' tư phục vụ cho học viên cao học làm luận án thạc sĩ thuộc chuyên ngành Hoá sinh học, trưòng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Sách đả sửa chửa bố sung sô phương pháp chương định lượng protein, xác* định hoạt độ sô" enzim, định lượng sô" nguyên tô" kim loại so với lan xuàt ban đầu Tác giả Chương HOA CHAT VA DƯNG DỊCH I KHÁI NIỆM VỂ HOÁ CHẤT C ác c h ấ t h o ả học Các chất dùng đê phân tích hoá học, làm tiêu phòng thí nghiệm gọi hoá chất Các hoá chất có thê chất rắn, lỏng, khí có mức độ tinh khiết khác - Sạch kỹ th u ật - Sạch phản tích * Sạch hoá học Hoá chất được-'đóng chai lọ thuỷ tinh, nhựa có nhãn ghi (Hình ): - Tên hoá chất - Công thức hoá học - Mức độ - Khôi lượng hoá chất - Phân tử khôi - Nơi sán xuất - Điều kiện bảo quản Ethyl acetate GPR CH3COOC2H5 M.W.88.11 g/ml 0.90 99% By IR spectrum Maximum Limits o f Impurities Water Non-volatile matter Acidity (CH 3CO O H ) Ethanol Heavy metals (as Pb) 1% 0.005% 0.05% 0.5% 0002% Hinh 1.1 - Nhãn hoá chất Tính chất nguy hiểm hoá chất cảnh báo ký hiệu in hoá chất (Hình 1.2) Chất kích thích Chất ản mòn C hất dễ cháy C hất dễ nổ Chất dễ oxi hoá Chất độc nhàn C hất độc hại môi trường Chất có khói độc Chất có phóng xạ Hình 1.2 - Các kỷ hiệu cảnh báo hoá chất nguy hiểm Trong quan nghiên cứu nhà máy sản xuất hoá chất có vùng nguy hiểm cảnh báo ký hiệu (Hình 1.3), biển hiệu cấm (Hình 1.4) biên hiệu điều kiện an toàn (Hình 1.5) A A A A A Rủi 1*0 sinh học Phải rửa tay trước Chông ồn + * Mù kính báo hiêm, chông ôn Chỉ Phải có găng tay cao su % Mủ che đâu mặí Phải ủng cao su Găng tay bảo hiểm có cổ tay Phải có trang Phải có kính Phải có mặt nạ chống: độc Tire nearest first box 'msituated— > Person in .c .h a rg e flH J - Dội nưóc khẩn cấp Hộp trợ cứu Rửa mắt TrỢ cứu đầu tién Hình 1.5 - Các ký hiệu vế điểu kiện an toàn 12 X pH X pH X pH 0,00 9,64 5,0 7,42 11,0 4,33 0,25 9,16 5,5 7,25 12,0 4,13 0,50 8,90 6,0 6,99 13,0 3,88 0,75 8,68 6,5 6,75 14,0 3,62 1,00 8,55 7,0 6,12 15,0 3,20 2,00 8,18 8,0 5,32 16,0 2,62 3.00 7,90 9.0 4,93 - - 4,00 7,66 10,0 4,66 - - 11 D ung dịch đệm cacb on at ( pH = 9,2 4- 10,7) a) D u n g d ị c h n a i r i c a c b o n a t 0,2M : 21,2g Na.^CO.Ị hoà ta n dẫn nước đến 100 ml b) D u n g d ị c h n a t r i h i đ r o c a c b o n a t , M : 16,8g NaHCO., hoà ta n dần nước đến 1000 ml Dung dịch đệm cacbonat có pH khác n h au phụ thuộc vào sô m ililit dung dịch (a) sô m ililit dung dịch (b) dẫn nước đến 0 ml a b pH a b pH 4,0 46,0 9,2 27,5 22,5 10,0 7,5 42,5 9,3 30,0 20,0 10,1 9,5 40,5 9,4 33,0 17,0 10,2 13,0 37,0 9,5 35,5 14,5 10.3 16,0 34,0 9,6 38,5 11,5 10,4 19,5 30,5 9,7 40,5 9,5 10,5 22,0 28,0 9,8 42,5 7,5 10.6 25,0 25,0 9,9 45,0 5,0 10,7 12 D ung dịch dệm đa n ăn g B rittonvà R obinson (pH = 1,8 4- 12) a) D u n g d ị c h g ố c : axit axetic (CHflCOOH) 0,04m (2,32m l pha th n h 1000ml), axit photphoric (H ^P 04) 0,04M, axit boric 0,04M b) D u n g d ị c h N a O H j M : g NaOH hoà ta n dẫn nưỏc đến 1000ml Dung dịch đệm đa n ăn g có pH khác n h a u phụ thuộc vào 100ml dung dịch gốic (a) thêm X ml dung dịch (b) dẫn nưỏc đến 200ml 160 X pH X pH X pH X pH X pH 0.0 1,81 20,0 3.29 40,0 5,72 60,0 7,96 80,0 10,38 2.5 1,89 22,5 3,78 42.5 6.09 62,5 8,36 82,5 10,88 5,0 1,98 25,0 4,10 54,0 6,37 65,0 8,69 85,0 11,20 7.5 2.09 27,5 4,35 47,5 6,59 67,5 8,95 87,5 11,40 10,0 2.21 30,0 4,56 50,0 6,80 70,0 9,15 90,0 11,58 12,5 2,36 32,5 4.78 52,5 7.00 72,5 9,37 92,5 11,70 15,0 2,56 35,0 5,02 55.0 7,24 75,0 9,62 95,0 11,82 17,5 2.87 37,5 5,33 57,5 7.54 77,5 9,91 97,5 11,92 - • - - - - - - 100,0 11,98 13 D u n g d ịc h đ ệ m Me Ilv a in e ( pH = 2,2 f 8,0) a) D u n g d ịc h a x il x i t r i c OylM : 21,008g axit xitric (C(;H 80 7) hoà ta n dẫn nước đến 1000 nil b) D u n g d ị c h đ i n a t r i h i đ r o p h o t p h a t : 35,62g N a 2H P H 20 71,7g Na.^HPO.j.riH.jO hoà tan dần nưổc đển 1000ml Dung dịch đệm có pH khác phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) đẫn đến 20m l dung dịch (b) X pH X pH X pH X pH 19,60 22 12,90 3,8 8,85 5,4 3,53 7,0 18,76 2,4 12,29 4,0 8,40 5,6 2,61 7,2 17,82 2,6 11,72 4.2 7,91 5.8 1,83 7,4 16.83 2,8 11,18 4.4 7,37 6,0 1,27 7,6 10,89 3,0 10,65 4,6 6,78 6,2 0,85 7,8 15,06 3,2 10,14 4,8 6,15 6,4 0,55 8,0 14,30 3,4 9,70 5.0 5,45 6,6 - • 13,56 3,6 9,28 5,2 4,55 6,8 - - 14 D u n g d ịc h đ ệ m Thc>orella S te in h a g e n (pH = 2,0 -r 12,0) a) D u n g d i c h g ố c : 100ml CH.JfCOOH IN (5,7ml dung dịch ax it axetic đặc d ẫn nưổc đến 1000ml), 100ml axit photphoric (H^PO.ị) IN, 3,54g axit boric 343ml NaOH IN hoà ta n dẫn nước đến 1000ml 161 b) D u n g d ị c h H C l 0,1 N : 8,4ml HC1 đặc (37%) pha th n h 1000ml Dung dịch đệm có pH khác n h a u phụ thuộc vào 100ml dung dịch gôc (a) cho thêm X ml dung dịch (b) dẫn nước đến 500ml X pH X pH X pH X pH X pH 366,0 2,0 247,3 4,2 183.7 6,4 130,5 8.6 77,0 10.8 339,3 2,2 241,8 4,4 176,8 6,6 124,5 8,8 72.6 11,0 319.3 2,4 236,3 4,6 169,6 6,8 118,8 9.0 66,0 11,2 304,0 2,6 231,1 4.8 163,3 7.0 111,9 9,2 56,2 11.4 292,3 2,8 225,9 5,0 157,3 7.2 105.6 9,4 42,0 11,6 282,5 3,0 220,3 5,2 151.8 7.4 99.7 9,6 23,5 11,8 274,8 3,2 214,7 5,4 147,2 7,6 94,1 9,8 2,0 12,0 268,5 3,4 210.0 5,6 143,4 7,8 89,6 10,0 - - 263,3 3,6 203,1 5,8 140,1 8,0 84,9 10,2 - - 257,3 3,8 197,1 6,0 137,3 8,2 81,8 10,4 - - 252,5 4,0 190,5 6,2 134,5 8,4 79,8 10,6 - - 15 D ung dịch đ ệm a x it axetic - am oniac (pH = 3,0 -r 11,0) a) D u n g d ị c h a x i t a x e t ic OylN : 0,57ml axit axetic đặc pha th àn h 1000ml với nước cất b) D u n g d ị c h a m o n i a c ,1 N : Dung dịch đệm có pH khác phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) dẫn đến 100ml dung dịch (b) 62 X pH X pH X pH X pH 99,24 3,0 54.60 5,4 47,80 7,8 16,00 10,2 93,40 3,4 50,90 5,8 46,40 8,2 9,80 10,6 88,20 3,8 50,40 6,2 44,70 8,6 2,48 11,0 80,20 4,2 50,30 6,6 41,00 9.0 - - 66,90 4,6 50,00 7,0 34,00 9.4 - - 58,60 5,0 48,40 7,4 28,00 9,8 - - II DƯ NG DỊCH pH CHUAN D un g dịch đikali tartrat (CịHịO^K.^) bão hoà ° c pH = 3,56; 30 c pH = 3,55 D ung dịch kali p h talat (C8H :- 0.,K ) 0.05M : 10,21 l g hoà ta n nưốc dẫn đến 1000m l, ỏ 20 - °c pH = 4,0 D ung K H ,P dịch N a 2H P O ị 0.025M: 3,402g K H ^O ,, 4,451g N a.;H P 0,j.2H ,0 hoà ta n nước d ẫn đến 1000m l, ỏ 20- " c, pH = 6,86 - 6,88 D ung dịch borat 0.01M : ,8 4g N a 2B 40 7.1 H 20 hoà ta n nưốc dẫn đến 0 ml, 20- ° c , pH = 9.2 III NỒNG Đ Ộ AXIT V À A M O N IA C T H Ư Ờ N G G Ặ P T ỷ k h ố i (d ) ° c % k h ố i lư ợ n g N ồng độ N A xit sunfuric đặc 1,834 ,0 36 ,0 A xìt sunfuric pha loãng 1.178 ,0 6,00 A xit sunfuric pha loãng 1.032 5,00 1,20 A xit clohiđric đặc 1,181 ,0 12,00 Axit clohictric pha loãng 1,098 20,ọo 6,00 A xit clohiđric pha loãng 1,017 10,00 ,0 A xit photphoric đặc 1,700 ,0 14,70 A xit percloric 1,540 ,0 ,0 A xit flohidric đặc 1,146 ,6 ,3 A xit axetic đặc 1,050 100,00 17,50 A xit axetic pha loãng 1,013 10,00 1,70 A xit axetic pha loãng 1,005 ,0 0 ,9 A m oniac đặc ,9 ,0 13,40 A m oniac p h a loãng ,9 10,00 ,0 A m oniac p h a loãng ,9 7 ,0 ,00 T ê n d u n g d ịc h 163 IV P H A D U N G D ỊC H P H A N T R Ả M A X IT V À A M O N IA C (m ililit dung dịch đặc để pha th n h lít) T ỷ k h ố i (d ) C ác n n g đ ộ % m u ố n pha 15°c N ồng độ % 25% 207r 10% 5% 2% 1% CH.ịCOOH 1,05 5 217,8 196,7 97,1 48,2 19,2 ,0 H ,S O , 1.84 ,6 167,7 129,9 60,6 29,3 11,5 5,60 HC1 1,19 37,23 634,8 ,8 23 ,4 115.2 ,5 2 ,6 HNO Ị 1,40 ,6 313,6 115,0 ,0 2 ,0 10,80 NH.ịOH 0,91 0 100,0 ,0 2 ,0 ,4 87.2 3,7 T ên h oá chất P h a d u n g d ịc h c ó n n g đ ộ đ n g lư ợ n g k h c : Hoá c h ấ t Đ ương lượng (N) IN 0,5N 0,2N ,1N 0,05 N H 2S O d (d = l,8 ) 49,04 28 ,0 14,0 5,60 ,80 1,40 ,5 ,2 ml HC1 (đ = l,1 ) 36 ,4 82 ,0 ,0 16,40 ,20 ,1 1,64 0,82 ml H 2C 20 4.2 H 20 ,0 - - - ,3 ,1 1,26 0,6 g KMnO.! 31,61 - * - 3,16 1,58 \ ,6 0,3 g N aO H 40 ,0 ,0 20,0 8,00 ,0 2,0 0 ,8 0 ,4 g KOH 56,11 56,1 28,0 11,20 5,60 2,8 1,12 ,5 g A gN O :1 169,89 • - - 17,00 8,51 ,4 1,70 g N a 2S jj0 3.5 H 20 24 ,2 - - - ,8 12,40 ,0 ,5 g M uôi M ohr * ,1 • - 8,40 ,2 19.60 ,8 3,92 g K2Cr20 ,0 - • 9,81 ,90 ,4 ,9 ,4 g T rilon B ** 186,12 - - - 18,6] ,3 ,7 2 1,861 g 0,02N 0,01 N Đơn vị * M uôi M ohr : s ắ t (II) - am on i su n fa t * F e S 4.(N H 4) S 4.6 H ,0 * * T rilo n B : a x it e ty le n điam in tetra axetic đinatri N a 2H 2(C H vC 0 ) 4.N2(CH />).>.2H ,0 (Com plexom III hay c h e la to n 3) • ,2 Có tà i liệu đương lượng T rilon B = khôi lượng mol (M) Ở đương lượng tín h b ằn g M /2 164 V KHỔI LƯỢNG MOL PHẢN TỦ VẢ TỶ KHỎI CỦA MỘT s ố AXIT N ồng đ ộ (%) T ê n a x it K h ô i lư ợ n g m ol phân Để nhận t (M ) l m o l (m l/1 ) d u n g d ịc h Tỷ khối (d ) Axit nitric (H N O ị) 70 ,7 64 ,4 Axit photphoric (H PO ị) 85 ,8 68 ,7 A xit percloric (HClO.ị) 60 ,2 109 ,5 A xit percloric (HCIO.ị) 70 1 ,6 86 ,6 9 ,5 ,4 58 ,0 Axit su n fu ric (H ,S 4) 96 ,0 56 ,8 A xit clohiđric (HC1) 37 ,0 84 ,1 A xit a x e tic (CH;,COOH) V I K IẾ M T R A N Ồ N G Đ Ộ CÁC D U N G D ỊC H C H U A N đ ộ đ ả p h a bang D Ư N G D ỊC H C H Ấ T G ố c CÓ N ổ N G Đ Ộ C H ÍN H XÁC D u n g d ịc h C hat góc chuẩn dộ dã p h a h 2s o , N a tr i tetraborat ,1N Na.2B