ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH DUY THẢO NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM THỎ BỊ KHUYẾT HỔNG XƯƠNG BẰNG SAN HÔ KẾT HỢP TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG TỰ THÂN Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh - Năm 2017 Công trình hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.BS Trần Công Toại (ghi rõ họ tên, chức danh khoa học, học vị) Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn Phản biện 2: TS.BS Trương Trí Hữu Phản biện 3: TS Bùi Hồng Thủy Phản biện độc lập 1: TS Bùi Hồng Thủy Phản biện độc lập 2: TS.BS Phan Ngọc Tiến Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp vào lúc ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, nhu cầu sử dụng mô xương để ghép điều trị trường hợp khuyết hổng bệnh lý dẫn đến tổn thương xương lớn Các loại mô xương ghép tự thân, đồng loài dị loài sử dụng để đáp ứng nhu cầu ghép xương ngày gia tăng người bệnh Tuy nhiên, loại mô xương ghép chưa đáp ứng đủ nhu cầu người bệnh, mặt khác, việc sử dụng nguồn mô xương có ưu, nhược điểm định Từ đặt nhu cầu cho nhà nghiên cứu, nhà lâm sàng làm để chế tạo loại vật liệu có khả dùng để ghép thay mô xương Do đó, có nhiều loại vật liệu ghép thay xương nghiên cứu phát triển, từ loại vật liệu có nguồn gốc tự nhiên loại vật liệu tổng hợp nhân tạo Các loại vật liệu trước hết phải có tính tương hợp sinh học, phải có khả cảm ứng kích ứng tạo xương, có độ bền học để đảm nhận vai trò vật lý mô xương cuối thoái biến sinh học để chuyển hóa thành mô xương chủ Tuy nhiên, điểm hạn chế loại vật liệu ghép xương chưa bổ sung loại tế bào phù hợp để thúc đẩy hỗ trợ cho trình tái tạo mô xương diễn nhanh hiệu Vì vậy, loại vật liệu dùng để ghép thay xương đòi hỏi đáp ứng yêu cầu vật liệu ghép thay xương truyền thống mà phải mang tế bào có khả tạo xương để thúc đẩy tiến trình lành xương nhanh hiệu Một loại vật liệu sinh học sử dụng phổ biến ghép thay xương là hợp chất có canxi, số san hô biển San hô có thành phần chủ yếu canxi carbonate (98-99%), sau trình xử lý san hô chứa canxi carbonate với chất khoáng thành phần có chứa xương người, phù hợp với chuyển hóa hấp thu thể nên sử dụng làm vật liệu ghép thay xương phổ biến y học tái tạo Ngoài ra, khung san hô có đặc tính phù hợp cho tế bào bám dính, tăng trưởng phát triển khối san hô điều kiện nuôi cấy tạo mảnh ghép thay xương theo xu hướng kỹ nghệ mô đại giới Mảnh ghép tạo không đáp ứng tiêu chuẩn vật liệu ghép thay xương mà mang tế bào phù hợp có khả tạo xương để giúp trình lành xương xảy nhanh Xuất phát từ lý trên, thực nghiên cứu: “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm thỏ bị khuyết hổng xương san hô kết hợp tế bào gốc tủy xương tự thân” Mục đích nghiên cứu luận án sử dụng san hô làm khung xương để mang tế bào gốc tự thân thu nhận từ tủy xương để tạo mảnh ghép thay xương dùng để ghép điều trị cho trường hợp khuyết xương mô hình thỏ Kết mà nghiên cứu mang lại tạo mảnh ghép thay xương hiệu loại vật liệu ghép xương truyền thống, phục vụ nhu cầu ghép xương ngày gia tăng người bệnh ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đây nghiên cứu có triển khai ứng dụng mô hình động vật nhằm đánh giá tiềm mảnh ghép tạo từ khung san hô tế bào gốc thu nhận từ tủy xương để tái tạo khuyết hổng xương - Nghiên cứu sử dụng san hô làm khung xương để mang tế bào gốc tự thân thu nhận từ tủy xương để tạo vật liệu ghép thay xương hướng nghiên cứu Việt Nam - Vật liệu thay xương có mang yếu tố cần thiết kỹ nghệ mô gồm tế bào, giá thể yếu tố sinh học tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương, khung san hô làm giá thể yếu tố sinh học môi trường nuôi cấy để tạo mảnh ghép - Luận án thiết lập quy trình từ khâu thu nhận, tạo mảnh ghép đánh giá mảnh ghép điều kiện in vitro thực đánh giá tiềm mảnh ghép điều kiện in vivo phần thân xương đùi thỏ - Mảnh ghép tạo dựa công nghệ vật liệu công nghệ tế bào gốc thật cho thấy có hiệu để tái tạo trường hợp khuyết hổng xương, giúp trình liền xương xảy nhanh chất lượng liền xương tốt so sánh với mẫu đối chứng - Đây thực hướng nghiên cứu luận án góp phần tiệm cận với lĩnh vực kỹ nghệ mô phát triển đạt nhiều thành tựu to lớn BỐ CỤC LUẬN ÁN Luận án gồm 121 trang không kể phần tài liệu tham khảo, có bố cục sau: - Đặt vấn đề: trang - Chương 1: Tổng quan tài liệu: 32 trang - Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 13 trang - Chương 3: Kết bàn luận: 61 trang - Chương 4: Kết luận: trang - Kiến nghị: trang - Tài liệu tham khảo: 18 trang - Gồm 12 bảng; 34 hình 03 biểu đồ NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KỸ NGHỆ MÔ Kỹ nghệ mô lĩnh vực đa ngành, ứng dụng công cụ kỹ thuật kết hợp y sinh học khoa học kỹ nghệ để sử dụng tế bào sống thu hút tế bào nội sinh nhằm hỗ trợ hình thành tái tạo mô để hồi phục, trì cải thiện chức mô, áp dụng để sửa chữa, tái tạo tổn thương nhiều loại quan khác mô xương, gan, tụy … mạch máu Riêng kỹ nghệ mô xương nhằm nghiên cứu để tạo loại mô xương kỹ nghệ dùng để thay mô xương Một lợi ích quan trọng công nghệ sử dụng tế bào tự thân người bệnh để tạo mảnh ghép cho họ, mảnh ghép thay dễ dàng vượt qua rào cản miễn dịch ghép thể So với việc sử dụng mô ghép tự thân, mô kỹ nghệ sử dụng lượng tế bào hiến (vì số tế bào thu nhận làm tăng số lượng tế bào thông qua việc nhân khối in vitro) làm giảm tổn thương cho người bệnh phải phẫu thuật thu nhận mô xương tự thân để ghép vào khuyết hổng tổn thương xương dẫn đến xương Các thành phần để tạo mảnh ghép thay xương dựa tảng kỹ nghệ mô gồm có yếu tố tế bào tạo xương, giá thể (khung xương) yếu tố hoạt hóa sinh học để hỗ trợ trình tạo xương 1.2 NGUỒN TẾ BÀO SỬ DỤNG TRONG KỸ NGHỆ MÔ XƯƠNG Trong kỹ nghệ mô, nguồn tế bào có khả phát triển yếu tố quan trọng Nguồn tế bào sử dụng tế bào từ người bệnh (ghép tự thân) Hiện tại, ghép mô tự thân xem tiêu chuẩn vàng chữa trị Mô lấy trực tiếp từ người bệnh, nhân khối, tái cấu trúc in vitro sau ghép lại cho người bệnh Các tế bào tiền thân tạo xương thường sử dụng kỹ nghệ mô xương chúng có khả tăng trưởng, có tiềm biệt hóa để tạo tế bào tạo xương tương đối dễ dàng so với dòng tế bào khác Tuy nhiên, chúng cần phải kích thích để biệt hóa thành tế bào tạo xương, tổng hợp nên protein ngoại bào tạo thành khung ngoại bào mô xương Tủy xương nguồn mẫu lý tưởng để cung cấp tế bào gốc (TBG) tế bào tiền thân tế bào tạo xương, việc phân lập, nuôi cấy biệt hóa tế bào sử dụng cho kỹ nghệ mô xương luận án 1.2.1 Tế bào gốc trung mô Hiện nay, TBG xem nguồn tế bào vô tận Chúng thu nhận từ phôi, bào thai mô trưởng thành Ngược lại với tế bào từ thể trưởng thành, TBG có khả tăng sinh không giới hạn nên sử dụng liệu pháp điều trị Ngoài ra, tế bào có khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác thể cảm ứng điều kiện nuôi cấy thích hợp Trong giai đoạn phôi, lớp trung bì phôi tạo thành lớp ngoại bì nội bì phôi Lớp tế bào phần trung bì có chứa tế bào cho TBG trung mô Các TBG quần thể tế bào gốc đa tiềm tồn sau sinh 1.2.2 Nguồn gốc xác định tế bào gốc trung mô Vào năm 1970, nhóm nghiên cứu Friedenstein nhận thấy nuôi cấy dịch tủy xương động vật, đĩa nuôi xuất cụm tế bào có hình thái giống nguyên bào sợi, tác giả gọi đơn vị tạo cụm nguyên bào sợi (Fibroblastic-Colony Forming Units - CFU) Trong điều kiện in vitro, tế bào diện thành cụm tế bào lớn, nhân khối nhanh từ phân chia tế bào đơn lẻ Một số nhóm nghiên cứu chứng minh tính đa tiềm tế bào điều kiện in vitro 1.2.3 Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô TBG trung mô thu nhận từ nhiều nguồn mô khác phôi thai thể trưởng thành Tuy nhiên, nhà nghiên cứu tập trung nhiều loại mô có nguồn gốc từ thể trưởng thành điểm bật mà mô mang lại dễ thu nhận, vượt qua rào cản y đức dễ dàng để ghép tự thân lại cho người bệnh Có thể thu nhận quần thể tế bào TBG trung mô mô khác thể người trưởng thành Tuy nhiên, TBG trung mô lần thu nhận tủy xương 1.2.4 Phân lập trì tế bào gốc trung mô TBG trung mô thường phân lập từ tủy xương xương mào chậu người Nhiều nghiên cứu tiến hành để thiết lập quy trình thu nhận TBG trung mô từ tủy xương người trưởng thành nhân khối in vitro quần thể tế bào Khả tăng trưởng trì tiềm biệt hóa TBG trung mô phụ thuộc vào nhiều yếu tố nguồn mô thu nhận, kỹ thuật nuôi cấy, hóa chất sử dụng … Trong đó, đặc biệt việc lựa chọn loại huyết phù hợp để bổ sung vào môi trường nuôi tế bào Ngoài ra, việc nhân khối TBG trung mô thời gian dài cần thiết để sử dụng lượng lớn TBG trung mô y học tái tạo số lượng TBG trung mô tủy xương thấp 1.2.5 Đặc điểm định danh tế bào gốc trung mô Hội liệu pháp Tế bào Quốc Tế (International Society for Cellular Therapy – ISCT) đưa tiêu chí để sử dụng cho việc định danh quần thể tế bào TBG trung mô Theo đó:  Thứ nhất, tế bào có khả bám dính vào chai nuôi tiến hành nuôi cấy điều kiện in vitro  Thứ hai, chúng không biểu marker tế bào tạo máu CD11b, CD14, CD34, CD45, Blymphocyte antigens CD19 CD79a HLA-DR biểu marker CD73, CD90 CD105 (endoglin)  Thứ ba, chúng có khả biệt hóa thành tế bào dòng trung mô tế bào sụn, tế bào mỡ tế bào xương điều kiện in vitro 1.2.6 Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương Quá trình biệt hóa TBG trung mô thành nguyên bào xương thể qua bốn giai đoạn chính: (1) tế bào gốc trung mô, (2) tế bào tiền thân tạo xương, (3) tiền nguyên bào xương, (4) nguyên bào xương cuối nguyên bào xương phát triển thành tế bào xương trưởng thành Việc cảm ứng TBG trung mô với môi trường tạo xương bao gồm β-glycerophosphate, ascorbic-2-phosphate, dexamethasone huyết thai bò gây chuỗi tác động phân tử bao gồm hoạt hóa đường truyền tín hiệu biểu marker tạo xương bao gồm alkaline phosphatase (AP), osteopontin, osteocalcin and Cbfa1 1.3 GIÁ THỂ Đối với kỹ nghệ mô giá thể sử dụng cần phải thỏa mãn số tiêu chí Đầu tiên, giá thể cần phải hỗ trợ cho tăng trưởng tế bào, bề mặt giá thể cần phải có tính tương hợp sinh học phép tế bào bám dính Giá thể cần phải có độ xốp để cung cấp chất dinh dưỡng cho tế bào phát triển bên giá thể phân bố khắp giá thể Khi cấy ghép, giá thể xốp phù hợp cho tạo mạch cách nhanh chóng vật liệu cần phải thoái biến lúc với tiến trình tái tạo mô chủ Ngoài ra, mô xương vật liệu cần phải có độ bền học định để phù hợp với chức mô cần cấy ghép Vai trò giá thể cấu trúc ba chiều, sử dụng để kiểm soát biệt hóa, tăng trưởng di chuyển tế bào Giá thể hoạt động cấu trúc hỗ trợ lực tạm thời Ngoài ra, giá thể sử dụng “giàn giáo” thay cho chức chất ngoại bào cần phải thỏa mãn tiêu chí đặc hiệu cho loại mô 1.4 CÁC YẾU TỐ HOẠT HÓA SINH HỌC Các thành phần cảm ứng tạo xương sử dụng kỹ nghệ mô hoạt chất sử dụng cho tế bào tiền thân TBG Những thành phần bao gồm yếu tố tăng trưởng yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi, yếu tố tăng trưởng insulin, yếu tố tăng trưởng từ tiểu cầu protein hình thái xương Đặc biệt protein hình thái xương sử dụng nhiều để kết hợp với giá thể hydroyapatite để gia tăng hiệu sửa chữa khuyết hỗng xương chuột so sánh với trường hợp sử dụng hydroyapatite 1.5 SỬ DỤNG SAN HÔ LÀM VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG San hô tự nhiên sau xử lý loại bỏ thành phần hữu (xác polyp) chứa calci carbonate với chất khoáng khác thành phần có chứa xương người Vì thành phần hấp thu chuyển hóa thể người Do đó, vật liệu phù hợp để chế tạo thành vật liệu ghép thay xương Trong trường hợp ổ khiếm khuyết xương có hình dạng phức tạp gây sau chấn thương hay phẫu thuật, việc tìm mảnh ghép có hình dạng tương tự thường gặp nhiều khó khăn Hơn nữa, mảnh ghép không cố định chặt, để lại khoảng trống mô ghép xương chủ có nguy mảnh mô vụn xung quanh lọt vào khoảng trống làm chậm trình liền xương, chí gây thải ghép hay nhiễm trùng sau Tuy nhiên, san hô biển loại vật liệu tạo hình mảnh ghép theo khuyết hỗng mô xương tương đối dễ dàng, khắc phục khó khăn hình dạng mô ghép gây để nâng cao hiệu mảnh ghép trình phẫu thuật giữ ổn định mảnh ghép san hô không khó khăn thực Nguyên tắc xử lý, chế tạo san hô thành vật liệu ghép thay xương Chế phẩm san hô tự nhiên chứng minh ứng dụng có hiệu nhiều lĩnh vực lâm sàng Cột sống, Chi, Sọ-Mặt, Nha; Tai-Mũi-Họng, Mắt … Về nguyên tắc quy trình xử lý san hô tự nhiên tương đối dễ thực hiện, chủ yếu bao gồm việc loại bỏ polyp chứa phần lớn thành phần hữu san hô Một số tác giả nghiên cứu người Pháp sử dụng sóng siêu âm để xử lý san hô Porites Các tác giả cho việc phơi nắng mảnh san hô phá hủy polyp Một số tác giả người Bulgari mô tả việc phá hủy polyp dung dịch hypochlorite, chiết rút chất hữu nước khử khoáng, sấy khô 900C sau hấp cao áp 1300C Ngoài ra, quy trình đưa phải thỏa mãn nhiều tiêu chí Trước hết, công đoạn xử lý san hô phải đảm bảo tiêu chí không phá hủy cấu trúc xốp tự nhiên san hô Các kỹ thuật áp dụng phạm vi khả thi điều kiện nước không làm tăng cao mức giá thành sản phẩm Tiếp theo, quy trình phải loại trừ thành phần vật liệu gây tác động có hại thể vật chủ, chủ yếu bao gồm xác polyp Chế phẩm san hô phải khử trùng theo tiêu chuẩn áp dụng cho vật liệu ghép San hô thường tiệt trùng chủ yếu nước tia gamma số trường hợp khí ethylene oxide Trước khử trùng, mẫu san hô thường làm thành phần hữu cách ngâm dung dịch 5% sodium hypochlorite 30 phút sau làm khô cách xử lý nhiệt xử lý cách sử dụng sóng siêu âm Sau cùng, chế phẩm san hô phải đóng gói bao bì phù hợp phải xác định thông số vật lý hóa học 1.6 MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT TRONG ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG Thỏ loài động vật thường sử dụng cho nhiều nghiên cứu y học, sử dụng khoảng 35% nghiên cứu liên quan xương khớp Đó thỏ có thuận lợi định việc xử lý thao tác kích thước thể thuận tiện cho việc phẫu thuật chăm sóc Ngoài ra, thể thỏ đạt đến trưởng thành mô xương thời gian ngắn sau thành thục sinh dục vào khoảng tháng tuổi điều phù hợp để triển khai nghiên cứu liên quan xương khớp chờ đợi lâu để thu thập kết 1.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH LÀNH XƯƠNG Xương tồn nhiều hình dạng kích cỡ khác nhau, chưa có tiêu chuẩn thiết lập để đánh giá trình lành xương Do đó, có số kỹ thuật chung để đánh giá trình lành xương phụ thuộc vào mảnh ghép mô hình động vật sử dụng để lựa chọn 1.7.1 Dựa hình ảnh X-Quang Vì có thông tin khoa học có giá trị phát triển trình sửa chữa xương sở chứng hình ảnh học (trên phim X-quang), đánh giá hình ảnh phim X-quang trình sửa chữa xương phụ thuộc phần lớn vào kinh nghiệm người thực kỹ thuật chụp phim X-quang Tuy nhiên, số đặc điểm đặc trưng trình sửa chữa xương (gãy xương hở, mô sợi hóa mép xương, hoạt động mức màng xương, xuất mô sẹo, mật độ mô sẹo, tu sửa xương, bắc cầu xương …) quan sát cách rõ ràng phim X-quang số điểm đặc trưng định lượng Ngoài ra, thước đo phim Xquang sử dụng công cụ khách quan để đánh giá trình sửa chữa xương 1.7.2 Dựa hình thái mô xương Các thông số tiêu chí mô xương quan sát định lượng thông qua tiêu mô học Một vấn đề quan trọng phát sinh phân tích định lượng mẫu mô học làm để lấy mẫu cách xác (do mẫu mô không đồng nhất) để có tập hợp phép đo diện tích có ý nghĩa mặt thống kê phản ánh thay đổi đặc điểm sinh học hình ảnh học mô xương cần phải bảo quản mẫu để thực lại thí nghiệm nhiều lần Tóm lại, lựa chọn mô hình thử nghiệm động vật phù hợp điều kiện tiên để có kết nghiên cứu hoàn chỉnh triển khai lâm sàng Đánh giá cách đầy đủ số liệu, phân tích cụ thể mô hình động vật trước thực nghiệm bước khởi đầu quan trọng Những khía cạnh y đức phải xem xét mô hình động vật dễ bị nhiễm bệnh, truyền bệnh phẫu thuật gây đau đớn cho động vật thí nghiệm nên ưu tiên lựa chọn Các thử nghiệm ban đầu phải thực vài loài động vật nhỏ để đánh giá tính khả thi phương pháp thử nghiệm kết có tính lặp lại trước triển khai mô hình động vật lớn CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU + Tủy xương thu nhận từ xương mào chậu người hiến Khoa Chấn Thương Chỉnh Hình, Bệnh viện Chợ Rẫy Bệnh viện Chấn thương Chỉnh hình + Thỏ nâu (Việt Nam) + San hô (Loài Porites Lutea) xử lý thành mảnh ghép thay xương Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Bộ môn Mô – Phôi, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU: Mẫu tủy xương người: + Người cho mẫu có xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV VDRL + Người cho mẫu đồng ý cho mẫu tủy xương để thực nghiên cứu (có giấy xác nhận kèm đồng ý cho tiến hành nghiên cứu) + Mẫu thu nhận điều kiện phòng mổ bệnh viện Thỏ nâu: + Được cung cấp từ trang trại, thỏ chọn thỏ đực + Thỏ chọn thỏ khỏe mạnh, trọng lượng trung bình từ 2,00 – 2,5 kg + Tuổi thỏ chọn khoảng tháng tuổi Mẫu san hô: + San hô cung cấp từ Viện Hải Dương Học Nha Trang + Được xử lý theo quy trình vật liệu ghép Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh học, Bộ môn Mô – Phôi, Trường ĐHYK Phạm Ngọc Thạch + Được xử lý vô trùng, đóng gói bảo quản nhiệt độ phòng 2.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thực theo phương pháp thực nghiệm – mô tả 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phân lập, nuôi cấy định danh tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương người 2.3.1.1 Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người Thu nhận khoảng 02 ml tủy xương người tube chứa sẵn 300µl heparin để chống đông Tế bào gốc tách phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng với dung dịch Ficoll-Paque (Amersham, Germany) Đánh giá mật độ tế bào thu nhận với buồng đếm Neubauer Mật độ tế bào đem nuôi nằm khoảng từ 105 – 106 tế bào/ml Sau đó, tế bào phân lập nuôi môi trường gồm DMEM/F12, 10% FBS, Pen-Strep Tế bào nuôi tủ ấm 370C, 5% CO2 Môi trường thay lần/ngày 2.3.1.2 Định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người Trong nghiên cứu này, áp dụng theo tiêu chí ISCT để định danh tế bào gốc trung mô Tiêu chí đánh giá dựa vào đặc tính tế bào, khả bám dính tế bào vào đáy chai nuôi, khả biệt hóa in vitro (biệt hóa thành tế bào xương, tế bào sụn, tế bào mỡ) khả biểu marker bề mặt (đặc biệt marker CD73, CD90, CD105) 2.3.1.3 Đánh giá tính toàn vẹn tế bào qua nhiễm sắc thể đồ Tế bào cấy chuyền đến lần thứ ba sử dụng để thực nhiễm sắc thể đồ nhằm mục đích đánh giá tính toàn vẹn nhiễm sắc thể TBG trung mô qua trình nuôi cấy in vitro Cả hai loại tế bào TBG trung mô nguyên bào xương (được biệt hóa từ TBG trung mô) thực nhiễm sắc thể đồ để đánh giá Nhiễm sắc thể đánh giá theo tiêu chí ISCN (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature) 2.3.2 Tạo mảnh ghép thay xương từ kết hợp tế bào gốc trung mô khung san hô Hiện để tạo mảnh ghép có kết hợp giá thể tế bào sử dụng phương pháp chuyển tế bào lên giá thể cách trực tiếp gián tiếp Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp chuyển tế bào lên khung san hô theo phương pháp gián tiếp để tạo mảnh ghép, dựa vào phương pháp quay ly tâm để đưa tế bào lên khung san hô Đây phương pháp phổ biến, nhiều nhóm nghiên cứu giới sử dụng để tạo mảnh ghép Sử dụng phương pháp tế bào chuyển lên khung san hô cách đồng đều, tế bào phân tán khung san hô điều giúp cho tế bào phát triển hiệu để tạo mảnh ghép 2.3.3 Ghép mảnh ghép san hô mang nguyên bào xương trường hợp khuyết xương thỏ Đối với mục tiêu này, tiến hành lặp lại quy trình thực giống trường hợp tủy xương người Chúng thu nhận tủy xương thỏ, sau tiến hành nuôi cấy định danh TBG trung mô Tiếp theo tạo mảnh ghép kết hợp khung san hô TBG trung mô Mảnh ghép sau ghép vào thân xương đùi thỏ Đây giai đoạn nghiên cứu bỏ qua theo tiêu chuẩn nước quốc tế mảnh ghép tiến hành thực nghiệm người phải thực nghiên cứu, đánh giá hiệu mô hình động vật trước triển khai thực lâm sàng cho người ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU  Đây đề tài nghiên cứu có triển khai thực nghiệm động vật Chúng tuân thủ yêu cầu đảm bảo đạo đức nghiên cứu  Mặc dù luận án có sử dụng tủy xương người để thực số nghiên cứu người hiến tủy xương đối tượng hoàn toàn tỉnh táo nhận thức, người hiến giải thích rõ ràng mục đích hiến tủy xương để thực thí nghiên cứu dừng lại phòng thí nghiệm, người hiến tủy xương giải thích rõ ràng nhận thức lợi ích mà nghiên cứu mang lại rủi ro xảy Tủy xương thu nhận trình điều trị nên không cần phải thực thêm thủ thuật để thu nhận tủy xương  Người hiến hoàn toàn tình nguyện tham gia nghiên cứu đồng ý ký giấy cam kết tham gia vào chương trình nghiên cứu có quyền rút khỏi nghiên cứu lúc CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI 3.1.1 Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người Trong trình thực hiện, tiến hành thu nhận 14 mẫu tủy xương người để tiến hành xây dựng quy trình chuẩn để phân lập nhân khối tế bào gốc từ tủy xương người, có 11 mẫu nam 03 mẫu nữ Độ tuổi trung bình người tham gia nghiên cứu khoảng 33,50 tuổi (tuổi từ 24 - 58) Kết phân lập tế bào đơn nhân trung bình ml dịch tủy 31,00  12,83 (× 106 ) tế bào/ml Nồng độ tế bào có nhân biến thiên lớn từ 10 – 160 × 106 tế bào/ml dịch tủy xương Mặc dù thể tích dịch tủy xương thu nhận để phân lập tế bào đơn nhân tương đối thấp (trung bình 2,00 ml dịch tủy xương) mật độ tế bào đơn nhân thu nhận cao Mật độ tế bào đơn nhân có ý nghĩa trình nuôi cấy nhân khối thu nhiều tế bào đơn nhân hội phân lập TBG trung mô cao Kết nuôi cấy nhân khối đạt kết tốt Hơn nữa, mật độ tế bào đơn nhân thu có liên quan mật thiết với số CFU-Fs thu trình nuôi cấy Số CFU-Fs trung bình 87,00  11,30 (CFU-Fs) Kết đánh giá số CFU-Fs tương đối cao 3.1.2 Kết nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người Sau ngày nuôi cấy, chai nuôi bắt đầu xuất tế bào đơn lẻ, nằm rải rác, có dạng hình thoi, thon dài giống với hình thái nguyên bào sợi Sau ngày nuôi cấy, bắt đầu xuất cụm tế bào có đặc tính bám dính vào đáy chai nuôi Các cụm tế bào phát triển từ tế bào đơn lẻ bám dính vào chai nuôi trước Những tế bào trì đặc điểm hình thái giống với tế bào gốc trung mô hình thoi, thon dài, tăng trưởng phát triển mạnh A B C Hình 3.1 Kết nuôi cấy tế bào từ tủy xương người (A) Tế bào sau ngày nuôi cấy (×10) (B) Tế bào sau ngày nuôi cấy (×10) (C) Tế bào sau tuần nuôi cấy, tế bào từ cụm tăng trưởng mạnh lan tỏa xung Với kết khảo sát Flow Cytometry theo tiêu chí ISCT quần thể tế bào nghiên cứu thỏa mãn tiêu chí đề với biểu marker phù hợp cho dòng TBG trung mô, đặc biệt biểu marker CD73, CD90 CD105 Thứ ba, dựa vào khả biệt hóa tế bào Mẫu tế bào tiến hành biệt hóa thành tế bào mỡ, nguyên bào xương nguyên bào sụn Sau biệt hóa tế bào gốc thu từ tủy xương thành dòng tế bào khác, tế bào đánh giá cách sử dụng phương pháp theo tiêu chí ISCT sử dụng phương pháp nhuộm để đánh giá kết biệt hóa tế bào thành tế bào mỡ, tế bào xương tế bào sụn điều kiện in vitro Kết nghiên cứu cho thấy tế bào hoàn toàn biệt hóa thành nguyên bào xương, tế bào sụn tế bào mỡ điều kiện in vitro Như vậy, dựa theo tiêu chí ISCT thu nhận TBG trung mô từ tủy xương Đó tế bào có đặc tính bám dính vào chai nuôi, tế bào biểu marker thiết yếu để định danh TBG trung mô CD73, CD90 CD105 với phần trăm dương tính cao ( 95%); cuối tế bào có tiềm biệt hóa thành dòng tế bào mỡ, xương sụn điều kiện nuôi cấy in vitro điều kiện nuôi cấy cảm ứng phù hợp 3.1.4 Định danh nguyên bào xương Trong trình nguyên cứu, đánh giá trình biệt hóa TBG trung mô thành nguyên bào xương điều kiện nuôi cấy in vitro Tùy theo giai đoạn biệt hóa mà TBG trung mô cảm ứng biệt hóa thành nguyên bào xương biểu gien khác Theo đó, từ lúc TBG trung mô cảm ứng biệt hóa tăng trưởng biệt hóa thành tế bào tiền thân tạo xương phát triển thành tiền nguyên bào xương Tại thời điểm chúng biểu gien Runx2 Osterix Tiếp theo giai đoạn biệt hóa phát triển, tiền nguyên bào xương biệt hóa thành nguyên bào xương sớm, thời điểm hoạt tính enzyme alkaline phosphatase mạnh (đây xem maker sớm dùng để định danh nguyên bào xương trình nuôi cấy in vitro) B A Hình 3.3 Kết đánh giá biểu alkaline phosphatase (A) Nhóm chứng nghiên cứu TBG trung mô không biệt hóa (×20) (B) Kết nhuộm cho thấy hoạt tính Alkaline phosphatase biểu mạnh, tế bào họat động, biểu enzyme Alkaline Phosphatase có màu hồng đậm bào tương Sau đó, nguyên bào xương sớm tiếp tục phát triển thành nguyên bào xương muộn, thời điểm chúng biểu mạnh gien osteocalcin Cuối nguyên bào xương phát triển thành nguyên bào xương trưởng thành, thời điểm này, nguyên bào xương biểu mạnh gien Osteopontin 3.1.5 Đánh giá tính toàn vẹn tế bào qua nhiễm sắc thể đồ Để sử dụng dòng tế bào trải qua trình nuôi cấy in vitro vào ứng dụng lâm sàng người tế bào cần phải kiểm soát đánh giá cách nghiêm ngặt Một phương pháp phổ biến để đánh giá tính toàn vẹn tế bào qua nuôi cấy khảo sát nhiễm sắc thể đồ tế bào, kỹ thuật đánh giá số tiêu chí quan trọng biến đổi xảy bất thường nhiễm sắc thể mặt số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể, giúp cho nhà nghiên cứu đánh giá dòng tế bào nuôi cấy để đảm bảo an toàn hiệu triển khai ứng dụng lâm sàng 11 Trong trình nuôi cấy TBG trung mô nguyên bào xương, thực mẫu tế bào để đánh giá tính toàn vẹn NST TBG trung mô nguyên bào xương sau biệt hóa từ TBG trung mô chọn để đánh giá (hình 3.4) A B Hình 3.4 Khảo sát nhiễm sắc thể đồ tế bào trước sau biệt hóa thành nguyên bào xương (A) Nhiễm sắc thể đồ tế bào gốc trung mô (B) Nhiễm sắc thể đồ nguyên bào xương Nhìn chung, hai NST tế bào qua trình nuôi cấy chưa cho thấy bất thường số lượng NST, hai NST có số lượng ổn định Từ NST đồ cho thấy, hai dòng tế bào (TBG trung mô nguyên bào xương) có số lượng NST ổn định (46 NST), chưa thấy biến đổi bất thường cấu trúc NST Tuy nhiên, việc thực NST đồ có hạn chế không phát vi đột biến mặt cấu trúc NST (