TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƢỜNG CHUẨN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời động vật HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Bích Ngọc tận tình hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ em trình nghiên cứu Sự hiểu biết sâu sắc khoa học nhƣ kinh nghiệm cô tiền đề giúp em đạt đƣợc kết Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN, thầy cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, tận tình giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi thời gian em học tập làm nghiên cứu Trƣờng Đây bƣớc nghiên cứu sáng tạo khoa học, kinh nghiệm em nhiều hạn chế bỡ ngỡ Do đó, không tránh khỏi thiếu sót nên em mong nhận đƣợc đóng góp quý báu quý thầy cô bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp em đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2017 SINH VIÊN Nguyễn Thị Lan Anh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài thực Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực, không trùng lặp với công trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2017 SINH VIÊN Nguyễn Thị Lan Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Vật liệu phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học 5.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan cellulose vi khuẩn (CVK) 1.1.1 Phân loại đặc điểm hình thái A xylinum 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa A xylinum 1.1.3 Một vài đặc điểm màng CVK 1.1.3.1 Cấu trúc CVK 1.1.3.2 Đặc tính màng CVK 1.1.3.3 Ứng dụng CVK 1.2 Thuốc berberin 1.2.1 Cấu trúc 1.2.2 Nguồn gốc 1.2.3 Tính chất vật lý hóa học 1.2.4 Tác dụng dƣợc lý ứng dụng 1.2.5 Chỉ định chống định thuốc BH 1.2.6 Tƣơng tác thuốc 1.3 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 1.3.1 Trên giới 1.3.2 Ở Việt Nam 10 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Vật liệu nghiên cứu 12 2.1.1 Giống vi khuẩn 12 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 12 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 12 2.1.4 Môi trƣờng tạo màng CVK 12 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phƣơng pháp lên men thu màng CVK từ môi trƣờng chuẩn 13 2.2.2 Phƣơng pháp xử lý màng CVK trƣớc hấp thụ thuốc 13 2.2.3 Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết màng CVK 14 2.2.4 Phƣơng pháp xác định đƣờng chuẩn 15 2.2.5 Phƣơng pháp xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng CVK 16 2.2.6 Phƣơng pháp xử lý thống kê 17 2.3 Địa điểm nghiên cứu 17 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Màng CVK thu đƣợc nuôi cấy môi trƣờng chuẩn 18 3.2 Màng CVK thu đƣợc sau nuôi cấy 19 3.3 Quá trình xử lý màng CVK trƣớc hấp thụ 20 3.4 Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK 22 3.5 Màng CVK hấp thụ thuốc BH 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 Kết luận 28 Kiến nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên dầy đủ Từ viết tắt A xylinum Acetobacter xylinum BH Berberin hydrochlorid C Nồng độ Cs Cộng CVK Cenllulose vi khuẩn E coli Escherichia coli Et al An other h Giờ OD Optical Density UV - vis Ultraviolet visible DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Môi trƣờng tạo màng CVK 13 Bảng 2.2 Giá trị mật độ quang (OD) dung dịch BH nồng độ (mg/ml) khác (n = 3) 15 Bảng 3.1 Giá trị OD dung dịch BH 10% ngâm màng CVK (n = 3) 24 Bảng 3.2 Lƣợng thuốc hấp thụ BH qua màng CVK (n=3) 26 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học CVK Hình 1.2 Công thức cấu tạo BH Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận CVK 14 Hình 2.2 Phƣơng trình đƣờng chuẩn BH 16 Hình 3.1 Màng CVK nuôi cấy môi trƣờng chuẩn 19 Hình 3.2 Màng CVK độ dày khác 20 Hình 3.3 Màng CVK thô 20 Hình 3.4 Màng CVK thô đƣợc ngâm NaOH 3% 21 Hình 3.5 Màng CVK ngâm HCl 3% 21 Hình 3.6 Màng CVK ngâm nƣớc 22 Hình 3.7 Kết thử diện đƣờng glucose 23 Hình 3.8 Màng CVK hấp thụ thuốc berberin 24 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Cellulose vi khuẩn (viết tắt CVK) sản phẩm loài vi khuẩn, đặc biệt chủng Acetobacter xylinum Màng sinh học (CVK) có cấu trúc đặc tính giống với cellulose thực vật (gồm phân tử glucose liên kết với liên kết β-1,4 glucozit) [4] Trên giới, màng CVK đƣợc ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho pin lƣợng cho tế bào, làm môi trƣờng chất sinh học, thực phẩm hay thay thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc nhiều ứng dụng khác [18] Trong lĩnh vực y học, màng CVK đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay da trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho ngƣời [10, 18] Amin et al [15] báo cáo việc sử dụng màng CVK làm màng bọc cho paracetamol cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết cho thấy màng CVK có khả giữ thuốc giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu sử dụng thuốc Ở Việt Nam việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK đƣợc quan tâm gần đạt đƣợc kết bƣớc đầu Đề tài Nguyễn Văn Thanh – Đại học Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh 2006 [5] “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum” Theo kết nghiên cứu cho thấy màng CVK đƣợc tạo nên từ nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, sản xuất quy mô công nghiệp Về mặt tính chất, CVK có độ tinh lớn nhiều so với loại cellulose khác, phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn Ngoài CVK có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lƣợng thấp, khả thấm hút lớn, đƣờng kính sợi nhỏ, chứa nhiều dƣỡng chất [13] Đồng thời hàng rào cản oxi sinh vật khác, ngăn cản phân hủy chất tế bào ngăn cản tác động UV, ổn định kích thƣớc hƣớng, màng CVK có ý nghĩa giữ thuốc giải phóng thuốc kéo dài [14, 20], có tiềm cao cho ứng dụng hệ thống vận chuyển thuốc, cho thẩm thấu qua da, qua đƣờng miệng mô kỹ thuật, số ứng dụng y sinh học khác,… Berberin hydrocholoride (BH) đƣợc biết đến nhƣ chất kháng khuẩn tự nhiên việc điều trị bệnh lí nhƣ tiêu chảy, viêm đƣờng tiêu hóa vi khuẩn tả, E coli, amip đƣờng ruột [21] Theo vài nghiên cứu gần đây, BH có tác dụng tốt việc điều trị số bệnh mãn tính nhƣ tiểu đƣờng, viêm khớp, hạ lipid, choresterol máu, đặc biệt bệnh viêm đại tràng BH sở hữu tính chất dƣợc khác bao gồm tác dụng chống ung thƣ [21] Tuy nhiên thuốc có tác dụng phụ khó tan nƣớc làm giảm khả hấp thụ thuốc Trong trình sử dụng bị tác nhân khác gây ảnh hƣởng làm giảm hiệu hấp thụ [21] Nhờ đặc tính độc đáo mà CVK giúp giúp thuốc trì hiệu thời gian chữa bệnh, tăng khả phân phối thuốc có kiểm soát, tăng thời gian tồn thuốc đƣờng ruột Cách tiếp cận đƣợc sử dụng để tăng cƣờng khả dụng sinh học qua đƣờng uống qua da Với mục đích nghiên cứu khả hấp thụ thuốc màng CVK để khắc phục tác dụng phụ thuốc, chọn đề tài: “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc berberin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn” Mục đích nghiên cứu Tìm hiểu khả hấp thụ thuốc màng để tìm trƣờng hợp hấp thụ thuốc nhiều nhằm tăng sinh khả dụng, hiệu thuốc hình 3.7 Hình 3.7 Kết thử diện đƣờng glucose Mẫu thử 1: màng 0,3cm Mẫu thử 2: màng 0,5cm Mẫu thử 3: màng 0,7cm 3.5 Màng CVK hấp thụ thuốc BH Màng CVK sau đƣợc tinh chế đƣợc đem loại bỏ nƣớc 70%, sau cho màng CVK loại nƣớc vào bình chứa 100 ml dung dịch berberin 10%, đặt bình vào máy lắc 180 vòng/phút nhiệt độ phòng tiến hành lấy mẫu 1h; 1,5h 2h Vì màng CVK có khả hút nƣớc giữ nƣớc cao nên sau đƣa màng ép vào bình tam giác để nạp thuốc thuốc dễ dàng hấp thụ vào màng Lúc nồng độ thuốc bên màng lớn bên màng nên thuốc theo chiều từ vào 23 Hình 3.8 Màng CVK hấp thụ thuốc berberin Sau ngâm màng CVK dung dịch BH khoảng thời gian lần lƣợt giờ, 1,5 lấy dung dịch đo quang phổ UV 2450 để xác định lƣợng thuốc hấp thụ vào màng Kết đo quang phổ CVK đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.1 Bảng 3.1 Giá trị OD dung dịch BH 10% ngâm màng CVK (n = 3) Độ dày màng Thời gian hấp Giá trị OD 345nm dung dich (cm) thụ (giờ) BH 10% 0,669 ± 0,002 1,5 0,6545 ± 0,0003 0,6541 ± 0,00014 0,672 ± 0,005 1,5 0,6585 ± 0,0005 0,6579 ± 0,008 0,676 ± 0,0012 1,5 0,6591 ± 0,00012 0,659 ± 0,004 0,3 0,5 0,7 24 Từ bảng 3.1 ta thấy, màng CVK hấp thụ thuốc, giá trị OD trung bình thuốc giảm dần sau không đổi ba độ dày Có thể sau khoảng thời gian giờ; 1,5 giờ; lƣợng thuốc BH hấp thụ vào màng CVK tăng dần đạt cực đại So sánh giá trị OD trung bình khoảng thời gian 1,5 với màng 0,3cm việc sử dụng hàm t – Test: Two Sample Assuming Unequal Variances, kết khác biệt khả hấp thụ thuốc khoảng thời gian với màng 0,3cm, P = 0,063 (T 0,05 Nên giá trị OD trung bình khoảng thời gian khác ý nghĩa thống kê Tƣơng tự với màng 0,5cm màng 0,7cm, tiến hành so sánh giá trị OD (y) trung bình màng 0,5cm có giá trị P = 0,454(T 0,05, giá trị OD màng 0,7cm P = 0,484(T 0,05 Nên giá trị OD trung bình khoảng thời gian 1,5 không khác có ý nghĩa thống kê Nhƣ giá trị OD (y) trung bình không thay đổi cho màng CVK hấp thụ thuốc từ 1,5 đến độ dày màng Tức lƣợng thuốc BH hấp thụ vào màng CVK đạt cực đại Theo công thức (2), (3) dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn (1) ta tính đƣợc khối lƣợng tỷ lệ thuốc BH hấp thụ vào màng CVK nhƣ bảng 3.1 25 Bảng 3.2 Lƣợng thuốc hấp thụ BH qua màng CVK (n=3) Độ dày màng (cm) 0,3 Thời gian hấp thụ cực đại (giờ) Khối lƣợng Thể tích thuốc đƣợc màng hấp thụ (mg) (cm3) 1,189 ± 0,0003 3,768 Cƣờng độ hấp thụ màng EE (%) (mg/cm3) 0,316 ± 0,01 11,894 ± 0,0013 0,5 0,7 2 1,138 ± 0,0016 6,28 1,123 ± 0,0023 8,792 0,181 ± 11,376 ± 0,001 0,0006 0,128 ± 11,226 ± 0,0011 0,0008 Nhận xét: Qua bảng 3.2 thấy: Sau màng CVK có độ dày 0,3cm có cƣờng độ hấp thụ thuốc BH trung bình tốt nhât 0,316mg/cm3, màng CVK có độ dày 0,5cm có cƣờng độ hấp thụ thuốc BH trung bình thấp 0,181mg/cm3 màng CVK có độ dày 0,7cm có cƣờng độ hấp thụ thuốc thấp 0,128mg/cm3 Qua kiểm định giả thuyết t-Test: Two Sample Assuming Equal Variancess màng 0,3cm 0,5cm, thu đƣợc p = 0.000921< 0,05, có nghĩa sai khác cƣờng độ hấp thụ màng có ý nghĩa thống kê Nhƣ màng CVK dày 0,3cm có khả hấp thụ thuốc tốt màng CVK dày 0,5cm Tiếp tục kiểm định giả thuyết t-Test: Two Sample Assuming Equal Variancess màng 0,5cm 0,7cm, thu đƣợc P = 0,000523 < 0,05, có nghĩa sai khác cƣờng độ hấp thụ màng có ý nghĩa thống kê Nhƣ màng CVK dày 0,5cm có khả hấp thụ thuốc tốt màng CVK dày 0,7cm 26 Tƣơng tự với màng 0,3cm 0,7cm, tiến hành kiểm định thu đƣợc P = 0,000477 < 0,05, có nghĩa sai khác cƣờng độ hấp thụ màng có ý nghĩa thống kê Nhƣ màng CVK dày 0,3cm có khả hấp thụ thuốc tốt màng CVK dày 0,7cm màng có cƣờng độ hấp thụ tốt 27 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Tạo đƣợc màng CVK từ vi khuẩn A xylinum môi trƣờng chuẩn: Thu đƣợc màng CVK có độ dày 0,3cm; 0,5cm 0,7cm để tiến hành hấp thụ Màng CVK có độ tinh khiết cao, dai không biến dạng sấy khô nhiệt độ cao thích hợp với nhu cầu làm thí nghiệm Khi hấp thụ thuốc, màng CVK 0,3cm có khả hấp thụ thuốc cao màng CVK 0,5cm 0,7cm Kiến nghị Cần tiến hành khảo sát thêm khả hấp thụ thuốc berberin màng CVK, thay môi trƣờng chuẩn môi trƣờng nhƣ nƣớc dừa già, nƣớc vo gạo,… để mở rộng nguồn tài nguyên Tiếp tục tiến hành khảo sát hấp thụ berberin màng CVK kích thƣớc độ dày khác để tìm đƣợc trƣờng hợp hấp thụ tốt nhằm ứng dụng vào lĩnh vực y học 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bộ Y tế ( 1994) , Dƣợc điển Việt Nam III, Nhà Xuất Bản Y học Hà Nội, trang 33-35, 178-179, phụ lục Bộ môn Dƣợc liệu (2007), Bài giảng dƣợc liệu tập 2, Đại học Dƣợc Hà Nội, tr 102-104 Vũ Bình Dƣơng, Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Thị Thùy, Hoàng Văn Lƣơng Nghiên cứu bào chế viên nén Berberine giải phóng đích đại tràng- Tạp chí Y-Dƣợc học quân sụ 8-2010 Đặng Thị Hồng Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạp màng sinh học (BC) Luận án thạc sỹ Sinh học ĐHSP Hà Nội, 2007 Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí Dược học số 361/2006, trang 18-20 Nguyễn Liêm – Chiết xuất Berberine áp lực nóng – Tạp chí Dƣợc học, 1980, Bộ Y tế xuất bản, tr.10 Đỗ Tất Lợi ( 1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, xuất lần thứ VIII- Nhà xuất Y học, trang 195 Nguyễn Đức Lƣơng (2000), Công nghệ Vi sinh tập 1-2-3, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Phương pháp nghiên cứu sinh lý học Thực vật – Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 10 Nguyễn Thị Nguyệt Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial Cellulose làm mặt nạ dưỡng da Luận án thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2008 11 Nguyễn Văn Thanh Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ 29 Acetobacter xylinum, trang 12 Hồ Đắc Trinh, Viện dƣợc liệu, chiết berberin clorid vàng đắng dung dịch axit sufuric loãng, Tạp chí dƣợc học, 1983-Bộ Y tế xuất bản, tr.19 13 Viện dƣợc liệu (2004), “Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam”, tập I, tập II, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Tài liệu nƣớc 14 Almeida, I.F., et al Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin conpatibility study Eur J Pharm Biopharm.2013, in press 15 Almeida, I.F., et al Màng cellulose vi khuẩn nhƣ hệ thống phân phối thuốc, 2013 16 Ryan Bradley, ND, MPH and Bill Walter, ND, Berberine in Diabetes, April 2012 17 Brown.E.Bacterial cellulose/Themoplastic polymer nanocomposites Master of sience in chemical engineering Washington state university, 2007 18 Hai-Peng Cheng, Pei-Ming-Wang, Jech-Wei Chen and Wen-Teng-Wu Cultivation of Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modifided airlift reactor Biotechnol Appl Biochem, 35, 125132.(2002) 19 Dieter klemn, Dieter Schumann, Ulrike Udardt, Silvia Marsch, Becterial synthesized cellulose – artifical blood vessels for microsurgery Vol 26, Inssue 9, Progress in polymer science, 2001, p.1561-1603 20 Lina Fu, Yue Zhang, Chao li, Zhihong Wu, Qi Zhuo, Xia Huang, Guixing Qui, Ping Zhou and Guang Yang skin tissue repair materials from bacterial cenllulose by a multilayer fermantation method, 2012 30 21 Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang (2013), “Yang Nano- cellulose 3D- networks as controlledrelease drug carriers”,1(23), 2976-84 22 Zhou L, Yang Y, Wang X, et al “ Berberine stimulates glucose transport through a mechanism distinct from insulin” Metabolism 2007;56:405–12 23 Martindal 34 (2005), volume II, p.1659 24 Nguyen T X et al (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 7149 – 7159 25 Zhou-Xi-Qiao et al (2008), “Neuroprotective effects of berberine on stroke modes in vitro and vivo”, Neuroscience Letters, 447, pp 31-36 26 Jonas R and Farah L F (1998), “Production and application of microbial cellulose”, Polym Gegrad Stab., 59, 101 – 106 27 Czaja W K., Young D J., Kawecki, M & Brown Jr, R M 2007 “ The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications” Biomacromolecules 8(1), – 12 28 Wan, Y Z., Luo, H., He, F., Liang, H., Huang, Y., & Li, X L 2009 “Mechanical, moisture absorption, and biodegradation behaviours of bacterial cellulose fibre - reinforced starch biocomposites”, Composites Science and Technology 69(7 – 8), 1212 – 1217 29 Kong Wei-Jia et al (2008), “Combination of simvastatin with berberin improves the efficacy”, Metabolism lipid-lowering Clinical and Experimental, 57, pp 1029-1037 30 Jun Yin, Jianping Ye, Weiping Jia Effects and mechanisms of Berberine in diabetes treatment, August 2012 31 PHỤ LỤC Bảng So sánh giá trị OD (y) trung bình thuốc BH khoảng thời gian 1,5 độ dày màng 0,3cm t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances 1,5 Mean 0,6545 0,6541 1,96E- Variance 9E-08 08 Observations 3 Hypothesized Mean Difference df t Stat 2,092740319 P(T