Sản xuất kháng sinh

107 154 1
  • Loading ...
1/107 trang
Tải xuống

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 06/09/2017, 10:05

SẢN XUẤT KHÁNG SINH Mục tiêu Nắm qui trình chung sản xuất kháng sinh Xây dựng qui trình sản xuất benzylpenicillin Mở rộng triển khai qui trình sản xuất số kháng sinh khác Kháng sinh – Lịch sử phát triển ™ 1889: khái niệm kháng sinh đời (Paul Vuilemin) ™ 1940s: định nghĩa kháng sinh “là chất hóa học có nguồn gốc vi sinh vật có khả ức chế hay diệt vi sinh vật khác” (Waksman) Kháng sinh – Lịch sử phát triển Kháng sinh chất chuyển hóa thứ cấp: ™ Công thức hóa học khác với chất chuyển hóa sơ cấp ™ Sản xuất với số lượng ™ Không cần thiết cho trình tăng trưởng sinh vật Kháng sinh – Lịch sử phát triển 1928: phát nấm mốc xanh Penicillium có khả ức chế phát triển vi khuẩn Alexander Fleming ~ 1940: phát chủng Penicillium có khả sản xuất penicillin với số lượng lớn Howard Walter Florey Kháng sinh – Lịch sử phát triển 1944: phát streptomycin từ xạ khuẩn Streptomyces Selman Waksman Một số kháng sinh khác: ¾ Actinomycin, neomycin, streptothricin từ Streptomyces ¾ Polymyxin, chloramphenicol, tetracyclin, ¾ Từ 1970, kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp Kháng sinh – Thị trường phát triển ™ 1994: 18 tỉ USD 28%/ 02 năm ™ 1996: 23 tỉ USD ™ 1995: tỉ USD / thị trường Mỹ: ƒ Cephalosprin – 45% ƒ Penicillin – 15% ƒ Quinolon – 11% ƒ Tetracyclin – 6% ƒ Macrolide – 5% Kháng sinh – Thị trường phát triển ™ 1994: 11.900 kháng sinh tìm thấy ƒ 55% (6.600): từ Streptomyces spp ƒ 22% (2.600): từ nấm sợi ƒ 12% (1.400): từ non-actinomyces ƒ 11% (1.300): non-Streptomyces Trong đó, 160 kháng sinh dùng lâm sàng Kháng sinh – Thị trường phát triển 252 hoạt chất dùng lâm sàng nông nghiệp: ™ 30% (75 chất): hợp chất tự nhiên ™ 30% (75 chất): bán tổng hợp từ hợp chất tự nhiên ™ 40%: tổng hợp hóa học Chọn giống, giữ giống lên men Chọn chủng S erythaea suất cao: - Chọn chủng từ ống thạch nghiêng, đông khô hay huyền phù bào tử - Nuôi cấy 30 ml môi trường lỏng V1 - Sau 48 h, pha loãng trải môi trường M1 hay CMAE-1 để thu khuẩn lạc riêng rẽ Chọn giống, giữ giống lên men Chọn chủng S erythaea suất cao: - Sau 10-14 ngày ủ 34 oC, khuẩn lạc mọc: • Giống • Đường kính ~ mm • Màu xám hồng, mặt màu nâu đậm • Chọn khuẩn lạc có hình thái khóm khác cấy ống thạch nghiêng Chọn giống, giữ giống lên men Giữ giống S erythaea: - Ống thạch nghiêng: • Ủ 10-14 ngày 34 oC • Bảo quản oC tháng - Huyền phù bào tử: • Thêm ml nước vô trùng vào ống thạch nghiêng • Thêm 20% glycerol • Phân nhỏ thành ống 1,5 ml • Bảo quản -80 oC năm Chọn giống, giữ giống lên men Kiểm tra khả sản xuất erythromycin: - ml huyền phù bào tử pha 1,5 ml huyền phù bào tử đông khô + 30 ml môi trường V1 Ủ 40 34 oC máy lắc - Lấy ml dịch nuôi cấy + 27 ml môi trường F1, nuôi ngày bổ sung: • Ngày 0-6: dầu đậu nành, 0,2 ml/ngày • Ngày 0-5: n-propanol, 0,1 ml/ngày • Ngày 6-9: n-propanol, 0,15 ml/ngày Chọn giống, giữ giống lên men Kiểm tra khả sản xuất erythromycin: - Cân bình bổ sung lượng nước bay hàng ngày - Lấy mẫu, lọc định lượng erythromycin - Chọn chủng tốt để đông khô Chọn giống, giữ giống lên men Lên men: - Giai đoạn 1: nuôi cấy giống 35 ml MT V1 - Giai đoạn 2: sau 48 giờ: • Cấy vào 3,5 l môi trường V2 • Tốc độ thông khí 0,6 vvm • Nhiệt độ 34 oC Æ Theo dõi lượng oxy hòa tan, pH, trình oxy hóa khử, nồng độ khí thải CO2 Æ Theo dõi tăng trưởng: ly tâm đo thể tích hệ sợi cân sinh khối Chọn giống, giữ giống lên men Lên men: - Giai đoạn 3: sau ~ 40 giờ, chuyển 1,5 l dịch nuôi cấy vào bình lên men 20 l chứa 10 l môi trường F1 • Nhiệt độ 34 oC • Chỉnh pH ≤ 7,2 H2SO4 • Tốc độ khuấy 700 vòng/phút • Tốc độ thông khí 0,37 vvm 12 đầu, sau tăng lên 0,83 vvm • Duy trì dinh dưỡng: dầu đậu nành, n-propanol, dextrin Chọn giống, giữ giống lên men Lên men: - Giai đoạn 3: Æ Theo dõi trình oxy hóa khử, nồng độ khí thải CO2, glucose tự Æ Hàng ngày lấy 50-100 ml dịch nuôi cấy để định lượng erythromycin Æ Soi kính hiển vi để kiểm tra ngoại nhiễm hình thái VSV Chiết tách erythromycin Tách erythromycin gồm bước chính: Tách erythromycin-isothiocyanat Tạo erythromycin base Kiểm tra độ tinh khiết hoạt tính erythromycin Chiết tách erythromycin Tách erythromycin-isothiocyanat - Chỉnh pH 8,5 NaOH 20% - Ly tâm với vận tốc 3.000 g oC để loại bỏ sinh khối Dịch tiếp tục lọc sợi thủy tinh - Chỉnh pH 9,5 ± 0,1 - Thêm 1,5% methylisobutylketon khuấy 10 phút oC - Ly tâm với vận tốc 2.000 g phút - Thu pha hữu định lượng erythromycin HPLC Chiết tách erythromycin Tách erythromycin-isothiocyanat - Đun pha hữu đến 30 oC, thêm 0,63 l dung dịch Na isothiocyanat 33% cho gam erythromycin - Chỉnh pH 5,8 acid acetic 10% - Làm nguội hỗn hợp đến 10 oC, ủ khuấy nhẹ để kết tinh erythromycin, trì pH 5,8 - Lọc rửa tủa nước cất - Sấy chân không 50 oC - Hiệu suất giai đoạn khoảng 83% Chiết tách erythromycin Tạo erythromycin base - Hòa tan cách khuấy nhẹ erythromycin – isothiocyanat dichloromethan 33 oC, chỉnh pH 9,5-10 NaOH 15% - Lọc huyền dịch với chất trợ lọc, than hoạt Rửa lại lượng nhỏ dichloromethan - Tách pha hữu (dịch lọc) với nước khử ion 33 oC, khuấy nhẹ - Cô quay dịch chiết để tăng nồng độ erythromycin Æ dễ dàng kết tinh Chiết tách erythromycin Tạo erythromycin base - Kết tinh erythromycin oC 3-5 - Phục hồi erythromycin ly tâm hay lọc, rửa lại dichloromethan, sấy khô 50 oC - Hòa tan erythromycin base thô nước khử ion đun 50-60 oC - Thêm lauryl sulfat Ly tâm hay lọc, rửa với nước khử ion (60 oC) để thu erythromycin base tinh khiết - Erythromycin base chuyển thành dạng ester, muối hay dẫn chất bán tổng hợp Chiết tách erythromycin Thử hoạt tính sinh học độ tinh khiết Thử hoạt tính sinh học eruthromycin phương pháp sinh học thực song song với erythromycin chuẩn, gồm bước: - Đổ 35 ml môi trường TSB vào hộp petri (12x12 cm) - Khi môi trường đông đặc, thêm lớp thứ hai gồm 35 ml TSB 35 μl dịch nuôi cấy Micrococcus luteus ( nuôi 18 giờ, 30 oC môi trường LB) Chiết tách erythromycin Thử hoạt tính sinh học độ tinh khiết - Nhỏ 10 μl phần dịch nuôi cấy (hoặc dạng hòa tan methanol) lên đĩa thử kháng sinh đặt bề mặt hộp thạch Ủ 30 oC 48 giờ, đo vùng ức chế tăng trưởng M luteus tính lượng erythromycin dựa vào đường cong chuẩn - Thử độ tinh khiết HPLC: định lượng erythromycin A, B, C ... học Sản xuất kháng sinh – Các giai đoạn Sản xuất Chiết tách Tinh chế Đóng gói Sản xuất kháng sinh – Giai đoạn lên men Nguyên liệu thô Vi sinh vật Quá trình lên men Kháng sinh Sản xuất kháng sinh. ..SẢN XUẤT KHÁNG SINH Mục tiêu Nắm qui trình chung sản xuất kháng sinh Xây dựng qui trình sản xuất benzylpenicillin Mở rộng triển khai qui trình sản xuất số kháng sinh khác Kháng sinh –... phối đến nơi sử dụng Sản xuất kháng sinh Toàn trình sản xuất kháng sinh: lên men, phục hồi xử lý hoàn thành – ngày Sản xuất kháng sinh – Kiểm soát chất lượng Sản xuất kháng sinh Môi trường Trang
- Xem thêm -

Xem thêm: Sản xuất kháng sinh , Sản xuất kháng sinh , Sản xuất kháng sinh

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay