BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CNSH-KTMT MƠN: KỸ THUẬT CÁC Q TRÌNH SINH HỌC      TIỂU LUẬN: TÍNH TỐN, THIẾT KẾ BỂ PHẢN ỨNG SẢN XUẤT PROTEASE KIỀM TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS VỚI CÔNG SUẤT 200 TẤN/NĂM GVHD: THS NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI TP HCM – năm 2017 Thiết kế bể phản ứng TÍNH TỐN, THIẾT KẾ BỂ PHẢN ỨNG SẢN XUẤT PROTEASE KIỀM TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS VỚI CÔNG SUẤT 200 TẤN/NĂM TÓM TẮT Trong nhiều năm qua, protease có tầm quan trọng đáng kể thị trường giới Trong số proteases, protease vi khuẩn có ý nghĩa quan trọng protease động vật nấm Sản xuất protease kiềm từ Bacillus licheniformis nghiên cứu mô tả rõ ràng Dựa nghiên cứu nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành thiết kế bể phản ứng sinh học để tiến hành sản xuất protease kiềm từ Bacillus licheniformis với công suất (nhà máy) 200 tấn/năm Tiến hành lên men hiếu khí bể lên men chìm có cánh khuấy Với thể tích bể 200 m , chiều cao đường kính bể tương ứng 13,2 m 4,4 m Sự đảo trộn bể cần thiết thực cánh khuấy trục với đường kính 1,76 m, chiều dài trục khuấy 11,44 m 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tổng quan Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis loại vi khuẩn thường tìm thấy đất lơng chim Là loại vi khuẩn gram dương, hình que, ưa nhiệt Nhiệt độ tăng o trưởng tối ưu khoảng 30°C Nhiệt độ tối ưu để sản sinh enzyme 37 C Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nghèo dinh dưỡng, đặc biệt đất, có khả tạo bào tử Các nội bào tử Bacillus kháng nhiều tế bào thực vật với nhiệt, khô hạn, làm khô, chất diệt khuẩn, tác nhân phá hủy khác tồn nhiều kỷ Dưới điều kiện tốt, bào tử nảy mầm trở thành tế bào vi khuẩn thể hoạt động B licheniformis có khả sản sinh nhiều enzyme, đặc biệt amylase protease ngoại bào Enzyme phân hủy chất carbonhydrate, chất béo đạm thành đơn vị nhỏ Chúng có khả phân hủy chất phế thải hữu cơ, tích lũy đáy ao ni, làm nước B licheniformis có tác dụng làm giảm COD, H2S ao tơm làm tăng suất ni Ngồi ra, B licheniformis góp phần ổn định hệ vi khuẩn có ích cho đường ruột, có khả tổng hợp số chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sinh trưởng ưu tiêu diệt số vi sinh vật khác, tác dụng lên vi khuẩn gram âm lẫn gram dương, nấm gây bệnh Do đó, B licheniformis có khả cạnh tranh tốt với vi khuẩn gây hại khác Nó cịn giúp cải thiện trọng lượng, chuyển hóa thức ăn giảm bệnh tiêu chảy, tỉ lệ chết non vật nuôi 1.2 Ezyme protease kiềm Proteases enzyme phá vỡ liên kết peptit axit amin protein Chúng gọi enzyme proteolytic Điều quan trọng việc tiêu hóa enzyme phân hủy protein phức tạp thành axit amin đơn giản Protein kiềm sản xuất loạt vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm mốc nấm men, actinomycetes vv Proteases có nhóm, protease serine, protease threonine, Protease cysteine, protease aspartate, kỹ thuật tổng hợp kim Trong vi khuẩn, enzym protease sản xuất chủ yếu Bacillus licheniformis, B.horikoshii, B.sphaericus, B furmis, B alcalophilus, B Subtilis Protease kiềm Bacillus licheniformis có đẳng điện 11, khối lượng phân tử 20.000 – 30.000 dalton Ổn định khoảng pH 6-12 hoạt động khoảng pH rộng 7-12 Protease sử dụng nhiều lĩnh vực :  Ngành công nghiệp thực phẩm: Protease enzyme sử dụng rộng rãi làm mềm thịt, tăng hương vị cho thịt, sản xuất nước tương, phomat,  Y học: chế phẩm có chứa protease dùng để chữa bệnh tắc nghẽn động mạch biên, chữa bệnh khó tiêu hóa, chữa bệnh ngồi da,…  Ngành công nghiệp dệt may: protease dùng để làm tơ tằm , tẩy tơ nhân tạo để đánh bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp serisin làm bết dính các sợi tơ tự nhiên làm bong tách rời sợi tơ tằm, làm giảm hóa chất để tẩy trắng  Ngành công nghiệp da: chất quan trọng da collagen, tác dụng protease, chất nhờn tách , số liên kết sợi collagen bị phá hủy Kết da thu có độ mềm định Enzyme se tách cá chất nhờn làm đứt số liên kết phân tử collagen làm cho da mềm hơn, loại bỏ khỏi da chất nhớt làm cho da có độ mềm dẻo định Chất tẩy rửa: protease có tác dụng tẩy rửa vết bẩn máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu,… có hoạt tính dung dịch lọc Enzyme có tác dụng sau chất tẩy rửa: Thiết kế bể phản ứng     2.1 Giúp tăng hiệu việc giặt tẩy Giảm thời gian giặt nhờ khả phân hủy vết bẩn nhanh Giảm lượng nước tiêu thụ hiệu giặt rửa cao Giảm ảnh hưởng mơi trường enzyme chất phân hủy sinh học VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Môi trường nuôi cấy Nồng độ thành phần mơi trường thực quan trọng chúng công cụ cho thiết kế môi trường sinh học Môi trường nuôi cấy vi sinh vật với tất yếu tố thiết yếu cho phát triển vi sinh vật Một số vi sinh vật có khả tổng hợp tất thành phần tế bào chúng từ nguồn carbon nitơ Tuy nhiên, hầu hết vi sinh vật cần số lượng vi chất dinh dưỡng (như axit amin, nguyên tố vi lượng, vitamin, vv) Các điều kiện nuôi cấy để thúc đẩy sản xuất enzyme proteases khác biệt đáng kể so với điều kiện nuôi cấy tăng sinh tế bào Do tối ưu hóa thành phần mơi trường cần thiết để tế bào tăng trưởng tối ưu hình thành sản phẩm 2.1.1 Nguồn Carbon Glucose thường sử dụng trình sinh học để sản xuất protease Nâng cao sản lượng alkaline proteases với có mặt nhiều loại đường lactose, maltose, sucrose fructose Tuy nhiên, thành phần nồng độ cao gây ức chế tổng hợp protease Trong thực tiễn thương mại, nồng độ carbohydrate cao làm giảm hoạt động sản xuất enzyme Do đó, carbohydrate thêm vào liên tục trình lên men để bổ sung thành phần cạn kiệt giữ cho khối lượng mức ổn định Whey, phụ phẩm thải ngành cơng nghiệp sữa có chứa lactose muối chất tiềm cho việc sản xuất alkaline proteases Tương tự, tiết alkaline proteases cực đại quan sát thấy với có mặt cellulose tinh khiết nguồn carbon Các axit hữu khác acid acetic, axetyl axetat citric acid natri citrate chứng minh làm tăng sản xuất protease pH kiềm 2.1.2 Nguồn nitrogen Hầu hết vi sinh vật sử dụng dạng vơ hữu nitơ cần thiết để sản xuất axit amin, axit nucleic, protein thành phần tế bào khác thành tế bào Akaline protease có chứa 15,6% nitơ sản phẩm phụ thuộc vào sẵn có nguồn carbon nitơ môi trường Các nguồn nitơ phức tạp thường NTH: NHÓM Thiết kế bể phản ứng sử dụng để sản xuất alkaline protease Yêu cầu bổ sung nitơ xác định khác với thể sinh vật Sự tổng hợp enzyme tìm thấy bị ức chế nguồn nitơ chuyển hóa nhanh axit amin nồng độ ion amoni môi trường Tuy nhiên, ức chế hoạt động protease tìm thấy diện muối amoni Sự gia tăng sản xuất protease quan sát thấy có sunfat amoni kali nitrat Tương tự, natri nitrat (0.25%) cho kích thích cho sản xuất alkaline protease Sự thay natri nitrat môi trường với ammonium nitrate làm tăng sản xuất enzyme Ngược lại, số báo cáo chứng minh việc sử dụng nguồn nitơ hữu d n tới sản xuất enzym cao nguồn nitơ vô Bột đậu nành báo cáo nguồn nitơ thích hợp để sản xuất protease Thêm vào đó, cách sử dụng hydrolyzate axit đậu tương thay cho đậu nành thơng thường, tăng lần hoạt tính enzyme Cao chiết bắp (CSL) tìm thấy nguồn nitơ rẻ thích hợp số cơng nhân Ngoài việc phục vụ nguồn nitơ, cao chiết bắp cung cấp số vi chất dinh dưỡng, vitamin yếu tố thúc đẩy tăng trưởng Tryptone casein nguồn cung cấp nitơ tuyệt vời để sản xuất protease Một số hợp chất amin chứng minh có hiệu việc sản xuất enzyme ngoại bào Bacillus sp Tuy nhiên, glycine dường có tác động ức chế lên sản sinh protease Axit Casamino tìm thấy để ức chế sản xuất protease 2.1.3 Ion kim loại muối Các ion kim loại hóa trị hai canxi, coban, đồng, bo, sắt, magiê, mangan, molybden yêu cầu môi trường lên men để sản xuất tối ưu alkaline protease Tuy nhiên, yêu cầu ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn enzyme Kali phosphate sử dụng làm nguồn phosphate hầu hết nghiên cứu Điều cho thấy có tác động đệm mơi trường Phosphate nồng độ g/l tìm thấy tối ưu cho việc sản xuất protease Tuy nhiên, lượng vượt nồng độ cho thấy ức chế phát triển tế bào ức chế trình sản xuất protease Hơn nữa, việc bổ sung muối, natri clorua ion phosphate sử dụng chất gây cảm ứng cho tiết protease Do hoạt động đệm, ion phosphat làm ổn định pH mơi trường lên men (pH homeostasis) mà gián tiếp kích thích việc tổng hợp protease Trước xác lập vi khuẩn sử dụng hệ thống vận chuyển dung mơi có natri để sống sót thích ứng với mơi trường pH cao Cũng có báo cáo phát triển Bacillus sp điều chỉnh gradient natri Do ion natri cần thiết cho trình sinh lý trao đổi chất vi khuẩn độ pH homeostasis tổng hợp ATP NTH: NHÓM Thiết kế bể phản ứng 2.2 Thiết bị lên men Hình 1: Bể phản ứng lên men Phần thiết bị thùng lên men làm thép không gỉ để tránh ăn mịn mạnh muối acid có mơi trường Bề mặt có độ bóng cao, để vi sinh vật khơng có điều kiện thuận tiện để bám lên bề mặt Chiều cao nhấp nhô phải bé 0,6 μm Thùng kín thường hoạt động áp suất lớn áp suất khí để ngăn khơng cho khơng khí xâm nhập, tránh bị lây nhiễm Bên ngồi thùng có lớp áo nước để gia nhiệt, làm nguội điều hòa nhiệt độ cho thùng Để đảm bảo cho thành phần thùng đồng đều, bố trí động kéo cánh khuấy bên thùng Trên trục cánh khuấy thường có phận phá bọt Phía thùng có cấu sục khí với nhiều lỗ nhỏ Ở trường hợp hệ lên men hiếu khí (aerobic fermenter), phun lỗ đơn (single orifice sparger) phun vòng sử dụng để sục khí cho hệ lên men Bộ phận phun đặt vị trí cánh khuấy cuối đáy vessel Độ pH hệ lên men trì cách dùng dung dịch đệm điều chỉnh pH (pH controller) Nhiệt độ điều chỉnh hệ thống gia nhiệt làm lạnh tự động NTH: NHÓM Thiết kế bể phản ứng 2.2.1 Các dịng vật chất: Hình 2: Mơ hình bể phản ứng Thùng lên men có lắp số đường d n để đưa vật chất vào thùng hay khỏi thùng Ta kể dịng sau (các số hiệu tương ứng với số hình 2) 1: Đưa canh trường vào thùng 2: Đưa dưỡng chất & chất vào thùng 3: Đưa dịch lên men khỏi thùng 4: Đưa khí vào thùng 5: Đưa khí khỏi thùng 6: Đưa dung dịch axit hay kiềm vào thùng để điều chỉnh pH cho môi trường lên men 7: Đưa nước hay nước vào thùng để gia nhiệt, làm lạnh hay điều hòa nhiệt độ cho môi trường lên men 8: Đưa nước vào thùng để trùng hay tiệt trùng sau d n nước ngưng khỏi thùng Thơng thường đường ống nối với hệ thống CIP (Clean In Place) hay SIP (Sterilization In Place) 9: Dùng để lấy m u để theo dõi hay kiểm tra M u đưa trở lại thùng lên men hay khơng NTH: NHĨM Thiết kế bể phản ứng 2.2.2 Đo lường thiết bị lên men Để cho q trình lên men ln hoạt động điều kiện tốt nhất, việc đo lường điều khiển thơng số giữ vai trị quan trọng Hình trình bày số cảm biến dụng cụ đo Chức chúng tóm tắt sau : KT: Xác định thành phần khí thoát khỏi thùng, N: Đo vận tốc quay cánh khuấy, V: Đo mức dịch lên men, qua ta xác định thể tích dịch lên men, X: Đo hàm lượng sinh khối khô, T: Đo nhiệt độ môi trường lên men, pH: Đo pH dịch lên men, Oxy: Đo hàm lượng oxy hòa tan dịch lên men, LL: Đo lưu lượng dòng khí vào thùng Thơng thường cảm biến hay dụng cụ sẽ, mặt nối với cấu hiển thị, mặt khác lại nối với cấu điều khiển tương ứng để giữ cho thơng số có liên quan giá trị tốt 3 TÍNH TỐN VÀ KẾT QUẢ 3.1 Công thức Từ thông số tối ưu ta tính tốn, thiết kế bể phản ứng sản xuất protease kiềm từ Bacillus licheniformis với công suất (nhà máy) 200 tấn/năm Áp dụng số công thức sau: - Yp/x = Hoạt lực enzyme = ( HLE ) Khối lượng sinh khối - U đơn vị hoạt lực: U = µg Tyrosine điều kiện phịng thí nghiệm Thời gian làm việc năm - Số mẻ lên men năm = - Thời gian mẻ = Thời gian nuôi cấy + thời gian nghỉ mẻ Các thông số bể thể tích, đường kính, chiều cao bể cánh khuấy tính sau: NTH: NHĨM Thời gian mẻ Thiết kế bể phản ứng Hình 3: Sơ đồ thùng lên men cấu cánh khuấy •Thể tích bể: V= H x       3.2 D Chiều cao bể: H = ( 2-3 ) x D Đường kính cánh khuấy: d = ( 0,3 – 0,5) x D Khoảng cách đáy đầu cánh khuấy: h = (0,5- 1,5 ) d Số cánh khuấy trục tùy thuộc vào chiều cao bể, khoảng cách cánh khuấy xấp xỉ với đường kính cánh khuấy Chiều rộng vách ngăn: b = 0,1 D Số chắn phụ thuộc vào đường kính thùng Các thơng số tối ưu cho trình lên men Nhiều nghiên cứu trước nhà khoa học, tìm điều kiện tối ưu nuôi cấy Bacillus licheniformis cho việc sản xuất protease kiềm tối đa Dựa vào nghiên cứu nhóm chọn số thơng số cho việc thiết kế bể phản ứng sau: - o Nhiệt độ bể giữ 37 C pH 7.7 Kiểu ni cấy: lên men hiếu khí, ni cấy chìm có cánh khuấy Thời gian ni cấy cho mẻ 72h Tốc độ cánh khuấy 200 vịng/phút Tốc độ sục khí 3m/s Nồng độ chất casein 20 g/l Yp/x = 119 U/mg Nồng độ sinh khối sau lên men 25 g/l NTH: NHĨM Thiết kế bể phản ứng 3.3 Tính tốn Với cơng suất 200 tấn/ năm với sản phẩm bán thị trường tập đoàn Alibaba có hoạt lực enzyme 200.000 U/g, tức với g bột enzyme có 200.000 U  Có 200 x 10 x 200.000 = x 10 13 U  HLE = x 10 13 U Hình 4: Chế phẩm enzyme Alkaline protease thương mại Giả sử:  Hiệu suất tồn q trình từ nuôi cấy đến thu nhận enzyme 90 %  Một năm làm việc 330 ngày  Thời gian nghỉ mẻ 10h Ta có: - Số mẻ lên men năm = 330 x 24 = 96,6 mẻ  số mẻ cần thực 97 72+10 mẻ - Lượng hoạt tính mẻ = x 1013 100 x = 4,582 x 10 11 U 97 90 - Yp/x =  Khối lượng sinh khối = HLE = 4,582 × 10 11 = 3,85 x 109 mg 119 / = 3,85 x 10 g NTH: NHÓM 10 Thiết kế bể phản ứng - Thể tích bể phản ứng: V = Khối lượng sinh khối = 3,85 × 10 Nồng độ sinh khối25 = - 154 x 10 L = 154 m Ta có: V = H x D = 154 m 3 Thể tích thực tế bể gồm có phần thể tích bọt thể tích chết bể khoảng 30% thể tích theo lý thuyết bể -  Vthực tế = 154 + 154 x 0,3 200 m3 H = 3x D  3D x D2 = 200  D = 4,4 m  H = x 4,4 = 13,2 m Đường kính cánh khuấy: d = 0,4 D = 0,4 x 4,4 = 1,76 m Khoảng cách đáy đầu cánh khuấy: h = d = 1,76 m Chiều dài trục cánh khuấy: 13,2 – 1,76 = 11,44 m Số lượng cành khuấy trục Chiều rộng chắn: b = 0,1 D = 0,1 x 4,4 = 0,44 m Số chắn Tính tốc độ truyền oxi * - Col : nồng độ oxi bão hòa - Cols : nồng độ oxi hòa tan thời điểm KtA :khối lượng oxi lỏng chuyển hóa OTR (oxygen transfer rate) :tốc độ truyền oxi Ta có cơng thức: * OTR = KtA ( Col - Cols) - - - i * -3 Dựa vào tài liệu , giá trị Col áp suất bar 0,27 mol m -3 c -1 Lựa chọn Ps / Vt = 2000 W m v gs = 0,03 m s , giá trị KtA tính sau: -2 0,4 c 0.5 -1 KtA = 2,6.10 (Ps/Vt) (vgs ) = 0,094 s Nồng độ oxi thời điểm nhỏ nồng độ bão hòa oxi, nằm -3 -3 -1 khoảng số mũ lũy thừa 0.1 mol m 0.01 mol m s , t chọn giá trị -3 0,1 mol m Vậy tốc độ truyền oxi : -3 -1 OTR = 0,094 (0,27-0,1) =0,01598 mol m s Tính tốc độ sử dụng oxi tế bào Yx/o - -1 YX/O Average specific cell yeil on oxygen (g g ) - Từ tài liệu - ii -3 -1 , ta chọn giá trị OTR max =0.2 mol m s Ta có: OTR max = KtA C DO  CDO = 0,2/ 0,094 =2,128 mol m NTH: NHÓM -3 11 Thiết kế bể phản ứng - Mà CDO = µmax CX /YX/O - Lại có: q trình nuôi cấy gián đoạn 72h, suy : - µmax = 3,1 10 - Suy YX/O = µmax Cx /CDO = 3,1.10 -3 -1 h , CX = 111,11 mol m -3 -3 111,11= 0,34 g g -1 Tính tốc độ truyền oxi * Col : nồng độ oxi bão hòa Cols : nồng độ oxi hòa tan thời điểm KtA :khối lượng oxi lỏng chuyển hóa OTR (oxygen transfer rate) :tốc độ truyền oxi Ta có cơng thức: * OTR = KtA ( Col - Cols) i * Dựa vào tài liệu , giá trị Col áp suất bar 0,27 mol m -3 Lựa chọn Ps / Vt = 2000 W m v -2 KtA = 2,6.10 (Ps/Vt) 0,4 c 0.5 (vgs ) c gs -3 -1 = 0,03 m s , giá trị KtA tính sau: = 0,094 s -1 Nồng độ oxi thời điểm nhỏ nồng độ bão hòa oxi, nằm khoảng số -3 -3 -1 -3 mũ lũy thừa 0.1 mol m 0.01 mol m s , t chọn giá trị 0,1 mol m -3 -1 Vậy tốc độ truyền oxi OTR = 0,094 (0,27-0,1) =0,01598 mol m s Tính tốc độ sử dụng oxi tế bào OUR -3 -1 OUR (oxygen uptake rate (mol m s ) -4 Ta có: OUR = [2,78 10 (YX/S – 1.04).µ +ms] CX -6 -1 Mà: µ= 0.005 ms = 4,6.10 s Lại có: q trình ni cấy gián đoạn 72h, suy : -3 -3 CX = 111,11 mol m , YX/S= 0.375.10 g/g -4 -3 Suy : OUR= [2,78 10 (0,375.10 – 1,04) 0.005+ 4,6.10 -4 - -3 -1 ].111,11 =3.505.10 mol m s Nhận thấy, OUR