SỰ TÁI SINH TRONG IN VITRO CỦA HYPERICUM PREFORATUM L SỬ DỤNG THIDIAZUNRON VÀ PHÂN TÍCH ỔN ĐỊNH GENE TÁI SINH Arpita Banerjee, Subhendu Bandyopadhyay and Sarmistha Sen Raychaudhuri Plant Tissue Culture and Molecular Biology Laboratory Department of Biophysics, Molecular Biology and Bioinformatics University of Calcutta, Kolkata 700 009, India Received August 2010; revised 21 December 2010; accepted 12 February 2011 NỘI DUNG: Hypericum preforatum L Mục tiêu Vật liệu – phương pháp Kết Kết luận 1 Hypericum preforatum L • Hypericum preforatum L có khả chống vi rút, chống bị nhiễm, chống ung thư, chống suy nhược • Sống vùng có độ cao 1000 – 2500m 2 Mục tiêu  Khảo sát tác dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật trình tái sinh H preforatum  Đánh giá ổn định gen tái sinh phát triển có diện TDZ sử dụng RAPD PCR-PFLP 2 Phương pháp vật liệu  vật liệu: Trong tái sinh Vùng hạ diệp nuôi cấy môi trường MS với 3% sucrose từ hạt giống Trong phân tích ổn định gen Mô cô lập từ phần ngẫu nhiên mẹ 10 tái sinh môi trường MS bổ sung mg/l TDZ  Phương pháp:  TÁI SINH H.preforatum 1: MS + 1mg/l 2,4D + 1mg/l Kn 2: MS + 1mg/l 2,4D + 0,5mg/l Kn Tạo mô sẹo: 3: MS + 0,5mg/l 2,4D + 1mg/l Kn 4: MS + 0,5mg/l NAA + 1mg/l BAP 5: MS + 1mg/l NAA + 1mg/l BAP 6: MS + 1mg/l NAA + 0,5mg/l BAP Với lần lặp lại toàn thí nghiệm làm lần Sau lần cấy chuyền, mô sẹo chuyển sang môi trường tạo chồi Tạo chồi 1: MS +1mg/l TDZ 2: MS +1mg/l TDZ +1 mg/l IAA 3: MS +1mg/l BAP 4: MS +1mg/l BAP + mg/l IAA Nhiệt độ 25± 2oC, Tạo rễ 1: MS + mg/l IAA độ ẩm 55 ± 2% ánh sáng 2: MS + mg/l IAA cường độ 326108 mol/sm, 3: MS + mg/l IAA chiếu 16/8h sáng/ tối 4: MS + mg/l NAA 5: MS + mg/l NAA 6: MS + mg/l NAA  Trong phân tích ổn định gen: Phân tích đa hình kỹ thuật PCR-RAPD: 25µl {1x PCR dung dịch đệm, mM MgCl2, 0,2 mM hỗn hợp dNTP, 0,2 mM RADP primer 0,5 U Taq DNA polymerase 25 ng mẫu H preforatum } 94oC phút 94oC phút 36oC phút 72oC phút 45 chu kỳ 72oC phút Điện di agar 1.5 % x TAE đệm Và ethidium bromide làm thuốc nhộm phát huỳnh quang Phân tích ITS: Khuếch đại PCR 25 µl {dung dịch hỗn hợp đệm gồm 1x PCR phản ứng đệm, mM MgCl2, 0,1 mM hỗn hợp dNTP, mM primer 1.0 U Taq DNA polymerase 25 ng mẫu DNA } o 98 C phút o 94 C phút o 58 C 30 giây o 72 C phút 35 chu kỳ o 72 C phút Tinh chế PCR-Clean up kit Cắt enzyme (REs): EcoRV, ClaI HpaII Phân loại sản phẩm điện di gel Agar 2% với dòng điện 65V, phẩm màu ethidium bromide chụp ảnh lại Chọn vùng ITS mẹ tái sinh từ cảm ứng với mg/L TDZ nhân lên gắn vào • Chọn dòng nhân lên tiến hành tách chiết DNA plasmid • Xác định trình tự cách sử dụng máy phân tích trình tự tự động ABI3130 mồi M13 • vector pTZ57R / T cách sử dụng Ins T/Aclone TM PCR Cloning Kit biến nạp vào E.coli XL1- Nhân dòng trình tự vùng ITS: Blue 4 Kết quả:  Cây tái sinh in Vitro Tỷ lệ cytokinin/auxin cao ảnh hưởng đến tăng trưởng mô sẹo Tạo mô sẹo Tạo chồi TẠO RỄ Mô sẹo tăng trưởng cao quan sát môi trường có chứa 0,5 mg/ L 2,4-D mg/L Kn mg/l TDZ chứng minh PGR tốt số nồng độ để tạo chồi Tạo rể mg/l IAA nồng độ hiệu nhất, theo sau mg/l IAA  Nghiên cứu tính ổn định di truyền RAPD ( random aplified polymorphic DNA): kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA RFLP ( restriction fragment length polymorphism): kĩ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài đọan DNA dựa điểm cắt enzyme giới hạn Enzyme cắt giới hạn (REs) EcoRV, ClaI HpaII Vùng nrITS ( nuclear ribosomal internal transcribed spacer) ( bao gồm vùng ITS1, 5.8S ITS2) vùng gen dùng cho phân loại cấp loài chi loài cấp độ cao biến dị Mồi dùng cho RAPD : mồi xuôi 17SE (5’ ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC G 3’) mồi ngược 26SE (5’ TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C 3’) *Phản ứng khuếch đại RAPD 15 đoạn mồi RAPD sử dụng khuếch đại DNA mẹ tái sinh từ môi trường bổ sung mg/l TDZ chọn ngẫu nhiên * Phân tích ITS Toàn vùng nrITS,bao gồm ITS1, 5.8S ITS2, khuếch đại cách sử dụng mồi 17SE 26SE, đoạn có kích thước khoảng 930 bp Chiều dài vùng nrITS mẹ tái sinh so sánh không khác nhau(Hình b) Sử dụng PCR-RFLP để phân tích vùng nrITS Sử dụng enzyme cắt giới hạn: •EcoRV •HpaII • ClaI BLAST cho thấy tương đồng hai trình tự 99% Nucleotides từ hai mẫu cho thấy tương đồng gần hoàn hảo vùng ITS1 ITS2 trình phân tích trình tự CLUSTAL W (Hình a & b) Thảo luận: Sự điều hoà in vitro thực vật dẫn đến sinh sản vô tính đồng với kiểu hình kiệu gen mẹ Tuy nhiên, số trường hợp chất điều hoà thực vật tỏ lệch hướng so với mẹ gọi biến thể soma TDZ có vai trò tổng hợp polyphenyl urea cytokinin mạnh.Dưới ảnh hưởng cùa chất điều hoà sinh trưởng thực vật có số khả gây biến đổi di truyền tái sinh Vì nghiên cứu gần đây, DNA mẹ tái sinh nghiên cứu cách sử dụng phân tử đánh dấu kĩ thật RAPD PCR-RFLP Kĩ thuật RADP marker nghiên cứu biến dị DNA nuôi cấy tăng trưởng thực vật Vùng nrITS ( bao gồm vùng ITS1, 5.8S ITS2) vùng gen dùng cho phân loại cấp loài chí loài cấp độ cao biến dị nên sử dụng rộng rãi nghiên cứu biến dị chí loài gần Trong nghiên cứu nay, khuếch đại PCR-RFLP vùng nrITS mẹ tái sinh với enzyme cắt giới hạn EcoRV, ClaI HpaII, tạo chuỗi mẫu Phân tích chuỗi đa hình CLUSTAL W mẹ tái sinh cho thấy tính tương đồng vùng ITS1 ITS2 Kết luận Sử dụng kĩ thuật RAPD RFLP vùng nrITS cho thấy khác gen mẹ tái sinh Phân tích chuỗi đa hình CLUSTAL W cho thấy tương đông vùng ITS1 ITS2 mẹ tái sinh → Chứng minh bền DNA tái sinh Click Clickicon iconto toadd addpicture picture Tài liệu tham khảo: Arpita B, Subhendu B & Sarmistha S R, 2011 In vitro regeneration of Hypericum perforatum L using thidiazuron and analysis of genetic stability of regenerants Cám ơn thầy bạn theo dõi The end  ... vector pTZ57R / T cách sử dụng Ins T/Aclone TM PCR Cloning Kit biến nạp vào E.coli XL1- Nhân dòng trình tự vùng ITS: Blue 4 Kết quả:  Cây tái sinh in Vitro Tỷ l cytokinin/auxin cao ảnh hưởng đến... tác dụng chất điều hòa tăng trưởng thực vật trình tái sinh H preforatum  Đánh giá ổn định gen tái sinh phát triển có diện TDZ sử dụng RAPD PCR-PFLP 2 Phương pháp vật liệu  vật liệu: Trong tái. .. ClaI HpaII, tạo chuỗi mẫu Phân tích chuỗi đa hình CLUSTAL W mẹ tái sinh cho thấy tính tương đồng vùng ITS1 ITS2 Kết luận Sử dụng kĩ thuật RAPD RFLP vùng nrITS cho thấy khác gen mẹ tái sinh Phân